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Articles by Greg S. Wardle in JoVE
JoVE General
PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN
1Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, 2Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 3Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 4Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 5Genomics Resource Center, Rockefeller University
Transcripciones de ARN están sujetas a numerosas normas posttranscriptional que está mediada por una multitud de trans-acción ARN-proteínas de unión (prácticas comerciales restrictivas). Aquí presentamos un método generalizable para identificar con precisión y en una escala de transcriptoma en todo los sitios de unión a ARN de las prácticas comerciales restrictivas.
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La Nucleación, Propagación Y Escisión De ARN Diana En El Complejo Hace Silencios
La actividad del complejo rebanadora silenciamiento de ARN inducida reside dentro de su Argonauta (Hace) componente, en el que el dominio PIWI proporciona los residuos catalíticos que rigen guía-hebra mediada específica del sitio de escisión de ARN diana. Aquí nos informe sobre las estructuras de los complejos ternarios de Thermus thermophilus Hace mutantes catalíticos con 5'-fosforilados ADN guía de 21 nucleótidos y ARN complementarios de destino de los 12, 15 y 19 nucleótidos de longitud, que definen la base molecular de Mg (2 +) - facilitado específica del sitio de escisión de la diana. Observamos como los movimientos de pivote de dominio dentro del andamiaje Hace procedentes de la nucleación en los pasos de propagación de la formación de dúplex guía de destino, con zippering dúplex de más de un giro de la hélice que requiere la liberación del extremo 3 'de la guía del bolsillo PAZ . Ensayos de desdoblamiento de los objetivos de diferentes longitudes apoyado este modelo, y el azúcar-fosfato-la columna vertebral modificados hebras objetivo de manifiesto la importancia de los iones metálicos para uso estructural y catalítico divalentes observados en las estructuras cristalinas.
Transcriptoma En Toda La Identificación De La Proteína De Unión Al ARN Y Los Sitios De Destino MicroARN Por PAR-CLIP
Las transcripciones de ARN están sujetos a la regulación de genes postranscripcional que participaron cientos de ARN-proteínas de unión a las prácticas comerciales restrictivas () y que contienen complejos de microARN-ribonucleoproteína (miRNPs) expresados en forma de células de tipo dependiente. Hemos desarrollado un enfoque reticulación a base de células para determinar en alta resolución y en todo el transcriptoma de los sitios de unión de las prácticas comerciales restrictivas y miRNPs celulares. Los sitios reticuladas son reveladas por timidina a las transiciones de citidina en los ADNc preparadas a partir de immunopurified RNPs de 4-tiouridina células tratadas. Se determinaron los sitios de unión y las consecuencias reglamentarias para varias prácticas comerciales restrictivas intensamente estudiados y miRNPs, incluyendo PUM2, QKI, IGF2BP1 3, AGO/EIF2C1-4 y TNRC6A-C. Nuestro estudio reveló que estos factores se unen miles de sitios que contengan la secuencia de motivos definidos y tienen distintas preferencias de exonic contra intrónica o codificación en comparación con las regiones no traducidas de transcripción. La asignación exacta de los sitios de unión de todo el transcriptoma será fundamental para la interpretación de los datos que emergen rápidamente sobre la variación genética entre los individuos y cómo estas variaciones contribuyen a enfermedades genéticas complejas.
