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Articles by Gil Levkowitz in JoVE
JoVE General
라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivation
Molecular Cell Biology, Weizmann Institute of Science
Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.
Other articles by Gil Levkowitz on PubMed
아연 손가락 단백질 몇 Monoaminergic 신경 세포의 개발을 제어 하는 너무 합니다
Dopaminergic (DA) 및 척추 동물에서 뉴런 serotonergic (5HT)의 개발을 제어 하는 메커니즘은 잘 이해 되지 않는다. 여기 우리가 zebrafish 돌연변이-특징 부족 (tof)-개발 hindbrain 5HT 및 noradrenergic 신경 하지만 hypothalamic 다 및 5HT 뉴런을 개발 하지 않습니다. tof 개 특정 아연 손가락 전사 진압을 동종 포유류 Fezl (개 배아 아연 손가락 모양의 단백질)을 인코딩합니다. 모자이크 및 co-staining 분석 그 fezl DA 또는 5HT 신경 세포에 표현 되는 고 대신 비-셀-자율적 이러한 신경 세포의 개발을 제어 했다. 진압 eh1 관련 주제와 두 번째 아연 손가락 도메인 tof 기능을 위해 필요 했다. 우리의 결과 tof/fezl는 monoaminergic 척추 뇌 뉴런의 개발 규제의 핵심 구성 요소를 나타냅니다.
수동 녹말 체 Immunotherapy 아 밀 로이드를 지우고 Transiently Microglia 녹말 체 증 착의 유전자 변형 마우스 모델에서 활성화 됩니다
체계적으로 관리 안티-Abeta 항 체 후 녹말 체 예금 제거에서 microglia 역할 불분명 남아 있습니다. 현재 연구에서 우리가 주입 Tg2576 APP 유전자 변형 쥐 매주 안티-Abeta 항 체와 1, 2, 또는 3 개월에 대 한 모든 마우스 했다 22 개월의 연구 끝에는. 3 개월에 대 한 예방 접종을 마우스 Y 미로 교체 성능 개선을 찾았습니다. 조직학, 감지 마우스 IgG congophilic 녹말 체 예금 안티-Abeta 항 체 치료 그 생쥐 제어 항 체 치료 들에 바인딩할 수 있었습니다. CD45 치료 2 개월 후 증가 하는 반면 우리는 치료 1 개월 후 microglia에 Fcgamma 수용 체 식 증가 했다 발견. 이러한 microglial 변경과 관련 된 치료 2 개월 후 확산 및 소형 녹말 체 예금 감소가 했습니다. 흥미롭게도, 녹말 체 수준 유지 감소 하는 반면 microglia 마커 제어 수준, 치료 3 개월 후에 감소 되었다. 혈 청 Abeta 수준 및 안티-Abeta 항 체 수준이 비슷한 높은 수치가 전혀 세 생존 시간이 있었다 제어 항 체 주사 보다는 주어진 쥐 안티 Abeta 주사에. 이러한 데이터는 항 체는 두뇌를 입력 하 고 녹말 체 예금, 가능성이 opsonizing는 Abeta 및 Fcgamma 수용 체-중재 식 균 작용의 결과 바인딩할 수 있게 보여줍니다. 우리의 이전 작품 함께 우리의 데이터 모든 안티-Abeta 항 체 중재 녹말 체 제거의 메커니즘을 동시에 활성화 될 수 있습니다 제안 논쟁.
