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Articles by Goutami Banerjee in JoVE
JoVE Bioengineering
GENPLAT: eine automatisierte Plattform für Biomasse Enzym-Entdeckung und Cocktail-Optimierung
1DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, 2DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University
GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) ist eine automatisierte Plattform für die Entdeckung und Optimierung von Enzym-Cocktails für Biomasse Abbau. Es kann zu mehreren Rohstoffen und Mischungen von Enzymen, die mehrere Komponenten angepasst werden.
Other articles by Goutami Banerjee on PubMed
Hydrophobins Sc3 Und Sc4 Genexpression in Grabhügel, Fruchtkörper Und Vegetative Hyphen Von Gemeiner Spaltblättling
Ein anormales Wachstum Formular mit dem Namen Hügel hat die Hypothese wurde eine Neubildungen in der filamentösen Pilz Gemeiner Spaltblättling zu sein. Eine alternative Hypothese ist, dass Hügel einige ungewöhnliche Entwicklungsstörungen Form in der Fruchtkörper Körper morphogenetische Weg darstellen. Hydrophobin Proteine wurden in Fruchtkörper gefunden, wo sie die Oberfläche des Gas-Austausch-Poren und Funktion, um die Poren hydrophob halten Linie. Um mögliche Beziehungen zwischen Grabhügel und Fruchtkörper weiter zu bestimmen, wurde die Hügel Gewebe für Gas-Austausch-Poren und das Vorhandensein von Hydrophobins untersucht. Cryoscanning Elektron mikroskopische Bilder ergab das Vorhandensein von Kanälen im Hügel Gewebe und präsumtiven Hydrophobin Pellets ähnlich wie die Luftkanäle im Fruchtkörper. Hydrophobin Genexpression wurde auch gemessen in Hügel Gewebe mit quantitativen Echtzeit-PCR und zeigten beide Monokaryotic und dikaryotic Hügel Gewebe stellte hohe Expression des dikaryotic bestimmte Sc4 Hydrophobin Gens. Im Gegensatz dazu war Sc4 Hydrophobin Ausdruck im Monokaryotic Fruchtkörper kaum nachweisbar. Die Expression von Sc4 Hydrophobin Genen in Hügeln schlägt Hügel Entwicklung dieser Aspekt des dikaryotic Fruchtgemüse Entwicklungsstörungen Signalweges verwendet.
Synthetisches Enzym-Mischungen Für Biomasse Dekonstruktion: Produktion Und Optimierung Des Kernes Festgelegt
Die hohe Kosten der Enzyme ist ein Engpass, der die Entwicklung einer wirtschaftlich tragfähige Lignozellulose-Ethanol-Industrie zu verhindern. Kommerzielle Enzym-Cocktails für die Umwandlung der pflanzlichen Biomasse in gärfähige Zucker sind komplexe Mischungen, die mehr als 80 Proteine suboptimale Aktivitäten und relative Anteile. Als Schritt zur Entwicklung einer effizienteren Enzym cocktail für Biomasse-Konversion entwickelten wir eine Plattform, genannt GENPLAT, das Roboter-liquid-Handling und statistisch valide experimentelles Design verwendet, um synthetische Enzym Mischungen zu analysieren. Kommerzielle Enzyme (Accellerase 1000 +/-Multifect Xylanase) und Spezyme CP +/-Novozyme 188 wurden verwendet, um das System zu testen und dienen als vergleichenden Benchmarks. Mit Ammoniak-Faser Erweiterung (AFEX) vorbehandelt Mais Stover Boden 0,5 mm und ein Glucan-Laden von 0,2 %, ein Enzym-Laden von 15 mg Protein/g Glucan und 48 h Verdauung bei 50 Grad C, veröffentlichten kommerzielle Enzyme 53 % und 41 % der verfügbaren Glukose und Xylose, beziehungsweise. Mischungen von drei, fünf und sechs reine Enzyme Trichoderma-Arten, ausgedrückt in Pichia Pastoris, wurden systematisch optimiert. Statistische Modelle wurden für die Optimierung der Glukose allein, Xylose allein und der Durchschnitt der Glukose + Xylose für zwei Verdauung dauern, 24 und 48 h entwickelt. Die daraus resultierenden Modelle waren statistisch signifikant (P < 0,0001) und eine optimale Zusammensetzung für Glukose Release angegeben (Werte für optimierte Xylose Release sind in Klammern) von 29 % (5 %) Cellobiohydrolase 1, 5 % (14 %) Cellobiohydrolase 2, 25 % (25 %) Endo-beta1, 4-Glucanase 1, 14 % (5 %) Beta-Glukosidase 22 % (34 %) Endo-beta1, 4-Xylanase 3 und 5 % (17 %) Beta-Xylosidase innerhalb von 48 h bei einer Protein-Belastung von 15 mg/g-Glucan. Vergleich von zwei AFEX-behandelter Mais Stover Präparate Boden zu verschiedenen Teilchen Größen angegeben, dass die Partikelgröße (100 vs. 500 Microm) macht einen großen Unterschied in Gesamt Verdaulichkeit. Der Assay-Plattform und die optimierte "Core" gemeinsam als Ausgangspunkt für die schnelle Prüfung und Optimierung der alternativen Kern Enzyme aus anderen mikrobiellen und rekombinanten Quellen ebenso wie für das Testen von "Zubehör" Proteine für die Entwicklung überlegener Enzym-Mischungen für Biomasse-Konvertierung.
