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Articles by Frederick A. Dick in JoVE

 JoVE Biology

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

1Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2London Regional Cancer Program, Children's Health Research Institute, and Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario


JoVE 3491

Determinare la posizione del ciclo cellulare di una popolazione di cellule, o la comprensione di come i segnali influenzano la proliferazione, può essere facilmente misurato mediante citometria di flusso utilizzando questo protocollo. Riportiamo un semplice approccio sperimentale alla colorazione delle cellule e quantificare la loro posizione nel ciclo cellulare.

Other articles by Frederick A. Dick on PubMed

Tre Regioni Del Dominio Tasca PRB Influisce Sulla Sua Inattivazione Da Papillomavirus Umano Le Proteine E7

Un evento critico nella trasformazione di papillomavirus di cellule umane è l'inattivazione del pRB dalla proteina E7. E7, come molti altri oncoproteins virale, possiede un motivo di peptide LXCXE ben caratterizzato che interagisce con il dominio della tasca del pRB. Interruzione dell'associazione LXCXE-schisi su pRB lo rende resistente all'inattivazione e associazione E7. Tale associazione schisi mutanti di pRB sono capaci di indurre un arresto g (1) nella linea di cellule HeLa trasformato 18 papillomavirus umano. Mostriamo qui che l'inattivazione efficiente di pRB in cellule HeLa non semplicemente dipende l'integrità della fessura LXCXE-associazione. Più mutanti sito-regia che alterano le superfici conservate del dominio tasca pRB causano cellule HeLa ad accumulare in g (1). Dividiamo questi mutanti in due classi: quelli che possono essere legati da E7 e quelli che non possono. I mutanti interagenti E7 includono cambiamenti in residui conservati che si trovano in un solco tra la A e la B metà della tasca. Sorprendentemente, nessuno di questi mutanti mostrano un chiaro difetto in uno qualsiasi dei meccanismi conosciuti per inattivazione pRB di E7. Analisi di mutanti che sono compromessi per E7 associazione rivelano che questa interazione dipende dalla fessura LXCXE-associazione e un gruppo conservato di Lisine adiacente la schisi. Questi amminoacidi basici su pRB definire un punto di interazione discreti con E7. Questi residui più probabile forma ionica interazioni con conservate amminoacidi acidi su E7 poiché un'interazione pRB/E7 stabile è stato restaurato quando i residui di lisina su pRB e i residui acidi su E7 sono stati scambiati.

PRB Contiene Un Dominio Di Associazione E2F1 Specifico Che Permette Di Apoptosi Indotta Da E2F1 Essere Regolato Separatamente Dalle Altre Attività E2F

L'interazione tra pRB ed E2F è fondamentale per il controllo del ciclo cellulare e apoptosi. Qui riportiamo che quello pRB contiene due siti di legame E2F distinti. Il sito di legame di E2F precedentemente identificato su pRB è necessario per associazione stabile con E2Fs sul DNA. Un secondo sito di interazione E2F è specifico per E2F1 e si trova interamente all'interno del dominio C-terminale del pRB. Complessi E2F1/pRB formate attraverso questo sito hanno bassa affinità per il DNA, ma l'interazione è sufficiente per pRB per regolare l'apoptosi indotta da E2F1 ed E2F1 perde la capacità di interagire con questo sito seguendo il danno al DNA. Questi risultati mostrano che pRB interagisce con proteine E2F individuali in modi diversi e suggeriscono che il regolamento di pRB di apoptosi indotta da E2F1 è fisicamente separabile dal relativo controllo di transcriptional di altre proteine E2F.

