Caracterización De Los Genes De Globina Embrionarias Del Pez Cebra

Developmental Biology. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12618133

La hemoglobina de conmutación es un proceso complejo por el cual las cadenas de globina distintos se producen durante las fases de desarrollo. En un esfuerzo para caracterizar el proceso de la hemoglobina de conmutación en el sistema modelo de pez cebra, hemos aislado y caracterizado varios genes de globina embrionarias. Los genes de globina embrionarias y adultas se encuentran en grupos en una configuración de cabeza a cabeza. Un grupo de genes embrionarios y adultos se localiza en la vinculación del grupo 3, mientras que otro grupo de embriones se localiza en el grupo de ligamiento 12. Varios genes de globina embrionarias demuestran un patrón de erythroid específicos de expresión durante la embriogénesis temprana y más tarde son regulados a la baja definitiva en la hematopoyesis ocurre. Se utilizó la espectroscopia de masas por electrospray para correlacionar los genes de globina y expresión de proteínas en el desarrollo embrionario las células rojas. La mutación, Zinfandel, tiene una anemia microcítica hipocrómica como un embrión, pero más tarde se recupera en la edad adulta. Los mapas genéticos zinfandel a un grupo de vinculación 3 cerca del locus globina de genes, lo que sugiere que Zinfandel representa un defecto de globina embrionaria. Nuestros estudios son los primeros en evaluar sistemáticamente las globinas embrionarias en el pez cebra y en última instancia, será útil en la evaluación de pez cebra mutantes con defectos en la producción de hemoglobina y el cambio.

Desorción/ionización En Espectrometría De Masas De Tiempo De Vuelo/tiempo-de-vuelo De Silicio

Analytical Chemistry. May, 2003  |  Pubmed ID: 12918997

Desorción/ionización en silicio (DIOS) tiempo de vuelo (TOF/TOF) espectrometría total en tándem (MS) proporciona alta exactitud y obtener información significativa fragmentación, particularmente en la caracterización de biomoléculas. DIOS TOF/TOF ofrece una plataforma de alto rendimiento basadas en superficie ionización como fragmentación completa a través de energías de colisión alta. La ausencia de interferencias de la matriz en DIOS permite el análisis de MS y MS/MS de pequeñas moléculas muy por debajo de la m/z 300. Además, la preparación de la muestra es mínima, y las virutas DIOS pueden almacenarse y reanalizadas para información de fragmentación o las medidas exactas de la masas. Las ventajas combinadas de robustez, preparación de la muestra mínima, buena sensibilidad, alto rendimiento y capacidad de secuenciación hacen DIOS TOF/TOF una poderosa herramienta para la identificación, caracterización y proteína de molécula pequeña.

Arreglo En Espiral Cara a Cara De Las Subunidades De La Sintasa De Animales Los ácidos Grasos

Chemistry & Biology. Dec, 2004  |  Pubmed ID: 15610851

El papel de los beta-ketoacyl synthase dominios en la dimerización de las subunidades de residuo 2505 del animal multifuncional FAS ha sido evaluado por una combinación de reticulación y caracterización de varias formas truncadas de la proteína. Polipéptidos que contiene solamente el N-terminal 971 residuos pueden formar dímeros, pero no falta sólo el dominio N-terminal residuo 422 beta-ketoacyl synthase de polipéptidos. Subunidades de FAS se puede reticular con longitudes de espaciador tan cortos como 6 A través de residuos de cisteína diseñados cerca de la terminal de N de los polipéptidos de larga duración. La proximidad de los dominios de synthase beta-ketoacyl N-terminal y su papel fundamental en la dimerización es consistente con un modelo revisado para los FAS, en los cuales un arreglo cara a cara de dos subunidades en espiral facilita interacciones funcionales entre el synthase beta-ketoacyl dimérico y los dominios de proteína acilo portador de cada subunidad.

