Translate this page to:
Japanese
In JoVE (1)
Other Publications (10)
- Journal of Virology
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
- Cell Stem Cell
- Cell Cycle (Georgetown, Tex.)
- Current Opinion in Genetics & Development
- Cell Stem Cell
- Journal of Virology
- Cell
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
- Cell Stem Cell
Automatic Translation
This translation into Japanese was automatically generated.
English Version | Other Languages
Articles by G Grant Welstead in JoVE
JoVE General
4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性
1Stemgent, 2Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology
Stemgent Doxの誘導性マウスTFのレンチセットは、人工多能性幹（iPS）細胞に、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を再プログラムすることができます。ここでは、マウスプログラミング転写因子Oct4のDOX誘導性発現のためのプロトコルを示す、レトロウイルスベクター、KLF4およびc - Mycが発現する共通のMES多分化能マーカーのiPSコロニーを生成する。
Other articles by G Grant Welstead on PubMed
麻疹ウイルスヘマグルチニンタンパク質による宿主細胞表面からダウンレギュレーションCD150（SLAM）のメカニズム
麻疹ウイルスは二つの細胞受容体、CD46とCD150（SLAM）のいずれかを介して宿主細胞を入力することが報告されている。 SLAMは、活性化B、T、および樹状細胞に発現し、免疫システムの重要な調節分子であるCD46されている間は、高等霊長類のほとんどの細胞に記載されています。前回のレポートでは、麻疹ウイルスがダウンして感染時に宿主細胞表面上に2つの細胞の受容体の発現を調節することができることが示されている。本研究では、麻疹ウイルスによるSLAMのダウンレギュレーションのプロセスを検討した。我々は、麻疹ウイルスのヘマグルチニン（H）蛋白質の発現がダウンレギュレーションのために十分であったことを明らかにした。我々の研究は、小胞体におけるHとSLAMとの間の相互作用（ER）は、SLAMはなく、CD46のダウンレギュレーションを促進することができるという証拠を提供した。さらに、宿主細胞表面でのHとSLAMとの間の相互作用はまた、ダウンレギュレーションをSLAMに貢献できることを実証した。これらの結果は、宿主細胞の表面でHに結合する細胞内の小胞体におけるHとSLAMとの間の相互作用や受容体媒介のいずれかを含む2つのメカニズムは麻疹ウイルスの感染時にSLAMのダウンレギュレーションにつながる可能性があることを示しています。
CD150（SLAM）トランスジェニックマウスのリンパ細胞や臓器における麻疹ウイルスの複製
転写のためにその内因性プロモーターを含む完全なヒトSLAM（hSLAM/CD150）遺伝子を含むトランスジェニックマウスは、細菌人工染色体にクローニングし、ヒトのゲノムDNAを使用して生成した。 hSLAM、麻疹ウイルス（MV）の主要な受容体は、活性化B、T、人間と同等の発現プロファイルを持つ樹状細胞に発現していた。我々は活性化B、T、および樹状細胞を含むトランスジェニックマウス、から得られたhSLAM（+）細胞が受容体に依存した方法でMV感染に感受性であったことを明らかにした。証拠はhSLAM（+）鼻腔内接種後のマウスの鼻のリンパ節に一過性の感染のために用意されました。ウイルスは急速にセカンダリレプリケーションの兆候なしにクリアされました。 MVの生産効率を向上させるために、hSLAM（+）マウスはSTAT1欠損背景を持つマウスと交配させた。これらのマウスは、MV感染に対してより感受性であった多くのウイルス粒子を生成する。 MVと、これらのマウスの鼻腔内、腹腔内接種した後、胸腺、脾臓、鼻、腸、脚のリンパ節の感染が検出された。剖検時には、リンパ節腫大と脾臓は明らかであった。フローサイトメトリー分析は、成熟した好中球やナチュラルキラー細胞の異常に大きな数値が脾腫の原因が示された。 hSLAMトランスジェニックマウスでは、より正確に、ヒトで見つかった感染のパターンを反映している免疫細胞とMVの相互作用を研究するための改良されたげっ歯類モデルを構成しています。