La Proteina Del Retinoblastoma Regola Pericentrica Eterocromatina

La proteina del retinoblastoma (pRb) è stato proposto di regolare progressione del ciclo cellulare in parte attraverso la sua capacità di interagire con gli enzimi che modificare code dell'istone e creano una struttura della cromatina repressa. Abbiamo creato una mutazione del gene Rb1 murino che perturbato capacità di pRb di interagire con questi enzimi per determinare se colpite controllo del ciclo cellulare. Qui, ci mostrano che la perdita di questa interazione rallenta la progressione attraverso la mitosi e causa aneuploidia. Nostri esperimenti rivelano che mentre la mutazione del sito di associazione LXCXE non disturbare l'interazione del pRb con i methyltransferases dell'istone h Suv4-20, riduce drasticamente trimethylation H4-K20 in pericentrica eterocromatina. Interruzione della struttura eterocromatina in questa regione cromosomica porta a fusioni centromero, missegregation cromosoma e instabilità genomica. Questi risultati dimostrano la sorprendente trovare che pRb utilizza l'associazione LXCXE schisi alla struttura della cromatina control per la regolazione degli eventi oltre il G (1) - a - S-transizione di fase.

Proteina Retinoblastoma E Promuovere L'anafase Complesso Interagire Fisicamente E Funzionalmente Collaborare Durante L'uscita Del Ciclo Cellulare

La proteina del retinoblastoma (pRB) regola negativamente la progressione da G1 alla fase S del ciclo cellulare, in parte, di reprimere la trascrizione E2F-dipendente. pRB inoltre possiede funzioni di E2F-indipendenti che contribuiscono al controllo del ciclo cellulare - per esempio, durante il ciclo cellulare pRB-mediato arresto pRB associates con Skp2, la proteina F-scatola della Skp1-Cullin-F-box proteina (SCF) E3 ubiquitina ligasi complessa, e favorisce la stabilità dell'inibitore delle chinasi ciclina-dipendente p27(Kip1) attraverso un meccanismo sconosciuto. Degradazione di p27(Kip1) è mediata da ubiquitina-dipendente di targeting di p27(Kip1) da SCF-Skp2 (Rif. 4). Riportiamo un romanzo interazione tra pRB e l'anafase-promozione complesso/cyclosome (APC/C) che p27(Kip1) controlli la stabilità di mira Skp2 per ubiquitin-mediato degradazione. Cdh1, un attivatore di APC/C, non solo interagisce con pRB ma è richiesta anche per un arresto del ciclo cellulare pRB-indotta. I risultati rivelano un'inaspettata convergenza fisica tra la proteina tumore-soppressore pRB e complessi della ligasi E3 e aumentare la possibilità che pRB può diretta APC/C agli obiettivi supplementari durante il ciclo cellulare pRB-mediata uscita.

Analisi Di Struttura-funzione Della Proteina Soppressore Tumorale Retinoblastoma - è Tutta Una Somma Delle Sue Parti?

Analisi biochimica della funzione della proteina retinoblastoma ha ricevuto un'attenzione considerevole dal momento che esso è stato clonato poco più di 20 anni fa. Durante questo tempo pRB è emerso come un regolatore chiave del ciclo di divisione cellulare e la sua capacità di bloccare la proliferazione è perturbato nella stragrande maggioranza dei tumori umani. Molto è stato appreso circa la regolazione dei fattori di trascrizione E2F da pRB nel ciclo cellulare. Tuttavia, molte domande rimangono irrisolte e ricercatori continuano a esplorare questa proteina multifunzionale. In particolare, capire come le sue funzioni biochimiche contribuiscono al suo ruolo come un soppressore tumorale rimane per essere determinata. Poiché pRB ha dimostrato di funzionare come una molecola di adattatore che collega le diverse proteine insieme, o ai promotori particolare, analizzando pRB interrompendo le interazioni della proteina individuali promette tremenda nel dipanare la complessità della sua funzione. Recentemente, strutture cristalline hanno segnalato come pRB interagisce con alcuni dei suoi partner molecolari. Questa informazione ha creato la possibilità di separare razionalmente pRB funzioni studiando mutanti che interrompono i siti di legame individuale. Questa recensione si concentrerà sulla letteratura che indaga pRB isolando funzioni basate su siti all'interno del dominio della tasca di legame. Questo articolo discuterà anche le prospettive per l'utilizzo di questo approccio per esplorare ulteriormente le funzioni sconosciute di pRB.