Homeodomain 단백질 Orthopedia의 이중 규제에 의해 Hypothalamic 뉴런의 사양입니다
개발 시상 하 부 뉴런의 다양 한 고도의 조정 하지만 제대로 이해 과정에서 서로 인접 한 생성 됩니다. 답이 남아 있는 중요 한 질문은 여러 신경 형식의 얼마나 협조 개발이 상대적으로 좁은 해 부 지역에서 얻을 수 있다. 우리는 두 눈에 띄는 hypothalamic 세포 유형의 개발을 위한 패러다임으로 dopaminergic (DA) 및 oxytocinergic (OT) 뉴런에 초점. 우리 보고 다 및 오티 같은 뉴런은 zebrafish의 개발 포함 하는 homeodomain 단백질 Orthopedia (Otp) hypothalamic 신경 분화의 주요 결정자의 식을 조절 하는 두 개의 새로운 경로 의해 조율 된입니다. 유전자 분석 G-단백질 결합 수용 체 PAC1 및 아연 손가락 포함 된 전사 인자 Fezl Otp를 상류 행동을 보였다. 생체 조건 하 고 체 외 실험을 Fezl 및 PAC1 규제 Otp를 transcriptional 및 post-transcriptional 수준에서 각각 시연 했다. 우리의 데이터는 새로운 유전자 네트워크 제어는 중요 한 결정 기본 Fezl PAC1 중재 차별화로 척추 동물 및 장소 Otp hypothalamic 뉴런의 사양 공개.
Dopaminergic 신경 클러스터 크기는 초기 개 패턴화 하는 동안 결정 됩니다
우리 같은 단일 셀 해상도 zebrafish diencephalon 신경 하위의 구성과 차별화에 정식 Wnt 신호 패턴화 강력한 신경 판의 효과 탐험. 놀랍게도, Wnt 신호 섭 동 diencephalic 운명 사양에 전반적인 영향을 하지 않은 하지만 선택적으로 (다) dopaminergic 신경 세포의 수를 영향을. 우리 두 광자 기반 uncaging 메서드를 사용 하 여 신경 판의 diencephalic 위치에 다 조상 영역 확인 하 고이 조상 영역에서 파생 된-DA 뉴런 수 Wnt 감쇄에 의해 변경 되지 않습니다 보여주었다. Birthdating 분석을 사용 하 여, 우리 다 progenitors의 마지막 세포 분열의 타이밍을 결정 하 고 다 셀 번호 다음 Wnt 억제에 변화 하지 세포 주기 출구 속도의 변화 때문 이라고 밝혔다. 조건부 저해 Wnt 및 세포 증식의 시연 Wnt 소성 주 성체에서 발생 하는의 창 다 progenitors의 수를 제한 했다. 마지막으로, 우리는 wnt8b를 fz8a를 통해 역할 다 셀 수 변조기는 시연 (Fzd8a) 수용 체와의 다운스트림 이펙터 Lef1, Fezl (Fezf2) 전사의 활동을 요구 하는이 프로세스에 대 한 요소. 우리의 데이터 Wnt 신호를 개별 신경 인구의 차동 응답은 그들의 상대적인 anteroposterior 위치의 간단한 해석 하지 보여 줍니다. 이 연구 또한 보여줍니다, diencephalic DA 인구 크기는 예상 보다 훨씬 일찍 신경 판 내의 변조는 처음으로 지역 패턴화 Wnt 중재 이벤트와 함께 수 반하는.
코 배아 LHRH 요소 Zebrafish에 3 신경 발달 마이그레이션 및 생식 선 자극 호르몬-방출 호르몬의 투영에 역할을 한다
사춘기의 개시와 생식 시스템의 작동 hypophysiotropic 생식 선 자극 호르몬-방출 호르몬 (GnRH) 시스템의 적절 한 개발에 따라 달라 집니다. 이 과정에서 하나의 중요 한 단계는 시상 하 부에 후 각 영역에서 GnRH 신경 세포의 배아 마이그레이션. 우리 zebrafish NELF 인지 GnRH3 신경 세포의 개발에 필수적인 조사는 Gnrh3에서 신경 세포와 axons 레이블이 놓여있는지는 Tg(gnrh3:EGFP) 유전자 변형 zebrafish 모델을 사용 하 여. Zebrafish nelf Cdna는 복제 하 고이 특징. 배아 개발 하는 동안 nelf GnRH3 신경 세포와 GnRH3 투영 및 perikarya의 마이그레이션 시작 하기 전에 대상 사이트에 표시 됩니다. Nelf 최저의 부재를 포함 하는 GnRH3 시스템의 장애 또는 GnRH3 axonal 파생물 및 GnRH3 perikarya의 잘못 되거나 체포 된 마이그레이션 misguiding 결과. 이 결과 Nelf 발달 마이그레이션 및 GnRH3 신경 zebrafish의 투영에 중요 한 요소는 것이 좋습니다.