Oct4の発現は、マウスの体性幹細胞の自己複製に必須ではありません
転写因子Oct4のを含むPOUドメインは、哺乳動物の胚盤胞の内部細胞塊のと同様に胚性幹細胞の多能性の十分に確立されたレギュレータです。それはOct4の遺伝子が注入後にエピジェネティックな修飾の一連の不活化されることが示されているが、最近の研究では、体性幹細胞と腫瘍細胞の様々なOct4のアクティビティを検出した。これらの観察結果に基づいて、それがOct4のも、体性幹細胞の自己複製を維持するために機能することができると、それに加えて、腫瘍形成を促進する可能性が示唆されている。我々は、Oct4のは、腸上皮、骨髄（造血系および間葉系統）、毛包、脳、肝臓を含むいくつかの体細胞組織の幹細胞コンパートメントの多能性維持に重要であるかどうかを判断するための遺伝的アプローチを採用しています。これらの組織における遺伝子Oct4のアブレーションでは、恒常性や再生能力には異常は認められなかった。我々は、Oct4のは、自己再生と大人の哺乳動物の体性幹細胞の維持の両方のに不要であると結論付けている。
多能レギュレータOct4の：体性幹細胞の役割？
その発見以来、胚性幹細胞（ES細胞）と発展途上胚盤胞の内部細胞塊の多能性の重要な調節因子として、POUドメイン含有転写因子Oct4のは、体性幹細胞の多くの研究で "stemness"にはプロキシとなっていますその存在は、しばしば、これらの細胞の多能性の証拠として扱われます。最近の研究は、しかし、だけでなく、体性幹細胞のコンパートメントに効力を維持するためのOct4に不要であることを実証しただけでなく、Oct4および得られたデータの解釈を検出するために適用されたメソッドは、欠陥がすることができる。ここではコントラストは成体幹細胞のものと胚性幹細胞の多能性を支配すると批判的に哺乳類のソーマの成体幹細胞の多能性の概念を議論することが知られている経路。
多能性の再プログラミング言語
後生動物では、系統特異的転写因子とエピジェネティックな修飾子は、開発時に適切な遺伝子発現プログラムを確立し、維持する機能があります。マウスとヒトの両方で、最近の画期的な研究では、異所性発現レトロウイルス形質導入によって多能性の状態に体細胞核を再プログラミングすることが可能である転写因子の集合を定義しています。多能性の誘導に十分である因子の同定は、分子レベルでの転写調節ネットワークを再配線すると、in vitroでの細胞の運命を操作するために使用できることを示唆している。これらの知見は、理解の開発と疾患と治療への応用における幹細胞の潜在的な使用のための広範な意味を持っています。
マウス体細胞の直接リプログラミング中に多能性マーカーのシーケンシャル式
多能性は、Oct4の、レトロウイルスベクター、KLF4、およびc-Mycのレトロウイルス形質導入により差別化され、マウスおよびヒトの細胞で誘導することができる。我々は、これら4つの転写因子は、ドキシサイクリン（DOX）から発現されているプログラミング戦略を考案したレンチウイルスベクターを誘導。これらの誘導構造体を使用して、我々は、マウス胚性線維芽細胞（MEF）から誘導多能性幹（iPS）細胞由来の導入遺伝子のサイレンシングが正常な細胞分化のための前提条件であることがわかった。我々は、マウスiPS細胞の誘導中に知られている多能性マーカーの活性化のタイミングを分析し、アルカリホスファターゼ（AP）は、ステージ固有の胎児性抗原1（SSEA1）に続いて、最初にアクティブ化されたことを観察した。 Nanogの発現と内因性のOct4遺伝子、完全に再プログラム細胞をマーキングのみ、プロセスの遅い段階で観察された。重要なのは、ウイルスiPS細胞を生成するために、少なくとも12日間表現されるために必要なcDNAを導入した。我々の結果は、エピジェネティックなリプログラミングを支配する分子事象のいくつかを理解する第一歩です。
肺胞マクロファージおよび樹状細胞の麻疹ウイルスの感染は、ヒューマン·シグナリングリンパ球活性化分子を発現するトランスジェニックマウス（SLAM、CD150）のリンパ臓器に転移に先行