Hacia La Definición Del Proteoma Salival Parótida Humana Y Peptidome: Identificación Y Caracterización Mediante SDS-PAGE 2D, Ultrafiltración, HPLC Y Espectrometría De Masas

Biochemistry. Mar, 2005  |  Pubmed ID: 15723531

Saliva desempeña muchas funciones biológicas, de la lubricación y la digestión a la regulación de la adhesión de bacterias y leucocitos. Para entender las funciones de los componentes individuales y familias de moléculas, es importante identificar proteínas salivales tantos como sea posible. Hacia este objetivo, utilizamos un enfoque proteómico como el primer paso en un análisis global de este importante líquido del cuerpo. Recogimos saliva parótida como la secreción ductal de tres donantes humanos y separados los componentes de proteínas mediante electroforesis bidimensional de gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE 2D). Proteínas en gel de puntos fueron identificadas por la masa de péptido toma de huellas dactilares, y los resultados fueron confirmados por espectrometría total en tándem de péptidos seleccionados. Complementando este enfoque utilizamos ultrafiltración para preparar una fracción de bajo peso molecular de saliva parótida, que analizó directamente o después invirtió separación de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase utilizando enfoques de espectrometría de masa. Análisis de MS de puntos 2D de SDS-PAGE revelaron componentes conocidos de saliva, incluyendo cistatinas, histatins, lisozima e isoformas o fragmentos de alfa-amilasa, albúmina y proteínas ricas en prolina. También descubrimos nuevas proteínas, como varias isoformas de Zn-alfa-2-glicoproteína y proteína de unión a actina secretor. Los análisis de MS de la ultrafiltrado demostraron que la fracción de bajo peso molecular de saliva parótida era rica en péptidos, con nuevos fragmentos de proteínas ricas en prolina y histatins en abundancia. Experimentos utilizando Candida albicans como el organismo de prueba demostró que al menos uno de los péptidos novela tiene actividad antifúngica. Nuestros resultados muestran que la saliva es una fuente rica de proteínas y péptidos que son potenciales dianas diagnósticas y terapéuticas.

Evaluar Los Efectos De La Variación Diurna En La Composición De La Saliva Parótida Humana: Análisis Cuantitativo De Péptidos Nativos ITRAQ Reactivos

Analytical Chemistry. Aug, 2005  |  Pubmed ID: 16053308

Cambios en la composición salival se correlacionan con la susceptibilidad de la enfermedad, el estado de la enfermedad o ambos. Sin embargo, el uso de saliva para propósitos de diagnóstico se complica por los efectos específicos de la glándula del ritmo circadiano o variación diurna. Caracterizamos recientemente un conjunto de péptidos en la < o = fracción de 10 kDa de saliva parótida humana que incluye muchas nuevas especies. En este estudio, utilizamos la novela iTRAQ etiquetado química para investigar posibles efectos diurnos en la generación de péptidos. Recogimos muestras producidas por el estímulo gustativo como las secreciones ductales en cuatro puntos del tiempo en condiciones que minimizan la proteólisis, les agruparon según el tiempo de colección y aislaron de las fracciones de BPM. Las muestras recogidas en cada momento de la colección fueron derivatizadas con un reactivo de diferentes iTRAQ isobárico. Las muestras marcadas fueron combinadas, separadas por HPLC de fase inversa, co-spotted con matriz en objetivos MALDI y analizadas por espectrometría de masas MALDI TOF/TOF. Con este enfoque, logramos cuantificación relativa de los péptidos parótidas en cuatro puntos del tiempo. En varios casos, la abundancia durante el día cambió dramáticamente. Etiquetado iTRAQ mejoró la eficacia de la fragmentación de MS/MS, que a su vez permitió la identificación de varios péptidos novela. Nuestros resultados demuestran tanto la utilidad de este método y la importancia de diurnas efectos sobre la composición de la saliva parótida humana peptidome.

Complejos De Alta Masa Molecular APOBEC3G Restringen Alu Retrotransposition

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Oct, 2006  |  Pubmed ID: 17030807

APOBEC3G (A3G) y Desaminasas desoxicitidina relacionados son factores potentes antirretrovirales intrínseca. A3G se expresa como una forma de enzimáticamente activa baja molecular-masa (LMM) o como un complejo de Ribonucleoproteína enzimáticamente inactivo alta--masa molecular (HMM). Descanso T CD4 células exclusivamente expresa A3G LMM, donde funciona como un factor de restricción postentry potente para VIH-1. Activación de células T CD4 promueve el reclutamiento de LMM A3G por 5 - a 15-MDa HMM complejos cuya función se desconoce. Técnicas de purificación de la afinidad de tándem junto con MS, identificamos gránulos que contienen Staufen RNA-transporte y Ro Ribonucleoproteína complejos como componentes específicos de HMM A3G complejos. Análisis de RNAs en estos complejos reveló Alu y small RNAs Y, dos de los elementos genéticos móviles no autónomos más prominentes en las células humanas. Estos RNAs retroelement son reclutados en los gránulos que contienen Staufen RNA-transporte en presencia de A3G. Retrotransposition de aluminio y hY RNAs depende de la maquinaria de la transcriptasa inversa proporcionada por elementos de nucleótido esparcido largo 1 (L1). Mostramos ahora que A3G inhibe grandemente retrotransposition L1-dependiente de marcada Alu retroelementos no inhibiendo la función de la L1 sino por secuestro Alu RNAs en complejos HMM A3G citoplásmicos de la maquinaria enzimática de L1 nuclear. Estos resultados no autónomos retroelementos Alu y hY se identifican como dianas celulares naturales de A3G y resaltar cómo las diferentes formas de A3G únicamente proteger las células contra las amenazas planteadas por retrovirus exógenos (LMM A3G) y endógenos retroelementos (HMM A3G).