Diencephalic Dopaminergic 신경 세포를 지정 하려면 Sim1 Transcriptional 레 귤 레이 터의 신경 단백질 Olig2 행위 상류
신경 요인과 신경 progenitors에서 표현 되는 성체 및 gliogenesis. 최근 연구에 따르면 신경 하위 형식 사양에 대 한 transcriptional 코드 만드는 그들의 대상 유전자의 식을 조절 하 여 특정 신경 운명을 결정 하는 데 이러한 요인 또한 관련 된 제안 했다. 현재의 연구에서 우리는 신경 진 Olig2 zebrafish transcriptional 레 귤 레이 터에 Sim1 co-expressed diencephalic progenitors (다) dopaminergic 신경 운명으로 향하는의 하위 집합에는 표시. Sim1 mRNA 성숙한 다 신경에 감지도, 하는 동안 olig2 식 터미널 다 분화 이전 소멸 됩니다. Olig2 또는 Sim1 기능의 손실 장애 다 개발을 리드. 마지막으로, Olig2 Sim1 식이 조절 및 Sim1 함수의 이득 구출 olig2의 타겟된 최저의 기인한 다 분화에 적자. 우리의 연구 결과 처음 기저 diencephalic DA 뉴런의 신경 단백질 Olig2 및 그 하류 신경 특정 이펙터 sim1의 결합 된 동작에 의해 규제 됩니다 보여 줍니다.
고해상도 Zebrafish Diencephalon의 운명 지도입니다
Diencephalon 감각, 중앙, 내 분 비 시스템 간의 대화형 사이트 되며 척추 뇌에서 가장 정교한 구조 중 하나입니다. 배아 발달과 diencephalon morphogenesis 더 나은 이해를 우리는 향상 된 photoactivation (uncaging) 개발-혈통 추적 전략을 기반으로 합니다. 주어진된 diencephalic 조상 도메인의 정확한 위치를 확인 하려면 우리는 Neurogenin1 proneural 단백질을 표현 하는 셀에 녹색 형광 단백질 (GFP) 운전 유전자 변형 라인을 사용 (Neurog1)을 보이는 신경 판 랜드마크로 사용 되었다. 이 이렇게 셀 zebrafish 신경 판의 예비 diencephalon에 정의 된 그룹의 정확한 라벨 용이 하 게 합니다. 이러한 방식으로 우리 정확성과 재현성의 개발 신경 판의 역동적인 변화에 관계 없이 우리의 혈통 추적 되도록 diencephalon의 여러 겹치는 영역 표시. 우리는 앞에서 설명한 것 보다 더 높은 공간 해상도 zebrafish diencephalon의 운명 지도 제시.
Cxcl12a Cxcr4b 신호 개 Zebrafish의 GnRH 시스템의 적절 한 개발을 위해 중요 하다
Hypothalamic 생식 선 자극 호르몬-방출 호르몬 (GnRH) 신경 세포는 뇌 하 수 체 생식 선 자극 호르몬 분 비와 gametogenesis 제어합니다. 개발 과정에서이 시상 하 부 후 각 placode에서 마이그레이션합니다. 이 신경 이동의 정확한 분자 메커니즘이 명확 하지 않습니다. 여기에서, 우리는 chemokine 수용 체, Cxcr4b, 및 그것의 동족 리간드, Cxcl12a, GnRH3 신경 zebrafish의의 적절 한 마이그레이션에 필요한 인지 조사 했다. 이탈된 GnRH3 axonal 투영 및 신경 마이그레이션 homozygote cxcr4b 돌연변이 전달 하는 유 충에서 발견 되었습니다. 마찬가지로, Cxcr4b 또는 cxcl12a의 최저의 비정상적인 GnRH3 axonal 예측 및 셀 마이그레이션, 앞쪽에 commissure 및 광학 chiasm에 GnRH3 축 삭의 특징적인 측면 교차점의 부재를 포함 하 여 모양을 이끌어 냈다. 더블 라벨 분석 cxcr4b 및 cxcl12a GnRH3 마이그레이션 경로 (예:: 후 각 placode, 터미널 신경 및 광학 chiasm)을 따라 표시 됩니다 것으로 나타났습니다. 이 연구 결과 Cxcl12a Cxcr4b 리간드-수용 체 쌍 zebrafish, GnRH3 뉴런의 마이그레이션에 관련 된는이 시스템의 개발을 위한 중요 한 제안.
