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Articles by Goutami Banerjee in JoVE
JoVE Bioengineering
GENPLAT：バイオマスの酵素の発見とカクテルの最適化のための自動化プラットフォーム
1DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, 2DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University
GENPLAT（GLBRC酵素のプラットフォーム）は、バイオマスの分解のための酵素カクテルの発見と最適化のための自動化されたプラットフォームです。それは、複数のコンポーネントが含まれている酵素の複数の原料と混合物に適合させることができます。
Other articles by Goutami Banerjee on PubMed
Hydrophobins Sc3、Sc4 遺伝子発現の古墳、子実体の L-の栄養菌糸。
マウンドと呼ばれる異常成長フォームよう糸状菌の l-で悪性度の腫瘍に仮定されました。代替仮説マウンズいくつか異常な発育形式の子実体形成経路を表すことです。Hydrophobin タンパク質は、彼らの線の表面のガス交換毛穴と毛穴が疎水性維持機能の子実体発見されています。さらに古墳と子実体の可能な関係を決定するには、ガス交換毛穴と hydrophobins のプレゼンスのマウンド組織を調べた。Cryoscanning 電子顕微鏡画像マウンド組織と推定 hydrophobin rodlets と同様に子実体の空気のチャネルのチャネルの存在を明らかにしました。Hydrophobin 遺伝子発現されもマウンド組織定量的リアルタイム PCR を用いた測定、両方 monokaryotic を示したし、dikaryotic マウンド組織 dikaryotic 特定 Sc4 hydrophobin 遺伝子の高発現を出展しました。対照的に、Sc4 hydrophobin 式 monokaryotic 子実体かろうじて検出可能でした。マウンズにおける Sc4 hydrophobin 遺伝子の発現はマウンド開発 dikaryotic の結実の発達経路のこの側面を使用して示唆しています。
バイオマスの脱構築のための合成酵素混合物：コアセットの制作と最適化
酵素の高コストが経済的に実行可能なリグノセルロースエタノール産業の発展を妨げる大きなボトルネックになります。発酵性糖に植物バイオマスの変換のための市販の酵素カクテルは、次善の活動や相対的な割合の80以上のタンパク質を含む複雑な混合物である。バイオマス変換のためのより効率的な酵素カクテルの開発に向けてのステップとして、我々は、ロボット液体ハンドリングと合成酵素の混合物を分析する統計的に有効な実験デザインを使用してGENPLATと呼ばれるプラットフォームを開発しました。市販の酵素（Accellerase 1000 + / - Multifectキシラナーゼ、およびSpezyme CP + / - Novozyme 188）は、システムをテストし、比較ベンチマークの役割を果たすために使用された。 0.5ミリメートルと0.2％のグルカンの読み込み、15 mgタンパク質/ gのグルカン、および50℃で48時間の消化酵素のローディングにアンモニア繊維拡張（AFEX）前処理したトウモロコシの茎葉のグランドを使用して、市販の酵素は53％と41をリリースそれぞれ利用可能なグルコースとキシロースの％。 3の混合物、5、およびピキア·パストリスで発現しトリコデルマ種の6純粋な酵素は、体系的に最適化された。統計モデルは、単独でのグルコースの最適化のために開発された、単独でキシロース、二つの消化期間、24および48時間のグルコース+キシロースの平均。結果のモデルは、統計的に有意であった（P <0.0001）、29％のグルコース放出のための最適組成（最適化キシロースリリースの値はカッコ内）（5％）セロビオヒドロラーゼ1、5％（14％）セロビオヒドロラーゼ2を示し、25％ （25％）48エンド-β1,4-グルカナーゼ1、14％（5％）、β-グルコシダーゼ、22％（34％）遠藤-β1,4-キシラナーゼ3、および5％（17％）β-キシロシダーゼ15 mg / gでグルカンのタンパク質負荷のH。異なる粒子サイズには2つのAFEX処理トウモロコシの茎葉の準備グランドの比較は、粒径（100対500マイクロモル）が合計消化率に大きな違いがあることが示された。アッセイプラットフォームと最適化された "コア"は他の微生物と組換えのソースからだけでなく、バイオマスのための優れた酵素混合物の開発のための "アクセサリ"タンパク質のテストのための代替のコア酵素の迅速なテストと最適化の出発点を提供して一緒に設定変換。
リグノセルロース系バイオマスの脱構築のための合成多成分酵素混合物
GENPLATと呼ばれるハイスループット酵素アッセイプラットフォームは、10 "アクセサリ"と6 "コア"から、個々の酵素が精製酵素の最適化された混合物の開発を導くために使用されていました。酵素混合物は、グルタミン酸、キシロース、またはアンモニア繊維拡張（AFEX）で前処理したトウモロコシの茎葉からの二つの組み合わせのリリース用に最適化された。アッセイ条件は、固定15 mg / gでグルカンの酵素の読み込み、48時間消化し、10テストされたアクセサリー蛋白質強化されたGluまたはキシロースの50℃で5つのコアが単独で設定し、5つはなかったに比べて収率であった。コアセットとGluのために最適化された5アクセサリー酵素を含む11成分混合物は、単独で設定するコアと38.5パーセントに比べて、利用可能なGluの52.1パーセントをリリースしました。キシロースに最適化された混合物は、単独で設定するコアと26.4パーセントに比べて、キシロースの39.9パーセントをリリースしました。我々は合成混合物の更なる向上のためにかなりの機会がまだあると予測している。さらに、ここで説明する戦略は、任意の前処理/バイオマスの組み合わせおよびリグノセルロースの解体に従来認識されていない貢献をして酵素を検出するためのより効率的な酵素カクテルの開発にも適用可能である。