Apolipoproteína E * Dipalmitoilfosfatidilcolina Partículas Son Elipsoidales En Solución

Journal of Lipid Research. May, 2007  |  Pubmed ID: 17308333

Apolipoproteína E (apoE) es un componente de la proteína importante de partículas de lipoproteínas transporte de colesterol en el sistema nervioso central y en el plasma. Polimorfismos de la apoE se asocian con enfermedad cardiovascular y con una predisposición a la enfermedad de Alzheimer y otras formas de neurodegeneración. Para la actividad biológica completa, apoE debe someterse a una partícula de la lipoproteína. Complejos de apoE y fosfolípido imitan muchas de estas actividades. En contraste con un modelo ampliamente aceptado discoidales de apoA-limito a dimyristoylphosphatidylcholine, que se basa en estudios de la solución, un estudio de difracción de rayos x de apoE limitado a dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) indicó que apoE * DPPC partículas son quasi-spheroidal y que el embalaje de la base del fosfolípido es similar a una micela. Con la dispersión de rayos-x de ángulo pequeño, mostramos que apoE * DPPC partículas en solución son elipsoidales y que la forma de la base del fosfolípido es compatible con un modelo de bicapa torcido. El modelo propuesto es consistente con los resultados del análisis de espectrometría de masa de productos de proteólisis limitada. Estos revelaron que las regiones de nonlipid-limite de apoE en la partícula son consistentes con una horquilla alfa helicoidal.

Octomeric Oxidorreductasa De Piruvato-ferredoxina De Desulfovibrio Vulgaris

Journal of Structural Biology. Jul, 2007  |  Pubmed ID: 17400475

Piruvato-ferredoxina oxidoreductatse (ppara obtener) lleva a cabo el paso central en la descarboxilación oxidativa del piruvato a acetil-CoA. Nos hemos purificado esta enzima de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH) como parte de una caracterización sistemática de Complejos Multiproteinas tantos como sea posible para este organismo, y la estructura tridimensional de esta enzima se ha determinado por una combinación de microscopia electrónica (EM), análisis de imagen sola partícula, modelado de homología y acoplamiento molecular computacional. Nuestros resultados muestran que la 1MDa que DVH PFOR complejo es un homo-octomer, o más precisamente, un tetrámero de la forma dimérica de la enzima relacionada encontrada en Desulfovibrio africanus (Da), con el que comparte una identidad de secuencia del 69%. Nuestro modelo de homología del dimer DvH PFOR se basa en la estructura Da para rayos x. Acoplamiento de este modelo en nuestra resolución de 17A EM-reconstrucción de negativamente manchada DvH PFOR octomers sugiere fuertemente que la diferencia en el estado de Oligomerización de las dos especies es debido a la inserción de un residuo valina solo (Val383) dentro de un bucle de la superficie de la enzima DvH. Este estudio demuestra que la estrategia de reconstrucción de resolución intermedia EM junto al modelado de homología y acoplamiento puede ser lo suficientemente potente como para deducir la funcionalidad de residuos de aminoácidos individuales.

El Estudio De La Asociación De Biomolecular Recursos Instalaciones Proteómica Research Group 2006: Cuantificación Relativa De La Proteína

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Aug, 2007  |  Pubmed ID: 17513294

La determinación de diferencias en la abundancia relativa de la proteína es un aspecto vital de la investigación proteómica que se utiliza cada vez más para responder a diversas cuestiones biológicas. El estudio de la Asociación de Biomolecular recursos instalaciones proteómica Research Group 2006 fue un proyecto de proteómica cuantitativa en la que el objetivo fue determinar la identidad y las cantidades relativas de ocho proteínas en dos mezclas. Existen numerosas metodologías disponibles para estudiar la abundancia relativa de proteínas entre las muestras, pero hasta la fecha, hay algunos ejemplos de estudios que compararon estos enfoques diferentes. Para el estudio del grupo de investigación proteómica de 2006, hubo 52 participantes que utilizan una amplia variedad de gel de electroforesis, HPLC y métodos basados en espectrometría de masa para cuantificación relativa. Los datos cuantitativos derivados de este estudio se evaluaron junto con varios otros detalles experimentales pertinentes a las metodologías utilizadas.