Zebrafish 시상 하 부의 개발입니다
Hypothalamic 뉴런 수 면, 혈압, 온도, 기아 및 신진 대사, 갈증 및 물림, 스트레스, 그리고 사회적 행동을 포함 하 여 기본적인 신체 기능을 조절. 이 다양 한 hypothalamic neuropeptides 및 행동 활동, 대사, 내 분 비에 영향을 주는 신경 전달 물질의 분 비를 통해 이루어집니다. Hypothalamic 신경 회로의 발달 장애는 생리 적, 심리적 항상 성을 방해 하는 신경 성 질환에 연관 됩니다. Hypothalamic 셀 사양과 morphogenesis zebrafish, 척추 생물 유전자 조작에 쉽게 순종에 고유 하 게 공부하실 수 있습니다. 배아는 광학 투명 하 고 외부에서 개발, 그들은 그들의 회로 신경 세포의 생체 조건 분석을 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 여기, 우리가 논의 neuroanatomy zebrafish 시상 하 부의 최근 연구 식별 hypothalamic 차별화의 중요 한 결정 요인에 관한 현재 정보. 함께 찍은, 이러한 보고서 개발의 시상 하 부의 기본 분자 경로 zebrafish 포유류 사이 크게 보존 됩니다 보여 줍니다. 우리는 zebrafish 자체가 패턴화, 사양, morphogenesis, 그리고 시상 하 부의 후속 기능을 이해 하기 위한 귀중 한 척추 모델을 입증 했다 결론 지었다.
Zebrafish 태아에 있는 MRNA 식의 시각화입니다
공간 및 시간 유전자 패턴 검사 유전자 기능 이해를 향한 중요 한 단계입니다. 따라서, Mrna의 제자리 교 잡 가장 강력한 중 하나입니다 그리고 광범위 하 게 사용-생물학에서 기법. 최근 발전 zebrafish 태아에 있는 mRNA 사본, 또는 조합 mRNA 및 단백질, 안정적이 고 동시 탐지를 허용.여기 우리가 단일 사본 또는 여러 유전자 제품의 정확한 식 패턴을 시각화 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 고정 및 뒤에 태그 센스 riboprobes와 교 잡 배아의 permeabilization을 사용 하는 절차. 초과 프로브는 다음 씻어와 하이브리드 효소 중재 기술 활용 하 던 또는 형광 기판에 의해 검색 됩니다.
Hypothalamic Neuropeptide Oxytocin Neurovascular 인터페이스는 뇌 하 수 체의 형성 필요 하다
Hypothalamo neurohypophyseal 시스템 (HNS) 통해 hypothalamic neuropeptides 옥 시 토 신과 아르기닌 바소 프레 신 종료 뇌 혈 류로 그들은 어디로 주변 생리학에 영향을 미칠 neurovascular 구조 이다. 여기, 우리가 hypothalamic 축 삭과는 zebrafish의 neurohypophyseal 모세 혈관 사이의 neurovascular 접촉을 조절 하는 분자 신호를 조사 합니다. 우리는 모두 hypothalamic 축 삭과 neurohypophyseal 혈관 분석할 수 vivo에서 유전자 변형 시스템을 개발 했습니다. Zebrafish HNS HNS neurovascular 인터페이스의 형성에 기여 하는 동적 프로세스의 세포 조직을 식별 합니다. 우리는이 인터페이스의 형성에 영향을 미치는 내 피 morphogenesis oxytocin의 로컬 버전으로 개발 하는 동안 규제는 보여줍니다. 이 셀 통신 과정은 신경 세포 사이의 혈관에서 HNS의 꽉 axovasal 인터페이스의 구축에 필수적. 우리는 neuropeptide의 분 비를 통해 내 피 morphogenesis에 영향을 미치는 axons의 독특한 예 제시.
