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Articles by Eugene V. Mosharov in JoVE
JoVE General
個々のシナプス前終末でのドーパミン放出はFFNsと可視化
1Departments of Neurology, Columbia University, 2Departments of Psychiatry and Pharmacology, Columbia University, 3Department of Chemistry, Columbia University, 4eMolecules, Inc., 5Departments of Neurology and Physiology, University of California School of Medicine, San Francisco, 6Division of Molecular Therapeutics, New York Psychiatric Institute
光学的に蛍光ドーパミンの類似体を用いて神経伝達を測定するための新しい手段。
Other articles by Eugene V. Mosharov on PubMed
細胞内のパッチの電気化学: ゾル性細胞質中のカテコールアミン髄質細胞の規制。
ゾル性細胞質のプールの変更については、直接神経伝達物質の合成と放出に影響を与えるし、様々 な神経変性疾患において重要な要因を提案します。このゾル性細胞質のプールは最も代謝ですがアクティブ、それが小胞のトランスミッタの量と比較して非常に小さいですおよび別に定量化されて決して。ここでは、細胞内のパッチ電気化学 （IPE） は初めて単一哺乳類細胞における細胞内酸化分子の直接測定を提供する技術を紹介します。繰返しのボルタンメトリー モードでは、それは優先的カテコールアミン測定に対しアンペロ メトリック モードでは、合計カテコール IPE を検出します。培養の髄質細胞の合計サイトゾル カテコール濃度が約 10% カテコールアミンされた、50-500 microm だった。レセルピン, 小胞モノアミン トランスポーター阻害薬、カテコールアミン プール上の効果がなかったが合計カテコールによってを 4 倍に増加する 5 倍。モノアミン酸化酵素阻害薬、pargyline とを組み合わせたレセルピン カテコールアミン濃度は細胞質で約 6 倍増加。アンフェタミン過渡ゾル性細胞質のカテコールアミンの約 5 倍蓄積と遅い増加総カテコールの誘導。3, 4-ジヒドロキシ-フェニルアラニン (L-DOPA) 培養細胞におけるカテコールアミンによって約 2.5 倍増加し、合計カテコール類が約 4 倍増します。ゾル性細胞質のカテコールアミン コントロール レベルに返される < または合計カテコール L DOPA 自由媒体の 1.5 時間インキュベーション後約 2 倍も高架に残った一方 L-DOPA 撤退後 = 10 分。私たちのデータ ゾル性細胞質のカテコールアミンが厳密に定義されたレベルでは、維持される薬剤濃度の増加 DOPAC、3, 4-dihydroxyphenylethyleneglycol などの他のカテコールアミン誘導体の蓄積につながることを示します。これらの誘導体は細胞質内治療後の時間に存在し、細胞毒性薬剤関連の原因があります。
ドーパミン産生ニューロン送信機ちらつき融合細孔を介してリリースします。
神経伝達物質放出の理解メカニズムのキーの質問は、かどうかシナプス小胞の融合細孔中エキソサイトーシス リリース トランスミッタの量を調節します。小さなシナプス小胞炭素繊維した電流測定法による培養ラット腹側中脳神経細胞からのドーパミン放出を測定しました。私たちのデータには、小さなシナプス小胞の融合孔がちらつきを 1 回または複数回の矢継ぎ早にそれぞれの小胞のドパミンの約 25-30% を解放するちらつきを示します。複数のちらつきとのイベントの発生率は相互フォルボールエステルとスタウロスポリンによって規制されていました。したがって、ドーパミン産生ニューロンによって小さなシナプス小胞融合細孔がちらつく分泌イベントごとの数を制御することによってリリース神経伝達物質の量を調節します。このモードのエキソサイトーシス whereby ニューロンは急速にリサイクルの比較的遅いプロセスを経ることがなく小胞をリユースすることができます潜在的なメカニズムです。
スネアは、完全な融合と Hemifusion 代替結果として昇格できます。