Una Estrategia Para Detectar Y Caracterizar Las Actividades De La Proteinasa Endógena En Muestras Biológicas Complejas Basadas En Espectrometría De Masa

Proteomics. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18186022

Proteinasas endógenas en fluidos biológicos como la saliva humana producen un repertorio rico péptido que refleja una combinación única de enzimas, sustratos y los inhibidores/activadores. Por consiguiente, este subproteomas es una interesante fuente de biomarcadores para procesos de la enfermedad que directa o indirectamente involucran proteólisis. Sin embargo, las proteinasas pertinentes, moléculas típicamente muy baja abundancia, son difíciles de clasificar e identificar. Nuestra hipótesis es que una técnica sensible para monitoreo péptido acumulado productos de una manera imparcial, global sería muy útil para detectar y perfilar las actividades proteolíticas en muestras biológicas complejas. Basándose en el uso desde hace mucho tiempo de enfoques isótopo 18O para la clasificación de proteolítica y otros procesos enzimáticos ideamos un nuevo método para la evaluación de proteinasas endógenos. Específicamente, nos demostró que al ex vivo proteinasas endógena de incubación en humano saliva parótida introducido 18O de agua isotópicamente enriquecido en los grupos carboxílicos c-terminal de sus productos de péptido. Determinación de secuencia del péptido posterior y perfiles de inhibidor permitieron la detección de subconjuntos discretos de productos proteolíticos que fueron generados por diferentes enzimas. Como prueba-de-principio utilizamos uno de estas huellas dactilares para identificar la actividad relevante como tejido calicreína. Denomina esta técnica PALeO. Nuestros resultados sugieren que el PALeO es un método rápido y altamente sensible para evaluar globalmente las actividades proteinasa en muestras biológicas complejas.

Una Estrategia "Hanes" Para La Identificación De Los Complejos De La Proteína Estable Genoma Por Multidimensional Ortogonal Cromatográfico Separación E ITRAQ Reactivo De Seguimiento

Journal of Proteome Research. May, 2008  |  Pubmed ID: 18336004

Purificación de la afinidad del tándem es el principal método para purificar e identificar complejos de la proteína estable todo el sistema en células enteras. Aunque altamente eficaz, este método es laborioso y práctico en donde no es posible la manipulación genética de los organismos. Aquí, proponemos una nueva estrategia "Hanes" que combina separación multidimensional de complejos endógenos con la supervisión de espectrometría de masa de su composición. En este procedimiento, se identifican complejos de proteína supuesta basado en la comigration de colecciones de polipéptidos a través de múltiples pasos de separación ortogonal. Presentamos la evidencia de la prueba de principio para la viabilidad de los aspectos clave de esta estrategia. Una mayoría de proteínas de Escherichia coli se muestran a permanecer en complejos estables durante el fraccionamiento de un extracto crudo a través de tres pasos cromatográficos. También demostramos que iTRAQ reactivo basado en seguimiento puede cuantificar migración relativa de polipéptidos a través de los medios de separación cromatográfica. Análisis de LC MALDI MS y MS/MS de los péptidos marcados con iTRAQ dio confiable cuantificación relativa de 37 componentes de 13 complejos conocidos e. coli: 95% de componentes complejos conocidos cerca co-eluted y 57% fueron agrupado automáticamente por un prototipo computacional método de agrupamiento. Con más mejoras tecnológicas en cada paso, creemos que esta estrategia mejorará dramáticamente la eficiencia de la purificación e identificación de complejos de la proteína en las células.