Un Collegamento Funzionale Tra PRB E Transforming Growth Factor Beta in Sviluppo Di Ghiandola Mammaria E Di Inibizione Di Crescita

Trasformando growth factor beta (TGF-beta) è un mediatore cruciale dello sviluppo del seno e perdita di arresto di crescita TGF-beta-indotta è una caratteristica del cancro al seno. TGF-beta ha dimostrato di inibire l'attività della chinasi ciclina-dipendenti (CDK), che conduce all'accumulo di hypophosphorylated pRB. Tuttavia, a differenza di altri componenti di segnalazione citostatica TGF-beta, pRB è pensato per essere superfluo per lo sviluppo mammario. Usando i mouse gene targeting portando cambiamenti sottili missenso in pRB (Rb1(DeltaL) e Rb1(NF)), abbiamo scoperto che pRB gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo della ghiandola mammaria. In particolare, Rb1 mutanti topi femminili hanno iperplastico epitelio mammario e difetti in infermieristica insensibilità alla inibizione della crescita TGF-beta. In contrasto con gli studi precedenti che ha evidenziato l'inibizione dell'attività di chinasi ciclina/CDK da TGF-beta segnalazione, i nostri esperimenti hanno rivelato che attiva repressione trascrizionale dei geni bersaglio E2F da pRB a valle delle CDKs è inoltre un componente chiave di segnalazione citostatica TGF-beta. Presi insieme, il nostro lavoro dimostra un unico collegamento funzionale tra pRB e TGF-beta nel controllo della crescita e lo sviluppo della ghiandola mammaria.

Un Checkpoint G1 Mediato Dalla Proteina Retinoblastoma Che è Superfluo Nella Differenziazione Terminale Ma Essenziali Per La Senescenza

Terminalmente differenziate cella tipi sono necessari per vivere e funzionare in uno stato postmitotic per tutta la vita. Senescenza cellulare è un altro tipo di arresto permanente che blocca la proliferazione delle cellule in risposta a stress genotossici. Qui vi mostriamo che la proteina del retinoblastoma (pRB) utilizza un meccanismo per bloccare la replicazione del DNA in senescenza che è distinto dal suo ruolo nel ciclo cellulare permanente uscita associata a differenziazione terminale. Il nostro lavoro dimostra che una mutazione sottile in pRB che paralizza la sua capacità di interagire con regolatori di cromatina altera la heterochromatinization e la repressione dei promotori E2F-reattiva durante la senescenza. Al contrario, terminalmente differenziate cellule nervose e muscolari, recanti la stessa mutazione completamente uscita del ciclo cellulare e bloccano l'espressione genica E2F-reattivo da un meccanismo diverso. Sorprendentemente, questo rivela che pRB reclute regolatori della cromatina principalmente per avviare un programma di cattura dello stress-responsive g (1).

Un Cancro Derivato Mutazione Del Gene Retinoblastoma Con Un Difetto Distinto Per Interazioni Dipendente LXCXE

L'interazione tra oncoproteins virali come il virus Simian 40 TAg, E1A, adenovirus e virus del papilloma umano E7 e la proteina del retinoblastoma (pRB) avviene attraverso una sequenza del peptide ben caratterizzati, LXCXE, la proteina virale e un groove ben conservato del dominio della tasca del pRB. Le proteine cellulari, quali deacetylases dell'istone, inoltre utilizzano questo meccanismo per interagire con la proteina del retinoblastoma per reprimere la trascrizione al ciclo cellulare regolato geni. Per questi motivi questa regione del dominio tasca pRB è pensata per giocare un ruolo critico nella soppressione della crescita.