セル融合の試金、ここことに加えて完全な融合を示すを使用するスネアも別の結果として hemifusion を促進します。イベントの約 65 ％ の完全融合と残りの 35 ％ hemifusion の結果;それらの約 3 分の 2 永久、約三分の一が可逆的だった。我々 は、この成果の中で比較的近くのバランス、スネアに調節タンパク質の結合によって完全融合と可逆的なキス-実行様イベント間の動的の生理的調節可能チップソー必要可能性があることを予測します。
した電流測定法によって記録されたイベントを分泌の解析。
した電流測定法はエキソサイトーシスの神経伝達物質とホルモン種々 の細胞の研究に広く用いられます。個別分泌小胞の融合中にリリース モノアミン分子の酸化に由来するアンペロ メトリック スパイクの形状分析刺激依存伝達物質放出に関与する分子の手順に関する情報を提供します。ここで我々 アンペロ メトリック信号処理の方法論の概要を提示、形状特性、および （iii） データ操作と統計解析 (i) アンペロ メトリック信号集録を含むとフィルタ リング、（ii） 分泌イベントの検出と決定をスパイクします。このレビューの目的は、分泌活性のアンペロ メトリック録音を実行し、個々 のリリース イベントの形状特性に基づいて結果を解釈するための実用的なガイドラインを提供することです。
Α-シヌクレインの過剰発現細胞質カテコールアミン濃度が増加します。
ドーパミンの恒常性の調節不全とトランスミッターのゾル性細胞質レベルの標高は、脆弱性パーキンソン病におけるカテコラミン作動性ニューロンの根底にあると提案されています。パーキンソン病の親族呼称 α シヌクレインまたは野生型 （WT） 蛋白の過剰発現のいくつかの既知の変異を引き起こすので、我々 は α-シヌクレインの病因とドーパミンの恒常性の間の可能なリンクを調べた。A30P α-シヌクレイン大幅に表示ノザン トランスジェニック マウスから分離したクロム親和性細胞による細胞内パッチ電気化学測定のゾル性細胞質のカテコールアミン濃度増加、WT 蛋白質とそれらから過剰細胞ノックアウトに対し動物はコントロールとは異なりされていません。同様に、カテコール濃度 L-DOPA チャレンジ後低ゾル性細胞質のドーパミンのレベルを維持するために細胞の能力は、どちらの蛋白質によって著しく阻害されたが過剰の A30P または A53T と α シヌクレイン WT を表現する比較 L DOPA 扱わ PC12 細胞における高いだった。またインキュベーション WT、A30P、または A53T α-シヌクレインの低マイクロモル濃度と pH 勾配分離髄質小胞の ATP 依存性維持を阻害することと WT タンパク質が大幅に少ない強力な誘導プロトン漏れだった. します。要約すると、水疱性 pH α-シヌクレインのさまざまな種類の過剰発現を乱すし、トリガー セルラー oxyradical 損傷レベルのゾル性細胞質のカテコール種で可能性があります効果の著しい増加につながる有効にを示しています。複数の分子メカニズム ゾル性細胞質のカテコールアミンの恒常性の摂動のために責任があるかもしれないが、この研究は α-シヌクレインかもしれないその細胞毒性を発揮し、カテコラミン含有細胞の損傷を選択的にする方法に関する重要な証拠を提供します。
Α-シヌクレインのドーパミン変更オートファジーのシャペロンを介したブロックします。
Α-シヌクレイン (アルファ syn) の変質の劣化は、パーキンソン病 (PD) の病因に関与しています。我々 はそのアルファ syn オートファジー シャペロンを介した （CMA） ゾル性細胞質蛋白質の分解のための選択的ライソゾーム メカニズムを介して低下することができますを示しています。アルファ syn の病原性変異株ライソゾーム転座が自分と一緒に他の CMA 基板の劣化を損なうブロックします。病原性アルファ syn の突然変異はまれですが、アルファ syn へゾル性細胞質凝集体討を用いたマウスの腹内側ニューロンの文化のほとんどの形態で、文化と分離されたマウス リソソームの SH SY5Y セルの蓄積性が根底にある可能性があります修飾を受ける、私たちこれら修飾アルファ syn のほとんどはこの CMA による蛋白質の分解を損なうが、他の基板の劣化には影響しませんを発見しました。ドーパミン変更アルファ-syn、しかし、単に不十分 CMA によって劣化しない、他の基板の劣化にもこの経路によってブロックします。CMA の閉塞細胞脆弱性ストレスになるにつれて、ドーパミン autophagic 抑制 PD ドーパミン作動性ニューロンの選択的変性を説明できることを提案する.