霊長類モデルの最近の研究では、野生型麻疹ウイルス（MV）が全身に拡散する前に、気道に位置して免疫細胞に感染することを示唆しているが、これらの細胞の身元は不明である。主なMV感染を支持する細胞を同定するために、我々は人間のような組織特異性とリンパ球活性化分子（SLAM、CD150）のシグナル伝達MV受容体の人間を発現するマウスを利用した。我々は緑色蛍光タンパク質を発現する野生型MVと（IN）鼻腔内にこれらのマウスを感染させた。一つは、2つまたは3つ日間接種した後、鼻関連リンパ組織（NALT）、肺、いくつかのリンパ節（LNS）、脾臓、および胸腺を採取し、分析顕微鏡およびフローサイトメトリーにより、ウイルス分離が試みられました。接種後一日、MVのレプリケーションは、肺胞マクロファージの約2.5％（AM）と樹状細胞（DC）の0.5％で、唯一の気道に記載されていました。これらの細胞は、ヒトSLAMを発現し、それはMV感染が一時的にSLAMの発現を増強することが観察された。その後、MVはBおよびTリンパ球を含む他の免疫細胞の種類に感染した。ウイルスは、早ければリンパ組織から単離された2日後に接種、縦隔リンパ節は、レプリケーションの初期のサイトや感染症のサポートされている高レベルであった。三日間腹腔内接種した後、縦隔LN細胞の1から8パーセントが感染していた。したがって、気道の肺胞マクロファージと上皮の樹状細胞のMV感染は、人間のような組織特異性でヒトSLAMを発現するマウスのリンパ器官におけるリンパ球の感染よりも優先されます。
生理的酸素濃度下でプレX不活化ヒト胚性幹細胞の誘導
つのアクティブなX染色体（XaXa）の存在は、マウス胚性幹細胞（ESCは）への多能性、特定の基底状態の特徴です。ヒトESC（ヒトES細胞）は、常にX染色体不活性化（XCI）の兆候を示し、それらのマウスに比べ、より高度な発達と見なされます。我々は生理的な酸素濃度で得られXaXaのヒトES細胞の確立について説明します。これらの細胞株を使用して、我々は、（1）ヒトES細胞の分化は、マウスESCのと同様の方法でランダムXCIを誘導する、（2）大気中の酸素への慢性暴露は、トランスクリプトームのマイナーな変化と不可逆XCIを誘導するのに十分であること（3）を示すXaはXISTプロモーター領域のメチル化を示す重い、（4）XCIは、脱メチル化とXiを越えH3K27-ME3堆積とともにXISTの転写活性化に関連付けられています。これらの知見は、ヒトの胚盤胞は、事前-X不活性化細胞が含まれていることと、この状態は生理的な酸素下で培養によりin vitroで保存されていることを示しています。
ヒストンH3K27acは構えエンハンサーからActive分離して発達の状態を予測する
発達プログラムは、ゲノムのエピジェネティックな修飾を介して特定の遺伝子発現プログラムを維持する転写因子やクロマチンレギュレータによって制御されます。エンハンサーで、これらの規制のイベントは、セルの状態と新しい種類の細胞への分化の可能性を決定する特定の遺伝子発現プログラムに貢献しています。エンハンサーエレメントは、特定のヒストン修飾と転写因子に関連付けられていることが知られているが、遺伝子発現と発達の状態にこれらの変更の関係が明確に定義されていません。ここでは、マウスの胚性幹細胞といくつかの成人組織におけるエンハンサーエレメントのエピジェネティックな風景を問い合わせる。我々は、ヒストンH3K27acだけではH3K4me1を含むアクティブ/非構えエンハンサー要素からアクティブなエンハンサーを区別見つける。これは積極的に使用されるエンハンサーの量が以前に予想したより低いことを示しています。さらに、構えエンハンサーネットワークが未発達プログラムへの手がかりを提供しています。最後に、我々はエンハンサーは、核初期化中にリセットされていることを示しています。
ファクターの化学量論を再プログラムするエピジェネティックな状態と誘導多能性幹細胞の生物学的特性に影響を与える
我々は、多能性の状態に体細胞のリプログラミングに影響を与えるパラメータを識別するために2つの遺伝的に高度に定義されているトランスジェニックシステムを比較した。我々の結果は、プログラミングプロセス中に初期化因子のレベルと化学量論が強くiPS細胞の多能性の結果に影響を及ぼすことを示している。 c-MycおよびSox2の低い発現を組み合わせるOct4およびKLF4の高発現は、効率的にDlk1-DIO3座で、通常のプリントを維持した四倍体（4N）相補性によって、 "すべてIPSCマウスを"生成されたiPS細胞を生産し、マウスを作成しませんでした腫瘍を有する。 "すべてIPSCマウスを"生成の効率が低下したものの、Dlk1-DIO3遺伝子座におけるインプリンティングの喪失（LOI）が厳密に減少する多能性と相関しなかった。我々のデータは初期化因子の化学量論は、iPS細胞のエピジェネティクスと生物学的特性に影響を与えることができることを示しています。この概念は、性IPSCとESCの "一般的な"エピジェネティックな状態を定義するための努力を複雑にし、別のiPS細胞とES細胞株を比較するときに考慮する必要があります。