Condensazione Del Cromosoma Mitotico Mediato Dalla Proteina Retinoblastoma è Tumore-soppressiva

Condensazione e segregazione dei cromosomi mitotici è un processo critico per la moltiplicazione cellulare, e, nei mammiferi, errori mitotic possono contribuire alla patogenesi del cancro. In questa relazione, ci dimostrano che la proteina del retinoblastoma (pRB), un ben noto regolatore di progressione attraverso la fase G1 del ciclo cellulare, gioca un ruolo critico nella condensazione del cromosoma mitotico che sia indipendente dal regolamento a-S-fase G1. Utilizzando topi mutanti gene targeting, abbiamo studiato questo aspetto della funzione pRB in isolamento e dimostrare che è una parte essenziale di soppressione tumorale pRB-mediata. Cancro-inclini Trp53(-/-) topi soccombono alle forme più aggressive di cancro quando è compromessa la capacità di pRB di condensare i cromosomi. Inoltre, dimostriamo che struttura cromosoma mitotico difettoso causato da pRB mutante accelera la perdita di eterozigosi, portando alla prima formazione di tumori nei topi Trp53(+/-). Questi dati rivelano un nuovo meccanismo di soppressione tumorale, facilitata da pRB, nel cui genoma stabilità è mantenuta dalla corretta condensazione dei cromosomi mitotici.

Una Sovrapposizione Della Chinasi E Fosfatasi Docking Sito Regola L'attività Della Proteina Retinoblastoma

Lo stato di fosforilazione e la corrispondente attività della proteina soppressore tumorale retinoblastoma (Rb) sono modulati da un equilibrio di attività della chinasi e fosfatasi. Qui ci caratterizzano l'associazione di Rb con la subunità catalitica della fosfatasi della proteina 1 (PP1c). Una struttura di cristallo identifica un sito docking enzima nel dominio Rb C-terminale che è necessario per l'efficiente attività PP1c verso Rb. Il sito di docking fosfatasi si sovrappone con il noto sito docking per chinasi ciclina-dipendenti (Cdk) e PP1 concorrenza con Cdk-cicline per associazione Rb è sufficiente a mantenere l'avanzamento di Rb attività e blocco ciclo cellulare. Questi risultati forniscono la prime dettagliate molecolare intuizioni attivazione Rb e stabilire un nuovo meccanismo per regolamento Rb in cui chinasi e fosfatasi competono per il substrato docking.

La Base Biochimica Del CDK Indipendente Dalla Fosforilazione Regolamento E2F1 Dalla Proteina Retinoblastoma

Il pRB (proteina retinoblastoma) ha un ruolo centrale nel controllo della G (1)-transizione di fase S del ciclo cellulare che è in parte mediato attraverso la regolazione dei fattori di trascrizione E2F. Al momento dell'ingresso in fase S pRB è fosforilata estesamente, che in giro comunicati associato E2Fs a guidare l'espressione dei geni necessari per la progressione in fase S. Nel presente studio, dimostreremo che E2F1-mantiene la capacità di interagire con ppRB (iperfosforilata pRB). Questa interazione è dipendente del sito vincolante E2F1 'specifico' si trova nel dominio C-terminale del pRB. Una regione unica del dominio casella di E2F1 contatti il sito 'specifico' per mediare l'interazione con ppRB. La base dell'interazione tra E2F1 e ppRB meccanicistica è sottile. Una singola sostituzione tra valina e prolina residui nella casella contrassegnato distingue la capacità di E2F1 di interagire con ppRB dall'incapacità di E2F3 da associare al sito 'specifico' in ppRB. L'interazione E2F1-pRB presso il sito di 'specifico' mantiene anche la capacità di regolare l'attivazione trascrizionale dei geni bersaglio E2F1. Questi dati rivelano un meccanismo da cui E2F1 regolamento da pRB può persistere, quando pRB è iperfosforilata e si presume sia inattivo.

Un Ruolo Specifico Del Contesto Per Il Controllo Di Crescita Negativa Dipendente Dalla Proteina Retinoblastoma Nel Sopprimere La Tumorigenesi Mammaria

La capacità di rispondere ai segnali anti-growth è fondamentale per mantenere l'omeostasi dei tessuti e perdita di questa salvaguardia del controllo di crescita negativa è considerato un segno distintivo del cancro. Regolamento di crescita negativa generalmente si verifica durante la fase G0/G1 del ciclo cellulare, eppure la ridondanza e complessità tra i componenti di questa rete normativa ha reso difficile discernere la crescita negativa come spunti proteggono le cellule dalla proliferazione aberrante.