解析した電流測定法によって記録されたシングル小胞分泌イベントの。
分析の個別分泌小胞の融合中にリリース モノアミン分子の酸化に由来するアンペロ メトリック スパイク状の刺激依存伝達物質放出の分子手順に関する貴重なデータを提供します。した電流測定法の感度および放出確率 (ベシクル可用性と融合機械 Ca(+2)) への感度。 細胞内トランスミッタ恒常性 （合成、分解、再取り込み等） に関する情報を与える個々 の小胞からリリース モノアミンの検出が可能します。さらに、した電流測定法の時間分解能のモノアミン放出のリアルタイムの動態観察エキソサイトーシス時ことができます。ここでは、スパイク パラメーターのレコーディングと異なるサンプリング レート、信号とノイズのレベル、スパイク期間に一貫性のある決定を協議するルーチンに重点を置いてアンペロ メトリック信号と周囲の信号のコンピューター分析のアルゴリズムを提供します。
分泌小胞は Hyperacidification をリバウンドし、長引くメタンフェタミン暴露から生じる素量サイズを増大します。
アンフェタミン (AMPHs) 急性暴露融合イベント中カテコールアミン放出の素量サイズを減らしながらゾル性細胞質のカテコールアミン濃度が増加分泌小胞 pH 勾配を折りたたみます。ただし、AMPH とメタンフェタミン （メタ） 組織に長期間にわたって保持されます。我々 は光使用し、電子顕微鏡プローブ分泌小胞 pH とした電流測定法と髄質細胞培養ラットで惹かとサイトゾル カテコールアミンの影響を観察する細胞内のパッチの電気化学 METH の長期暴露の影響を測定します。急性の覚醒効果とは対照的濃度依存リバウンド hyperacidification 分泌小胞 6-48 h 10 microM と高い濃度で薬剤への露出を生産しました。5-10 MicroM レベルで長引く METH 素量サイズを増大し、復活カテコールアミン分泌のリリースは、非常に高いが （目 100 microM) レベルのリバウンド hyperacidification を生成するために継続しながら、麻薬は素量サイズ増加しませんでした。分泌小胞リバウンド hyperacidification の温度の最適の応答で約 37 度 C に依存していた、転写の阻害剤で妨げられなかったピューロマイシンとへの長期暴露と membranophilic 弱塩基、AMPHs、メチルフェニ デート、コカイン、アンモニアなどの一般的な代償的な応答が表示されます。したがって、長時間露出のいくつかの条件下では、AMPHs と弱塩基の他を強化、なくできますベシクルの酸性化に伴う補償応答を介してカテコールアミンの小胞のリリースを破壊します。
細胞内ドーパミン、カルシウムと α-シヌクレイン黒質ニューロンの選択的死の原因の間に相互作用します。
神経変性疾患での特定の神経細胞集団の選択的な死のための基礎は不明であります。腹側被蓋野 (VTA) のニューロンを免れているに対しパーキンソン病 (PD) (SN) の中脳におけるドーパミンニューロンの優遇損失によって特徴付けられる synucleinopathy です。ゾル性細胞質のドーパミンを直接測定する電気化学細胞内のパッチを使用して (DA(cyt)) 培養中脳ニューロンでは昇格した DA(cyt) およびその代謝産物が神経毒性であることと DA(cyt) を減少させる遺伝的および薬理学的介入が神経保護を提供することを確認します。L-DOPA の DA(cyt) SN ニューロン レベル 2-3 倍に増加 VTA ニューロン応答 SN ニューロンにおける大きい感受性 L DOPA 誘発神経毒性に起因ジヒドロピリジン感受性 ca 2 + チャネルに依存するよりも高い。Α-シヌクレイン欠けてドーパミンニューロン L DOPA による細胞死に抵抗力があったが DA(cyt) α-シヌクレインの削除によって変更されなかった。したがって、ca 2 +、DA(cyt) と α-シヌクレインの相互作用複数の治療上のターゲットを示唆 PD における SN ニューロンの感受性の根底にある可能性があります。
蛍光偽神経伝達物質は、個々のシナプス前終末からのドーパミン放出を可視化
神経系は、シナプス小胞の融合の間に神経伝達物質の放出を介してニューロン間の信号を送信する。直接個々のシナプス前終末から神経伝達物質の取り込みと放出を観察するために、我々はシナプス小胞モノアミントランスポーターの基質として蛍光偽の神経伝達物質を設計しました。線条体のイメージドーパミン放出にこれらのプローブを使用して、我々はシナプス可塑性に関連するいくつかの観測を行った。我々は、刺激ごとに神経伝達物質を放出するシナプス小胞の割合は刺激周波数に依存していたことがわかった。動力学的に異なる "予約"シナプス小胞の人口は、これらの実験条件下で観察されなかった。シナプス前終末の周波数依存性の不均一性は、シナプスの選択の周波数に依存するコーディングのためのメカニズムを示し、D2ドーパミン受容体に部分的に依存していたことが明らかになった。
