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신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans


JoVE 2686 6/06/2011

1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University, 2Macromolecular Therapeutics Development Facility, Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University, 3Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University

zebrafish 배아에서 alkyne - 태그 glycans의 급속한, 비침 투, 그리고 강력한 라벨을 허용 클릭 화학 기반 방법을 설명합니다. 후반 gastrulation 단계에 zebrafish 배아의 뒤덮었 레이어 Fucosylated glycans이 연구에서 몇 군데 있었다.

Other articles by Florence Marlow on PubMed

Zebrafish로 키 니 아 제 2 행위 하류 셀 극성 및 효과적인 융합과 확장 움직임을 중재 하는 Wnt11

척추 gastrulation 융합과 확장 (CE), 동안 좁은 움직임과 배아 조직 길게. Xenopus 및 zebrafish 비정규 Wnt 신호 통로 Drosophila 평면 셀 극성 통로를 척추 부 본을 구성 하 고 CE를 기본 입장 셀 양극 화를 조절. 정상적인 CE에 필요한 여러 가지 신호 분자 식별에도 불구 하 고 개별 셀 동작 CE 운전 규제 다운스트림 트랜스듀서는만 해명 될 시작 합니다. 또한, 결함이 있는 입장 셀 극성에 영향을 줍니다 방법 CE 이해 되지 않습니다.

Zebrafish 삼엽충 Gastrulation과 신경 움직임 Strabismus에 대 한 새로운 역할을 식별합니다

배아 morphogenesis 셀 행동, 협조 모양 변경, 개별 셀 마이그레이션, 누구의 분자 결정 요인 크게 알려지지 않은, 셀룰러 재배열 등의 제품군에 의해 구동 됩니다. Zebrafish 대 니 rerio에서에서 삼엽충 돌연변이 배아 gastrulation 움직임과 hindbrain 뉴런의 후부 마이그레이션에 결함이 있다. 여기, 우리가 사용 위치 복제 삼엽충 돌연변이 방해 막 횡단 단백질 Strabismus (Stbm)을 입증 하 / 반 고흐 (Vang) 이전에 Drosophila melanogaster 주치의 정식 Wnt/베타-catenin에 평면 셀 극성 (PCP)와 관련 된 척추 동물에서 신호. 우리의 유전 및 분자 분석을 gastrulation, 동안 삼엽충 상호 작용 주치의 통로 정식 Wnt 신호 전달에 영향을 주지 않고 주장 한다. 또한, 삼엽충 주치의 분자 별도로 신경 마이그레이션을 조절할 수 있습니다. 우리는 삼엽충 중재 고유 운동 행동의 양극 화 현상이 보여 줍니다. Gastrulation 융합과 확장 운동을 하는 동안 삼엽충 입장 셀 극성 기본 효과적인 윤 및 감독된 등 마이그레이션 속도 증가에서 조절 합니다. Hindbrain에 삼엽충 후부 rhombomeres로 branchiomotor 신경 세포의 효과적인 마이그레이션을 제어합니다. 모자이크 분석 보여줍니다 삼엽충 함수 셀 자율적으로 하 고 비 자율적으로 gastrulae는 hindbrain에. 삼엽충/Stbm 척추 embryogenesis 동안 뚜렷한 움직임에 방향을 부여 하는 세포 상호 작용을 중재 제안 한다.