Los Proteomas De Parótida Humana Y Salivas De Glándula Submaxilar/sublingual Recogieron Como Las Secreciones Ductales

Journal of Proteome Research. May, 2008  |  Pubmed ID: 18361515

La saliva es un líquido corporal con funciones importantes en la salud oral y general. Un consorcio de tres grupos de investigación catalogado las proteínas en la saliva humana como las secreciones ductales: 1166 identificaciones--914 en parótida y 917 en saliva submaxilar/sublingual--fueron hechos. Los resultados mostraron que una alta proporción de proteínas que se encuentran en el plasma y/o lágrimas también están presentes en la saliva junto con componentes únicos. Las proteínas identificadas están implicadas en numerosos procesos moleculares que van desde funciones estructurales a actividades enzimáticas/catalíticas. Como era de esperar, la mayoría asignada a los compartimentos extracelulares y secretores. Un enfoque de immunoblot se utilizó para validar la presencia en la saliva de un subconjunto de las proteínas identificadas por métodos de espectrometría de masa. Estos experimentos se centran en nuevos componentes y proteínas para que las pruebas de péptido eran relativamente débil. En definitiva, información derivada del trabajo divulgado aquí y estudios publicados relacionados pueden usarse para pruebas de laboratorio clínico basadas en sangre se traducen en un formato que utiliza la saliva. Además, un catálogo del proteoma salival de individuos sanos permite a futuros análisis de muestras de salivales de individuos con enfermedades orales y sistémicas, con el objetivo de identificar biomarcadores con valor diagnóstico y pronóstico de estas condiciones; otra posibilidad es el descubrimiento de dianas terapéuticas.

Rápida Alteraciones En Los Perfiles De Proteínas Cortical Subyacen Sueño Espontáneo Y Combates De Estela

Journal of Cellular Biochemistry. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 19003977

Los datos existentes indican que sueño-vigilia es un comportamiento esencial. La función o funciones biológica de sueño, sin embargo, permanece desconocida, debido, en parte, a la falta de información disponible a nivel intracelular. Análisis de microarrays preliminares muestran que cambios en el estado de comportamiento influyen en perfiles de mRNA regional; sin embargo, el impacto del sueño en las firmas de la proteína es prácticamente inexplorado. En estos estudios, perfiles de la cortical de la proteína fueron examinados después tiempo episodios de sueño-vigilia espontánea. A minutos de cada comportamiento Estado examinado, se detectaron un pequeño número de puntos que muestra la expresión única. Análisis de espectrometría de masas de puntos relacionados con el sueño y el despertar identifican proteínas relacionadas con múltiples categorías funcionales. Dos proteínas asociadas a dormir más se validaron utilizando un paradigma de la privación de sueño. Se encontraron pruebas preliminares para dos diferentes postranscripcional mecanismos uno (GAPDH) en que se aumentó la cantidad de proteína en el sueño de recuperación tras despertar prolongado, mientras que los otra (actina) sugirió que las modificaciones post-traduccionales pueden subyacer el sueño. Las similitudes entre los efectos del sueño sobre perfiles tanto proteína como mRNA indican que cambios intracelulares dinámicos subyacen a Estados de sueño-vigilia y concuerdan con papeles para dormir en múltiples funciones biológicas.

Ácido-catalizado Oxígeno-18 Etiquetado De Péptidos

Analytical Chemistry. Apr, 2009  |  Pubmed ID: 19243188

En estrategias O etiquetas (18) enzimáticas para proteómica cuantitativa, el intercambio de oxígenos carboxilo en pH bajo es una reacción del lado común, no deseados. Preguntamos si cambio trasero ácido-catalizado pudiera interferir con cuantificación y si la reacción sí mismo podría ser utilizada como método para introducir la etiqueta de (18) O en péptidos. Varios péptidos sintéticos fueron disueltos en ácido diluido que contiene 50% h (18) O (v/v) y se incubaron a temperatura ambiente. Alícuotas fueron durante un período de 3 semanas y analizadas por espectrometría de masas en tándem (MS/MS). (18)Incorporación O cocientes se determinaron mediante análisis de regresión lineal que permitió varias incorporaciones de isótopos estables. En pH bajo, péptidos intercambian sus átomos de oxígeno del carboxilo con el solvente acuoso. Los patrones de isótopo desplazado gradualmente a masas más altas hasta llegar a la esperada distribución binomial en el equilibrio después de aproximadamente 11 días. Velocidades de reacción fueron específicos de residuos y secuencia. Debido a su naturaleza lento, se espera que el cambio trasero ácido-catalizado interferir mínimamente enzimáticos (18) etiquetado O estudios siempre que las condiciones de almacenamiento y análisis de minimizan los tiempos de exposición de pH bajo. Por su parte, ácido-catalizado (18) O etiquetado es una estrategia general de marcado que es una alternativa a la química, metabólica, y enzimático isótopo-etiquetado esquemas actualmente utilizado en proteómica cuantitativa.