Synthetische Mehrkomponenten-Enzym-Mischungen Für Dekonstruktion Von Lignocellulose
Eine hoher Durchsatz Enzym Assay-Plattform, genannt GENPLAT, wurde verwendet, um die Entwicklung eine optimierte Mischung aus einzelnen gereinigten Enzyme aus zehn "Zubehör" und sechs "Kern" Enzyme zu lenken. Enzym-Mischungen wurden für die Version von Glu, Xyl, oder eine Kombination beider aus Mais Stover vorbehandelt durch Ammoniak-Faser-Expansion (AFEX) optimiert. Assay-Bedingungen waren eine feste Enzym-Laden von 15 mg/g-Glucan, 48 h Verdauung, 50 Grad C. fünf der zehn getestet Zubehör Proteine verbesserte Glu oder Xyl Ausbeute im Vergleich zu den Core set allein und fünf nicht. Eine 11-Komponenten-Mischung, die den Kern festgelegt und fünf Zubehör Enzyme, optimiert für Glu freigegeben 52,1 % der verfügbaren glu, im Vergleich zu 38,5 % mit dem Core set allein. Eine Mischung, optimiert für Xyl veröffentlicht 39,9 % des Xyl, verglichen mit 26,4 % mit dem Core set allein. Wir prognostizieren, dass es noch erhebliche Möglichkeiten für weitere Verbesserung der synthetische Mischungen gibt. Darüber hinaus gilt die hier beschriebene Strategie für die Entwicklung von effizienteren Enzym-Cocktails für jede Vorbehandlung/Biomasse-Kombination und zum Erkennen von Enzymen, die einen bisher unbekannten Lignocellulose Dekonstruktion Beitrag.
Rasche Optimierung Der Enzym-Mischungen Für Dekonstruktion Der Vielfältigen Vorbehandlung/Biomasse-Feedstock-Kombinationen
Enzyme für Pflanze Zellwand Dekonstruktion sind einen hohen Kostenfaktor bei der Herstellung von Ethanol aus Lignocellulose. Das Ziel dieser Forschung war, optimierte synthetische Mischungen von Enzymen für mehrere Vorbehandlung/Substrat-Kombinationen, die mit unseren Hochdurchsatz-Biomasse-Verdauung-Plattform, GENPLAT, robot, handling, Statistische Versuchsplanung und automatisierte Glc und Xyl Assays Flüssigkeit kombiniert zu entwickeln. Proportionen der sechs Kern Pilz Enzyme (CBH1, CBH2, EG1, β-Glucosidase, ein GH10 Endo-β1 4-Xylanase und β-Xylosidase) wurden optimiert, bei einer festen Enzym Laden von 15 mg/g-Glucan Freilassung der Glc und Xyl von allen Kombinationen von fünf Biomasse Rohstoffen (Mais Stover, Switchgrass, Miscanthus, getrocknete Brenner Körner plus Mehlen [DDGS] und Pappel) drei Alkali Vorbehandlungen unterworfen (AFEX, verdünnten Base [0,25 % NaOH] und Alkali Peroxid [AP]). Eine 16-Komponenten-Mischung, bestehend aus der Core set plus 10 Zubehör Enzyme wurde für drei Vorbehandlung/Substrat-Kombinationen optimiert. Ergebnisse wurden mit der Leistung von zwei kommerzielle Enzyme (Accellerase 1000 und Spezyme CP) an die gleiche Protein-Belastungen verglichen.