아무 꼬리 정식이 아닌 Wnt 신호 Zebrafish의 후부 몸 Morphogenesis 규제와 공동

척추 후부 몸은 머리와 앞쪽에 트렁크와 후부 특정 셀 동작 모양 gastrulation 움직임의 조합에 의해 형성 된다. 여기, 우리가 조절 하는 유전자 gastrulation 동안 움직임을 휴대 여부 조사 [없고 꼬리 (ntl) / brachyury, knypek (kny) 및 pipetail (ppt) / wnt5] 후부 몸 morphogenesis 조절 작용. 두 kny; ntl ppt; ntl 이중 돌연변이 배아 전시 시너지 트렁크와 테일 초기 세분화 하 여 단축. 복합 돌연변이 유전자 식 분석 anteroposterior 세균 층 패터 닝은 크게 일반 꼬리 신장 결함 지정 하거나 후부 조직을 유지 하는 실패 하지 않습니다 나타냅니다. 또한, ntl ppt와 synergistically 후부 식 뼈 전체적 단백질 4 (bmp4)을 인코딩 하는 유전자의 조절 하는 kny 아닌 다른 알려진된 T-박스 유전자, 섬유 아 세포 성장 인자 유전자 또는 꼬리 유전자의 상호 작용 합니다. 시험 mitotic apoptotic 세포 나타냅니다 장애인된 꼬리 신장 감소 세포 증식 또는 증가 된 세포의 죽음으로 인해 단순히 아니다. 셀 ntl 돌연변이 ppt; ntl 및 kny;에서 추적 복 부 파생된 후부 tailbud progenitors를 tailbud로 이동 한 보여 줍니다. 그러나 gastrulation 같은 융합과 확장 운동 및 후부 tailbud 내에서 셀 운동 장애가 있습니다. Kny; ntl 및 ppt;에 mesendoderm로 셀 subduction 움직임 줄일 수 있습니다 또한, ntl 돌연변이. 우리 후부 바디 개발 규제를 병렬, 부분적으로 중복 경로에서 Ppt 및 Kny 함수는 Ntl과 정식이 아닌 Wnt 경로 구성 요소 제안 합니다. 우리의 일 후부 몸 morphogenesis의 유전 해 부를 시작 하 고 유전자 특정 꼬리를 형성 움직임에 연결. 또한, 우리 꼬리 개발 메커니즘 메커니즘 후부 본문에 함께 gastrulation 규제의 지속 수반 개념에 대 한 유전자 증거를 제공 합니다.

Zebrafish 원시 생식 세포의 마이그레이션: Myosin 수축과 세포질 흐름에 대 한 역할

세포의 운동 성 및 감독된 마이그레이션 응답는 chemokine로 통치 분자 및 세포 메커니즘 자위대 1 크게 알려지지 않은.입니다. 여기, zebrafish 원시 생식 세포의 마이그레이션 자위대-1에 의해 유도 세포질의 흐름에 의해 강화 되는 bleb 같은 돌출 생성 보여 줍니다. 돌출 사이트 활성화 myosin 수축 발생 합니다 무료 칼슘의 높은 수준에서 형성 된다. 이 사이트에 플라즈마 막에서 acto myosin 피 질의 분리 형성 bleb으로 세포질의 흐름 옵니다. 우리는 수용 체의 편광된 활성화 CXCR4 차례로 활성화 myosin 수축 리간드 자위대 1의 상부에 응답 하는 셀의 일부 무료 칼슘에서 상승 리드 제안 합니다. 자위대-1에 대 한 응답에서 셀의 특정 지역에 새로운 돌출의 편견된 형성 앞 가장자리와 셀 이동 방향을 정의합니다.

버 키 볼 Balbiani Body 어셈블리 및 동물 식물성 극성 Zebrafish Oocyte 및 여 포 세포 층에서 함수

Balbiani 몸은 인간을 포함 한 검사, 모든 동물의 초기 oocytes에 organelles의 진화 적으로 보존된 비대칭 집계. 150 여 년 전 먼저 확인, 유전자 Balbiani 바디의 조립 행동 하지는 척추에서 확인 되었습니다. 여기 우리는 zebrafish 버 키 볼 진이 보편적인 집계 organelles의 조립 하는 데 필요한는 보여준다. 버 키 볼은 Balbiani의 부재에서 바디 폼, 실패 하 고 식물성 mRNAs oocytes에서 지역화 되지 않은. 반면, 동물 극 화 된 oocyte 마커는 버 키 볼 돌연변이 식물 영역으로 확장 하지만 확장 된 동물 극에서 패턴화도 그대로 유지 됩니다. 흥미롭게도, 버 키 볼 돌연변이 oocyte 둘러싼 체세포 여 포 셀 계층 내에서 셀의 과도 한 수 micropylar 세포, 동물 극 특정 셀 운명으로 개발. 단일 micropyle 정자 zebrafish의 계란을 비 옥을 허용 합니다. 버 키 볼 돌연변이 초과 micropyles polyspermy 인해. 따라서 버 키 볼을 척추에 Balbiani 바디 형성에 첫 번째 유전자 액세스를 제공합니다. 우리는 버 키 볼 보여 초기 oogenesis oocyte, 미래의 계란 및 태아의 극성을 조절 하는 동안 기능. 마지막으로, oocytes 및 체세포 여 포 세포에서 동물 id 확장 체세포의 운명과 oocyte 극성은 상호 의존적인 나왔다.