El NHE1 Intercambiador Sodio-hidrógeno Es Un Sustrato Akt Necesario Para La Reorganización De Filamentos De Actina Por Factores De Crecimiento

The Journal of Biological Chemistry. Sep, 2009  |  Pubmed ID: 19622752

Los quinasa Akt media en las señales de los receptores del factor de crecimiento para la proliferación celular aumentada, la supervivencia y la migración, que contribuyen a los efectos positivos de Akt en la progresión del cáncer. Los sustratos son generalmente inhibida cuando fosforilada de Akt, sin embargo, se muestra la fosforilación de la membrana plasmática NHE1 intercambiador sodio-hidrógeno por Akt aumenta la actividad del intercambiador (H (+) flujo de salida). Nuestros datos cumplen los criterios para NHE1 es un sustrato de buena fe Akt, incluyendo la fosforilación directa in vitro, utilizando la espectrometría de masas y los anticuerpos fosfo-Akt sustrato para identificar Ser (648) como el sitio de fosforilación de Akt y la pérdida de la fosforilación y la actividad del intercambiador aumentó por la insulina y derivado de plaquetas factor de crecimiento de los fibroblastos que expresan un mutante NHE1-S648A. ¿Cómo Akt induce la remodelación del citoesqueleto de actina para promover la migración celular y la metástasis de células tumorales está claro, pero el desmontaje de las fibras de estrés de actina por el factor de crecimiento derivado de plaquetas y de la insulina y el aumento de la proliferación en el medio de crecimiento se inhiben en los fibroblastos que expresan NHE1-S648A. Podemos predecir que otras funciones compartidas por Akt y NHE1, incluido el crecimiento celular y la supervivencia, pueden ser regulados por el aumento de H (+) flujo de salida.

Encuesta De Complejos De Proteínas Grandes En D. Vulgaris Revela Gran Diversidad Estructural

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Sep, 2009  |  Pubmed ID: 19805340

Se hace un estudio imparcial de los complejos multi-proteína estables, más abundantes de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH) que son más grandes que el Señor aproximadamente 400 k. Las estructuras cuaternarias para 8 de los 16 conjuntos purificados durante este trabajo se determinaron mediante reconstrucción solo partículas de especímenes teñidos negativamente, una tasa de éxito de aproximadamente 10 veces mayor que la de pantallas "Proteómica" anteriores. Además, las composiciones de la subunidad e stoichiometries de los complejos restantes se determinaron por métodos bioquímicos. Nuestros datos muestran que se pueden modelar las estructuras de sólo dos de estos grandes complejos, de los 13 en este conjunto que tienen funciones reconocibles, con confianza, basado en las estructuras de homólogos conocidos. Estos resultados indican que hay mayor variabilidad en la manera que homólogas procariotas complejos macromoleculares se ensamblan que generalmente ha sido apreciado. Por consiguiente, sugerimos que confiar únicamente en previamente determinadas estructuras cuaternarias de proteínas homólogas pueden no ser suficientes para entender correctamente su papel en otra celda de interés.

Un Flujo De Trabajo De Afinidad De Lectina Orientación Glycosite Específicos, Relacionados Con El Cáncer Estructuras De Carbohidratos En La Tripsina Digerido Con Plasma Humano

Analytical Biochemistry. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20705048

Los glicanos son las células específicas del tipo de proteína, modificaciones postraduccionales que se modulan en los procesos de desarrollo y de la enfermedad. Como tal, glicoproteínas son candidatos atractivos biomarcadores. A continuación, describimos una espectrometría de masas basado en flujo de trabajo que incorpora la cromatografía de afinidad de lectina para enriquecer las proteínas que transportan determinadas estructuras de glicano. A medida que aumenta en sialilación y fucosilación destacan entre asociados al cáncer modificaciones, nos centramos en Sambucus nigra aglutinina (SNA) y la lectina Aleuria aurantia (AAL), lectinas que se unen con ácido siálico y las estructuras de fucosa que contienen, respectivamente. Glicopéptidos fucosilados y sialilada de lactoferrina humana sirvieron como controles positivos, y alto contenido en manosa estructuras de invertasa de levadura sirvieron como controles negativos. Las normas se disparó en múltiples sistemas de eliminación de afinidad (MARS) de 14 empobrecido, digerido con tripsina plasma humano de donantes sanos. Las muestras se cargaron en columnas de lectina, separados por HPLC en flujo continuo y fracciones enlazados, y tratados con el péptido N-glicosidasa F para eliminar N-glicanos ligados. Las fracciones peptídicas desglicosiladas fueron interrogados por HPLC-MS/MS ESI. Se identificaron un total de 122 glicoproteínas del plasma humano que contienen 247 glycosites únicas. Es importante destacar que varias de las glicoproteínas observados (por ejemplo, cadherina 5 y neutrófilos lipocalina gelatinasa asociada) normalmente circulan en el plasma a baja nanogramos por mililitro niveles. En conjunto, estos resultados proporcionan la espectrometría de masas basada en la evidencia de la utilidad de la incorporación de la separación lectina-plataformas en las tuberías descubrimiento de biomarcadores de cáncer.

