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Articles by Greg S. Wardle in JoVE
JoVE General
PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine RNA binding
1Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, 2Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 3Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 4Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 5Genomics Resource Center, Rockefeller University
Trascrizioni di RNA sono soggetti ad ampie regolamentazione posttranscriptional che è mediato da una moltitudine di trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Qui vi presentiamo un metodo generalizzabile per identificare con precisione e trascrittoma su scala i siti di legame di RNA RBPs.
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Nucleazione, Propagazione E Scissione Della Destinazione RNAs in Fa Tacere Complessi
L'attività di sezionamento del RNA-induced silencing complex risiede all'interno della sua componente Argonaute (fa), in cui il dominio PIWI fornisce i residui catalitici direttivo guida-filo mediata scissione site-specific di target RNA. Qui riportiamo su strutture di complessi ternari di Thermus thermophilus fa catalitici mutanti con 5'-fosforilato guida di 21 nucleotidi del DNA e RNAs destinazione complementare di 12, 15 e 19 nucleotidi di lunghezza, che definiscono le basi molecolari per la scissione site-specific Mg(2+) agevolato del bersaglio. Osserviamo movimenti pivot-come dominio entro il patibolo fa sul procedimento da nucleazione a passi di propagazione della formazione duplex guida-target, con tracolla duplex oltre un giro dell'elica che richiedono il rilascio di 3'-estremità della guida da tasca PAZ. Dosaggi di clivaggio su obiettivi di varie lunghezze supportato questo modello e fili di zucchero-fosfato-spina dorsale-modifica destinazione ha mostrati l'importanza di strutturali e catalitici bivalenti ioni metallici e osservate delle strutture di cristallo.
Transcriptome Identificazione Dei Siti Di RNA-binding Protein E MicroRNA Bersaglio Da PAR-CLIP
Trascrizioni di RNA sono soggetti a regolazione genica posttranscriptional coinvolgendo centinaia di RNA-binding proteins (RBPs) e microRNA contenenti complessi ribonucleoproteina (miRNPs) espressi in modo dipendente dal tipo di cellula. Abbiamo sviluppato un approccio basato sulle celle reticolazione per determinare a livello transcriptome e ad alta risoluzione i siti di legame di RBPs cellulare e miRNPs. I siti di reticolati sono rivelati da timidina a transizioni citidina in cDNAs preparato da immunopurified RNPs di cellule 4-thiouridine-trattati. Abbiamo determinato i siti di legame e conseguenze normative per diversi RBPs intensamente studiato e miRNPs, tra cui PUM2, QKI, IGF2BP1-3, 4-fa/EIF2C1 e TNRC6A-C. Il nostro studio è emerso che questi fattori legano migliaia di siti che contengono motivi di sequenza definita e hanno preferenze distinte per untranslated esonico versus intronic o codifica versus regioni di trascrizione. La precisa mappatura dei siti di legame attraverso il trascrittoma sarà fondamentale per l'interpretazione dei dati rapidamente emergenti sulla variazione genetica tra individui e come tali variazioni contribuiscono a malattie genetiche complesse.