Tbx2b는 자외선 포토 리셉터 셀 사양 Zebrafish 망막 개발 하는 동안 필요 합니다

척추 막대 및 원뿔 대뇌 빛 신경 시스템의 화학적, 전기적 신호로 transduce 고도로 전문화 된 감각 신경은. 콘와 봉의 생리 적 속성은 잘 알려진, 포토 리셉터 하위 사양 조절만 소수의 유전자가 확인 되었습니다. Zebrafish의 대뇌의 모자이크 조직을 이용 우리 보고 포토 리셉터 세포 운명에 독특한 변화에 따른 돌연변이의 분리. 봉 제비 (lor) 로커 스의 돌연변이 봉으로 UV 콘 선구자의 근처 하나에 대 한 변환 결과. 변형 된 세포 형태학 특성 그리고 막대의 전형적인 유전자 발현 패턴을 전시 하지만 시간적 및 공간적 패턴 일치 UV 콘 개발에에서 차별화. 돌연변이 애벌레와 성인에서 고도로 정렬 된 포토 리셉터 모자이크 유지 되 고 변성 하지 관찰 그 lor 제안 후 다른 포토 리셉터 하위 유형 지정 기능. 유전 chimeras, 포토 리셉터 세포 운명의 사양에 셀 자율적으로 lor 기능. 연계 분석 및 유전자 보완성 테스트 그 lor는 tbx2b/fby (에서 넘어)의 대립을 나타냅니다. fby는 뇌의 복잡 한 형에 의해 식별 되 고 tbx2b 전사 인자 T 기본 도메인 넌센스 돌연변이. Fby homozygous 돌연변이 애벌레와 lor/fby transheterozygotes 봉 제비 형을 표시할 수도 있습니다. 이러한 데이터를 기반으로, 우리 막대 차별화 통로 억압 하 여 UV 콘 운명 홍보 포토 리셉터 세포 선구자에 tbx2b에 대 한 이전에 undescribed 함수를 제안 합니다.

버 키 볼 Zebrafish의 세균 혈장 어셈블리를 구성합니다

많은 동물에서 embryogenesis 동안 생식 체 형성 되 나 세균 혈장 모성 세포질 결정 요인으로 지정 됩니다. Oogenesis, 하는 동안 세균 혈장 초파리 또는 organelles 또한 포유 동물에서 발견의 집계 Balbiani 신체 극 혈장 등 뚜렷한 세포의 구조를 형성 한다. 그러나, 척추 동물, 세균 혈장 어셈블리의 키 레 귤 레이 터 크게 알려지지 않은.입니다. 여기, 버 키 볼 (buc) 돌연변이 세균 혈장 결함 Buc 주로 Balbiani 바디 형성 제어를 나타내는 극성 손실을 앞, zebrafish oogenesis의 시작 부분에서 살펴보겠습니다. 또한, 우리는 분자로 독점적으로 단위로 소설, 동적 mRNA 지역화 패턴으로 난소 먼저 감지 Balbiani 본문 buc 유전자 식별. 우리는 Buc GFP 융해 Balbiani 몸에 세균 혈장과 oogenesis 중 초기 embryogenesis, 일관성 세균 혈장 형성에 역할을 하는 동안 localizes 찾으십시오. 흥미롭게도, overexpression buc의 zebrafish 태아에 있는 소성 세균 세포 생성 것으로 보인다. Buc homologs 포유류를 포함 하 여 많은 척추 동물 게놈에서 발견 하기 때문에 이러한 결과 필요 하 고 척추 동물에서 배아 혈장 조직에 대 한 충분 한 첫 번째 유전자 buc를 식별 합니다.