多様な前処理/バイオマス原料の組み合わせの脱構築のための酵素混合物の迅速な最適化
植物細胞壁の解体のための酵素は、リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産の主要なコストです。本研究の目的は、ロボット液体ハンドリング、統計的実験計画および自動化されたグルコースとキシロースのアッセイを組み合わせた当社の高スループットバイオマス消化プラットフォーム、GENPLATを使用して、複数の前処理/基板の組み合わせに最適化された酵素の合成混合物を開発することでした。 6つのコア真菌酵素（CBH1、CBH2、EG1、β-グルコシダーゼ、GH10エンド-β1,4-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ）の割合は、グルコースの放出を15 mg / gでグルカンの固定酵素負荷で最適化され、 3アルカリ前処理（AFEX、希塩基[0.25％のNaOH]とアルカリ性過酸化物[AP]）に付し、5バイオマス原料のすべての組み合わせからXYL（トウモロコシの茎葉、スイッチグラス、ススキ、乾燥蒸留 '穀物に加え、可溶物[DDGS]とポプラ） 。 16成分混合物のコアセットを含むプラス10アクセサリー酵素は、3つの前処理/基板の組み合わせに最適化されています。結果は、同じタンパク質の負荷二つの市販の酵素（Accellerase 1000 Spezyme CP）の性能と比較した。
トウモロコシの茎葉のアルカリ性過酸化物前処理：グルコースとキシロースの収率でバイオマス、過酸化物、および酵素のロードと組成の影響
前処理は、発酵性糖のリグノセルロースの変換の重要なステップです。多くの前処理プロセスは現在調査中であるが、それらのどれも有効性、コスト、環境への影響に関し、完全に満足のいくものではありません。 pHは11.5（アルカリ性過酸化水素（AHP））での過酸化水素の使用は、動物の栄養とエタノール生産のコンテキスト内で草stoversおよび他の植物材料の効果的な前処理であることがグールドや同僚によって示された。我々の以前の実験では、他の2つのアルカリ前処理と比較したときにAHPがうまく行われていることが示された。ここでは、リグノセルロース系エタノールの生産に関連するさらなる改善のためのAHPの可能性をテストするために、いくつかの重要なパラメータを検討した。
生化学的および分子生物学的分泌された α-キシロシダーゼ コウジカビ ニジェールからの。
Α リンク キシロース キシログルカン高等植物の細胞壁内の主要なコンポーネントです。Α-キシロシダーゼ (AxlA) コウジカビ ニジェールから市販酵素の準備から精製した、エンコーディングの遺伝子が発見されました。タンパク質は、グリコシルトレハ ロース加水分解酵素ファミリー 31 のメンバーです。P-ニトロフェニル-α-d-キシロシド、isoprimeverose、キシログルカン heptasaccharide (ユニコーンガンダム)、タマリンド キシログルカンにアクティブだった。・組成分析で表明したときに、AxlA pNPαX と IP にネイティブ酵素にもかかわらず明白な hyperglycosylation に匹敵する活動をしていた。AxlA の pH 最適 3.0 と 4.0 の間だった。AxlA β-グルコシダーゼと共にキシログルカン heptasaccharide を depolymerized。Β-グルコシダーゼ、xyloglucanase、AxlA、51:5:19:25 または 59:5:11:25 の最適な比率の β ガラクトシダーゼの組み合わせは、完全にタマリンド Glc または Xyl、それぞれ無料 XG 耳下腺でした。我々 の知識の限りでは、これは分泌された微生物 α-キシロシダーゼの最初の特性です。分泌された α-xylosidases 表示される自然の中でまれに、他を欠席されてテスト市販酵素の混合物と最も糸状菌のゲノムから。
アルカリ性過酸化水素前処理、酵素加水分解し、エタノール発酵のスケールアップと統合
アルカリ性過酸化水素（AHP）は、リグノセルロース系バイオマスからエタノールパイプラインの前処理など、いくつかの魅力的な機能を備えています。ここでは、AHPプロセススケールアップと酵素加水分解と発酵との統合の可能性を検討した。トウモロコシの茎葉は、（1キロ）酵素的に加水分解し、AHP前処理を施し、得られた糖は、エタノールに発酵させた。 AHPの前処理は、0.125グラムH（2）O（2）/ gのバイオマス、22°C、および定期的なpHの再調整と48時間のために大気圧下で行われた。酵素加水分解は、バイオマススラリーの同原子炉は、次のpH中和や洗濯せずに行われた。 48時間後、グルコースおよびキシロース収率は75％、理論上の最大値の71％であった。不妊は、抗生物質を使用せずに、前処理と酵素加水分解の間に維持されていた。 Saccharomyces cerevisiaeのグルコースとキシロース資化株を用いて発酵中に、グルコースとキシロースの67％のすべてが120時間で消費されました。最終エタノール価は13.7グラム/ Lであった。発酵前に活性炭の酵素加水分解物の治療は、グルコースの発酵にはほとんど影響はなく、可溶性芳香族阻害剤の除去によるものであろうキシロースの著しく改善率を持っていた。結果は、AHPが容易にスケーラブルであり、酵素加水分解と発酵と統合することができますことを示しています。リグノセルロース系バイオマスの他の主要な前処理に比べ、AHPは、資本コスト、プロセスの簡素化、原料処理、および酵素の解体と発酵との互換性に関する潜在的な利点を持っています。バイオテクノロジー。 Bioeng。 ©2011ワイリー雑誌株式会社