Alkali Peroxid Vorbehandlung Von Mais Stover: Auswirkungen Der Biomasse, Peroxid, Und Enzym-Belastung Und Zusammensetzung Auf Erträge Aus Glukose Und Xylose
Vorbehandlung ist ein entscheidender Schritt bei der Umwandlung von Lignocellulose in vergärbaren Zucker. Obwohl viele Vorbehandlung Prozesse derzeit untersucht werden, sind keine von ihnen völlig zufriedenstellend in Bezug auf Wirksamkeit, Kosten und Umweltauswirkungen. Die Verwendung von Wasserstoffperoxid bei pH 11.5 (alkalisches Wasserstoffperoxid (AHP)) wurde von Gould und Kollegen eine wirksame Vorbehandlung von Gras Stovers und anderen pflanzlichen Materialien im Zusammenhang mit Ernährung und Ethanol Tierproduktion gezeigt. Unserer früheren Experimente zeigten, dass die AHP durchgeführt, auch im Vergleich gegen zwei andere alkalischen Vorbehandlungen. Hier erforschten wir mehrere wichtige Parameter um das Potenzial der AHP für weitere Verbesserungen für Lignozellulose-Ethanol-Produktion zu testen.
Biochemische Und Molekulare Charakterisierung Der Sezernierte α-Xylosidase Aus Aspergillus Niger
Α-Linked Xylose ist ein wichtiger Bestandteil des Xyloglucans in die Zellwände höherer Pflanzen. Ein α-Xylosidase (AxlA) wurde von einem kommerziellen Enzymzubereitung aus Aspergillus Niger gereinigt und das Codierung gen identifiziert wurde. Das Protein ist Mitglied der Glycosyl-Hydrolase-Familie 31. Es war auf p-Nitrophenyl-α-d-Xyloside, Isoprimeverose, Xyloglucan Heptasaccharide (XXXG) und Tamarind Xyloglucan aktiv. Wenn in Pichia Pastoris ausgedrückt, hatte AxlA Aktivität vergleichbar mit nativen Enzyms auf pNPαX und IP-trotz der scheinbaren Hyperglycosylation. Das pH-Optimum von AxlA war zwischen 3.0 und 4.0. AxlA zusammen mit β-Glucosidase depolymerized Xyloglucan Heptasaccharide. Eine Kombination von AxlA, β-Glucosidase, Xyloglucanase und β-Galaktosidase in die optimalen Proportionen der 51:5:19:25 oder 59:5:11:25 könnte völlig Tamarind XG Glc oder Xyl, bzw. freien depolymerize. Zu den besten unseres Wissens ist dies die erste Charakterisierung von einem sezernierte mikrobielle α-Xylosidase. Sezernierte α-Xylosidases scheinen selten in der Natur zu sein, Seins abwesend aus anderen getestet kommerzielle Enzym-Mischungen und aus der Genome der meisten filamentöse Pilze.
Scale-Up Und Integration Der Alkalische Wasserstoff Peroxid Vorbehandlung, Enzymatische Hydrolyse Und Ethanolische Gärung
Alkalische Wasserstoff-Peroxid (AHP) hat mehrere attraktive Features wie eine Vorbehandlung in der Lignozellulose Biomasse-Ethanol-Pipeline. Hier wurde die Machbarkeit der Aufstockung des AHP-Prozess und die Integration in Enzymatische Hydrolyse und Gärung studiert. Mais Stover (1 kg) wurde unsachgemäß AHP Vorbehandlung, enzymatisch hydrolysiert, und das resultierende Zucker zu Ethanol vergoren. Der AHP-Vorbehandlung erfolgte bei 0,125 g H(2) O(2)/g Biomasse, 22 ° C und Atmosphärendruck für 48 h mit periodischen pH-Wert nachjustieren. Die Enzymatische Hydrolyse erfolgte im gleichen Reaktor nach pH-Neutralisierung der Biomasse-Slurry und ohne Waschen. Nach 48 h waren Glukose und Xylose Renditen 75 % und 71 % der theoretischen maximalen. Sterilität wurde während der Vorbehandlung und Enzymatische Hydrolyse ohne den Einsatz von Antibiotika aufrechterhalten. Während der Gärung mit einen Glukose und Xylose-Nutzung Stamm von Saccharomyces Cerevisiae wurden alle Glc und 67 % der die Xyl in 120 h konsumiert. Der endgültige Äthanol-Titer war 13,7 g/L. Behandlung der enzymatischen-Hydrolisat mit Aktivkohle vor der Gärung hatte kaum Auswirkungen auf Glc Gärung aber deutlich bessere Auslastung der Xyl, vermutlich wegen des entfernten lösliche aromatische Inhibitoren. Die Ergebnisse zeigen, dass die AHP ist leicht skalierbar und kann mit Enzym-Hydrolyse und Gärung integriert werden. Im Vergleich zu anderen führenden Vorbehandlungen für Lignocellulose, hat AHP potenzielle Vorteile hinsichtlich der Kapitalkosten, Prozess-Einfachheit, Feedstock Handhabung und Kompatibilität mit enzymatischen Dekonstruktion und Gärung. Biotechnol. Bioeng. © 2011 Wiley-Zeitschriften, Inc.