HnRNP 내가 원인 계란 Zebrafish의 활성화 Ca2 + 신호를 생성 하는 데 필요한

계란 활성화 polyspermy 및 시작 된 접합 자 개발을 방지 하는 데 필요한 중요 한 셀룰러 이벤트입니다. 모든 동물 시험에서 계란 활성화는 상승의 수정에서 계란 cytosol 무료 ca(2+)에 의해 elicited. Ca(2+) 상승이 대뇌 피 질과 립 exocytosis polyspermy를 방지 하기 위해 vitelline 멤브레인을 수정 하는 등의 모든 후속 계란 활성화 단계에 대 한 결정적 이다. Cytosolic Ca(2+) 증가 주로 inositol 1,4,5 trisphosphate (IP(3))에 의해 시작-Ca(2+) 출시 endoplasmic 그물에서 중재. (3) IP 조절에 관련 된 유전자-계란 활성화 하는 동안 중재 Ca(2+) 릴리스 크게 알려지지 않은 남아 있다. 여기 우리가 zebrafish 모성 효과 돌연변이 대 한 보고서 cytosolic Ca(2+) 상승에 결함이 고 후속 브롬 뼈 계란 대뇌 피 질과 립 exocytosis 세포질 분리를 포함 하는 활성화 이벤트. 우리 계란 활성화 결함 브롬 뼈에 제공 하는 Ca(2+) 또는 Ca(2+) 릴리스 메신저 IP(3), 브롬 뼈 IP (3)의 레 귤 레이 터는 제안에 의해 구출 될 수 표시-중재 Ca(2+) 릴리스 수정. 흥미롭게도, 브롬 뼈 돌연변이 배아도 지 축 형성을 위한 중요 한 것으로 알려진 비 조직된 대뇌 피 질의 microtubule 네트워크와 함께 dorsoventral 축 형성에 결함을 표시 합니다. 우리 장애인된 microtubule 조직은 이전에 그 활성화 결함에서 대뇌 피 질과 립 비 exocytosed와 관련 된 증거를 제공 합니다. 밝혀 위치 브롬 뼈 유전자의 클로닝 hnRNP 인코딩 유전자에서 조 정지 codon 나 (라고 여기 hnrnp 나) 기초가 되는 이상. 우리의 연구는 따라서 hnrnp의 중요 한 새로운 역할 공개 IP (3)의 기본 과정을 규제에 나-Ca(2+) 출시에 그 활성화에 중재.

Syntabulin, 모터 단백질 링커 제어 지 결정 합니다

양서류 teleost 배아에 지 결정 요인 (DDs) 식물성 극 지역화 초기 것으로 추정 되며 후 microtubule 배열에 따라 태아의 장래 등 쪽으로 이송. Dds는 정식 Wnt 경로 활성화 하 고 따라서 홍보 지 주최자를 유발 하는 유전자의 표현으로 알려져 있습니다. 여기, 모성 효과 ventralized 돌연변이 tokkaebi의 장소를 식별 하 여 그 보여 Syntabulin, 난 모터 kinesin 링커 단백질, zebrafish 등 확인을 위해 필수적 이다. 버 키 볼 (Buc)를 통해 oogenesis 동안 mRNA 식물성 극 이송 그 syntabulin를 찾았습니다-동물 식물 (AV) oocyte 극성의 설립에 필요한 중재 Balbiani 바디 종속 통로. Syntabulin microtubule 종속적인 방식으로 식물성 극에서 translocated은 보여 줍니다. 우리의 연구 결과 Syntabulin는 DDs microtubule 종속 운송을 규제 하 고 AV와 dorsoventral 축 형성 사이의 연결에 대 한 증거를 제공 것이 좋습니다.