Dolci Sogni Per Hippo

L'Hippo pathway coordinate organo dimensione e cellula proliferazione. La famiglia del retinoblastoma delle proteine regola la progressione attraverso la fase G0/G1 del ciclo cellulare. Interruzione del percorso o contribuisce alla formazione del cancro. Tre studi recenti nello sviluppo & geni rivelano proliferazione cellulare come è coordinato tra questi percorsi. Qui discutiamo le implicazioni di questi studi e le nuove domande che sollevano.

Segnali Di Danni Del DNA Attraverso Differenzialmente Modificate E2F1 Molecole Di Indurre Apoptosi

Trascrizione E2F può portare a cellule di proliferazione o apoptosi, che indica che il controllo E2Fs opposte funzioni. In modo simile, possono segnalare interruzioni del doppio filamento di DNA per indurre l'arresto del ciclo cellulare o apoptosi. In particolare, pRB viene attivato a seguito di danni al DNA, permettendo di associare alla trascrizione E2Fs e blocco al ciclo cellulare promotori; Tuttavia, E2F1 è contemporaneamente attivato, che conduce alla trascrizione presso Miselli promotori. Abbiamo esaminato questo controllo paradossale della trascrizione E2F studiando come interazione di E2F1 con pRB è regolamentato riportato danni al DNA. Il nostro lavoro rivela che i danni al DNA segnali creare forme multiple di E2F1 che contengono modifiche di posttranslational escludono. In particolare, E2F1 fosfo-serina 364 si trova solo in complesso con pRB, mentre E2F1 fosforilazione della serina 31 e funzione di acetilazione per creare una forma di E2F1 priva di pRB. Sia associata a pRB e pRB senza modifiche su E2F1 sono essenziali per l'attivazione di TA-p73 e la massima induzione di apoptosi. Immunoprecipitazione della cromatina dimostrato che E2F1 fosforilata in serina 364 è anche presente presso promotori gene Miselli durante l'induzione dell'apoptosi. Questo indica che popolazioni distinte di E2F1 sono organizzate in risposta alla segnalazione di danni del DNA. Sorprendentemente, questi complessi agiscono in parallelo per attivare la trascrizione dei geni Miselli. I nostri dati suggeriscono che i segnali di danno al DNA alterare pRB ed E2F1 impegnarli nelle funzioni che portano all'induzione di apoptosi che sono distinte da regolamento pRB-E2F nel controllo del ciclo cellulare.

Instabilità Cromosomica E Deregolamentato Proliferazione: Un Duo Inevitabile

Il concetto che l'aneuploidia è una caratteristica delle cellule maligne è nota da tempo; Tuttavia, l'idea che l'aneuploidia è un attivo collaboratore di tumorigenesi, invece di essere un fenotipo associato, è più recente nella sua evoluzione. Allo stesso tempo, stiamo vedendo l'emergere di nuovi ruoli per geni soppressori tumorali ed oncogeni nella stabilità del genoma. Questi includono il gene coli poliposi adenomatosa familiare (APC), p53, il gene di suscettibilità di retinoblastoma (RB1) e Ras. Originariamente, molti di questi geni si pensava fossero tumore soppressiva o oncogenica unicamente a causa del loro ruolo nel controllo proliferativo. A causa della frequenza con cui si sono interrotti nel cancro, instabilità cromosomica causata dalla loro disfunzione potrebbe essere più centrale di tumorigenesi quanto si pensasse. Pertanto, questa recensione metterà in evidenza come il corretto funzionamento del ciclo cellulare geni regolatori contribuisce al mantenimento della stabilità del genoma, e come loro mutazione in cancro obbligatoriamente collega proliferazione ed instabilità cromosomica.

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