PGC-1α 신진 대사 레 귤 레이 터는 직접 Hypothalamic Neuropeptide Oxytocin의 식을 제어합니다
Transcriptional coactivator PGC 1α 주변 조직에서 세포 에너지 지출의 키 레 귤 레이 터 이다. 최근 연구 보고서 PGC 1α null 쥐 늦은 발병 비만 개발 및 PGC 1α의 신경 비활성화 하면 증가 음식 섭취 량. 그러나, CNS에 PGC-1α의 정확한 역할 불분명 남아 있습니다. 여기 우리가 PGC 1α 직접 hypothalamic neuropeptide oxytocin, 식욕의 알려진된 중앙 레 귤 레이 터 식 조절 보여줍니다. 우리는 zebrafish의 독특한 유전자 접근 모니터링 하 여 PGC 1α 활동 oxytocinergic 뉴런에서 조작할 수 있도록 개발 했다. PGC-1α oxytocin zebrafish 시상 하 부에 있는 coexpressed를 찾았습니다. Zebrafish PGC 1α 유전자 활동을 표시 된 발생의 타겟된 최저의 oxytocin mRNA 수준에서 감소 하 고 유전자 변형 GFP 기자 oxytocin 모터에 의해 구동의 식을 저해. Oxytocin 유전자 활동에 PGC 1α 손실 함수의 효과 zebrafish oxytocinergic 뉴런에서 PGC-1α 또는 oxytocin 전조의 조직 관련 표정에 의해 구출 되었다. PGC-1α 분리 셀 문화 시스템에서 oxytocin 발기인 활성화 하 고 PGC 1α overexpression 유도 된 근육과 신경 세포에서 oxytocin의 소성 식. 마지막으로, 먹이 하지 단식 동물에서 oxytocin 발기인을 vivo에서 복잡 한을 형성 하는 PGC-1α. 이러한 연구 결과 PGC-1α은 필요 하 고, 옥 시 토 신 생산을 위한 충분 한 에너지 섭취 량을 제어 하려면 알려진 hypothalamic 호르몬의 직접 정품 인증에서 hypothalamic PGC-1α 연루 보여 줍니다.
Homeodomain 단백질 Otp 및 활동 종속 접합 스트레스 신경 적응 변조
Corticotropin 방출 호르몬 (CRH) 활동의 규제 스트레스도 전에, 동물의 적응에 대 한 중요 한 이며 그 dysregulation는 연관 된 인간의 정신 장애. 그러나 스트레스를 transcriptional 응답이 기본 분자 메커니즘은 잘 이해 되지 않는다. 마우스와 zebrafish 다양 한 스트레스 패러다임을 사용 하 여, 우리 hypothalamic 전사 인자 Orthopedia 변조 CRH 접합 계수 Ataxin 2 바인딩 단백질-1 (A2BP1/Rbfox-1)의 식을 보여줍니다. 우리는 더 이상 G 단백질 결합 수용 체 PAC1, 알려진 A2BP1/Rbfox-1 접합 대상과 CRH 활동의 중요 한 중재자 이다, 스트레스도 전에 대 한 응답으로 배선 또는 보여줍니다. 대체 접합 하 여 메신저 RNA isoform PAC1-홉 세대는 중국 철로 고속 전사의 종료, hypothalamic-뇌 하 수 체-부 신 축 및 적응형 불안 같은 동작의 정상적인 활성화 필요 합니다. 우리의 연구는 진화 적으로 보존된 생 화 확 적인 통로 transcriptional 활성화 및 대체 접합을 통해 스트레스를 신경 적응 변조를 식별 합니다.