Los Estudios Del Grupo De Investigación ABRF Proteómica: Ejercicios Educativos Para Análisis Cualitativo Y Cuantitativo De La Proteómica

Proteomics. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21394914

Servicios de recursos (base) han desempeñado un papel creciente en el mobiliario de la comunidad científica con instrumentación especializada y experiencia para experimentos de proteómica de manera rentable. La proteómica Research Group (PRG) de la Asociación de Biomolecular recursos instalaciones (ABRF) ha patrocinado una serie de estudios de investigación diseñados para permitir a los participantes a probar nuevas técnicas y evaluar sus capacidades en relación con otros laboratorios de análisis de las muestras de la mismas. Se presentan aquí los resultados de tres estudios PRG que representan diferentes muestras que se analizan normalmente en una instalación de base, que van desde la identificación de proteína simple análisis específicos e incluyen desafíos intencionales para reflejar estudios realistas. El estudio de PRG2008 compara diferentes estrategias para la caracterización cualitativa de proteínas, particularmente la utilidad de los métodos complementarios para la caracterización de truncado formas de proteína. El uso de diferentes enfoques para determinar diferencias cuantitativas para varias proteínas de destino en plasma humano fue el foco del estudio PRG2009. El PRG2010 estudio explorados diferentes métodos para la determinación de componentes específicos al identificar problemas imprevistos que podrían explicar resultados inesperados asociados con las diferentes muestras e incluyen (15) proteínas N-etiquetados como un reto adicional. Estos estudios proporcionan un valioso recurso educativo para laboratorios de investigación y servicios básicos, así como un mecanismo para establecer buenas prácticas de laboratorio.

ABRF-PRG07: Estudio De Proteómica Cuantitativa Avanzada

Journal of Biomolecular Techniques : JBT. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21455478

Un reto para las instalaciones de la base está determinando las diferencias cuantitativas de la proteína a través de muestras biológicas complejas. Aunque existen numerosas técnicas en la literatura para la cuantificación de proteínas relativos y absolutos, la mayoría es usar y puede ser difícil para llevar a cabo con eficacia. Existen pocos estudios que compararon estas tecnologías en cuanto a su precisión, reproducibilidad y precisión, y ningún estudio hasta la fecha trata de rendimiento a través de múltiples laboratorios con variados niveles de conocimientos. Aquí, describimos un estudio de Asociación de Biomolecular recursos instalaciones (ABRF) proteómica Research Group (PRG) basado en muestras compuestas de una mezcla de complejo de proteína en el cual 12 proteínas conocidas se añadieron diferentes pero definen relaciones. Todas las proteínas estaban presentes en la misma concentración en cada uno de tres tubos que fueron proporcionados. El objetivo principal de este estudio era permitirle evaluar sus capacidades y enfoques con respecto a cada laboratorio: detección e identificación de proteínas que se enriquecieron en muestras que también contienen mezclas complejas de proteínas de fondo y determinación de las cantidades relativas de las proteínas con picos. Los resultados devueltos por 43 participantes fueron compilados por la PRG, que también recoge información acerca de las estrategias utilizadas para evaluar el rendimiento general y como una ayuda al desarrollo de protocolos optimizados para las metodologías utilizadas. Los resultados más precisos generalmente fueron reportados por los laboratorios más experimentados. Entre los laboratorios que utilizan la misma técnica, se obtuvieron valores que ocupara la relación esperada por grupos más experimentados.