Microtubule 말라 가교 요소 1 Balbiani 몸과 Zebrafish Oocyte 동물 식물성 극성을 조절

비록 개발 생물학에서 근본적인 중요성의 분극 척추 oocyte와 달걀 이벤트를 깨고 대칭에 대 한 유전적으로 크게 알려져 있습니다. 척추 동물에는 oocyte에서 첫 번째 형태학 비대칭 Balbiani 몸은, 고도로 보존, 일시적인 구조 척추 동물 및 무척 추 동물, 초파리, Xenopus, 인간을 포함 한 마우스. 우리 보고는 식별 된 zebrafish의 전시 소설 마젤란 (mgn) 돌연변이 확대 Balbiani 바디 형와 oocyte 극성 장애. Mgn 유전자의 분자 id를 확인 하려면 우리 positionally 복제 유전자를 대상으로 대규모 병렬 시퀀싱 600 kb의 지역별 genomic DNA를 소설 DNA 캡처 방법을 채용. 이 기술을 사용 하 여, 우리의 변이 1 주일 이내에 연결 하는 게놈 영역에 대 한 풍부 하 고 대규모 병렬 시퀀스를 사용 하 여 mgn에 돌연변이 확인 할 수 있었습니다. 이 돌연변이 형와 관련 된 유전자의 분자 식별 하 대규모 병렬 시퀀싱과 결합 하는 genomic DNA 농축의 첫번째 성공적인 사용 중 하나입니다. 우리는 이러한 기술 조합 모든 생물의 돌연변이 유전자의 효율적인 식별에 대 한 광범위 한 적용 해야한다 예상. Zebrafish microtubule 말라 가교의 코딩 시퀀스에서 삭제 요소 1 (macf1) 유전자로 돌연변이 mgn에 파악. macf1 신경 같은 편광된 세포, 근육 세포 및 상피 세포에서 다양 한 역할을 재생할 수 있는 cytoskeletal 링커 단백질의 높은 보존된 spectraplakin 가족의 구성원입니다. Mgn 돌연변이 oocyte 핵 mislocalized입니다; Balbiani 바디, 지역화 된 mRNAs 및 organelles은 결 석의 핵 정박 및 대뇌 피 질의 지역화에 macf1에 대 한 기능을 가진 일관 된 oocyte 주변에서. 이러한 데이터 spectraplakins 척추 oocyte와 달걀의 양극 화에 대 한 역할에 대 한 첫 번째 증거를 제공합니다.

Glycans의 생체 조건 화상 진 찰에 대 한 생체 Copper(I) 촉매

Cu (I)-촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition (CuAAC)는 bioorthogonal 활용에 대 한 표준 방법. 그러나, 현재 Cu(I) 카 탈 리스트 공식 살아있는 시스템에서의 사용을 방해 하는 독성이 있다. 여기 우리가 명백한 독성 없는 생활 시스템에서 BTTES, 아민 기반 리간드 Cu(I), 트리 스 (triazolylmethyl) cycloaddition 반응을 빠르게 촉진을 보고. 이 촉매 수, 처음으로 비 침 투 zebrafish 초기 embryogenesis 중 fucosylated glycans의 영상. 우리 microinjected alkyne-베어링 GDP fucose 1 셀 단계에서 배아와 metabolically 법인된 부자연 스러운 설탕은 생체를 사용 하 여 화학을 클릭 검색. 레이블이 지정 된 glycans blastula 초기 애벌레 단계 사이 zebrafish 태아의 무기력 계층에서 이미지를 만들 수 있습니다. 이 새로운 방법은 biomolecules 살아있는 유기 체에서의 급속 한, 비 침 투 적인 이미징에 대 한 길을 불법 체류자.

세포 표면 Glycans in Vivo에서 N Acetyllactosamine을 추적 합니다

Bioconjugation에 대 한 반응 Bioorthogonal 클릭의 효능을 증가: 비교 연구

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