Automatizado Iterativo Adquisición De MS/MS: Una Herramienta Para Mejorar La Eficiencia De La Identificación De Proteínas Mediante Un Flujo De Trabajo De MS LC-MALDI

Analytical Chemistry. Aug, 2011  |  Pubmed ID: 21761829

Hemos desarrollado una herramienta información dependiente, iterativa de adquisición (IMMA) MS/MS/MS/MS eficiencia, aumentar la cobertura del proteoma y acortar el tiempo de análisis para aplicaciones de la proteómica de alto rendimiento basado en la plataforma MALDI LC MS/MS. El principio subyacente de IMMA es limitar el análisis MS/MS a un subconjunto de iones moleculares que son capaces de identificar un número máximo de proteínas. IMMA reduce redundancia de análisis MS/MS mediante la exclusión de las listas de pico precursor ion proteotypic péptidos derivados de las proteínas ya identificadas y utiliza un algoritmo de predicción del tiempo de retención para limitar el grado de falsas exclusiones. También aumenta la tasa de utilización de espectros de MS/MS mediante la eliminación de objetivos no identificables "bajo valor" como nonpeptides y péptidos grandes cargas de modificaciones, que están marcados por sus relaciones de masa de exceso-a-nominal de "nonpeptide". Para algunas muestras, IMMA aumenta el número de proteínas identificadas por ∼20 - 40% en comparación con los métodos de datos dependientes. IMMA termina una MS/MS corren el punto definido por el operador cuando "costos" (p. ej., tiempo de análisis) comienzan a invadir "beneficios" (p. ej., número de proteínas identificadas), sin conocimiento previo de la muestra contenido y complejidad. Para facilitar el análisis de muestras estrechamente relacionadas, funcionalidad de lista de inclusión de IMMA está actualmente en desarrollo.

Anotación Basada En La Evidencia De Las Transcripciones Y Las Proteínas En La Bacteria Reductora De Sulfato Desulfovibrio Vulgaris Hildenborough

Journal of Bacteriology. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21840973

Utilizamos la secuencia de RNA de microarrays y 5' mosaico de alta resolución para identificar las transcripciones en Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, una bacteria reductora de sulfato de modelo. Identificamos la primera posición del nucleótido de 1.124 transcripciones, incluyendo 54 proteínas con transcripciones sin guía y otro 72 genes para que una transcripción principal inicia dentro del gene proteína-codificación aguas arriba, que confunde las mediciones de la expresión del gen de la aguas arriba. Análisis de la secuencia de estos promotores demostró que d. vulgaris prefiere-10 y -35 cajas distintas de las preferidas por Escherichia coli. Un total de 549 transcripciones terminó en intrínsecas terminadores de (rho independiente), pero la mayoría de las otras transcripciones parecía tener extremos variables. Encontramos bajo nivel expresión antisentido de la mayoría de los genes, y el 5' termina de estas transcripciones asignadas al promotor como secuencias. Porque la expresión antisentido se redujo de genes altamente expresados, sospechamos que alargamiento de transcripciones antisentidas inespecíficas es suprimido por la transcripción de la cadena con sentido. Finalmente, se combinaron los resultados de la transcripción con datos comparativos de análisis y proteómica de 505 modificar a la anotación original de 3.531 proteínas: nos 255 proteínas (7,5%), cambiado 123 codones de inicio (3,6%) y añade 127 proteínas (3,7%) que habían sido perdidas. Datos de mosaico tuvieron mayor cobertura que la escopeta proteómica y por lo tanto, llevaron a la mayoría de las correcciones, pero muchos errores siendo probablemente. Nuestros datos están disponibles en http://genomics.lbl.gov/supplemental/DvHtranscripts2011/.

Péptidos Liberados Por Hendidura Fisiológica De Amiloides De Forma De Proteínas De Coágulo De Semen Que Mejoran La Infección Por El VIH

Cell Host & Microbe. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22177559

Semen sirve como un vehículo para el VIH y promueve la transmisión sexual del virus, que representa la mayoría de los nuevos casos de VIH. El componente principal de semen es el coágulo, una estructura viscosa compuesto predominante de espermatozoides y semenogelin las proteínas. Debido a la actividad de la proteasa de semen PSA, el coágulo es licuado y semenogelins están divididos en fragmentos más pequeños. Aquí, Divulgamos que un subconjunto de estos fragmentos de semenogelin formar fibrillas amiloideas que realzan grandemente la infección por el VIH. Como SEVI, otro fibrilas amiloides previamente identificados en el semen, las fibrillas semenogelin exhiben una superficie catiónica y mejoran la entrada y el accesorio de virión VIH. Mientras que las muestras de semen de individuos sanos mejoran significativamente la infección por VIH, muestras de semen de la deficiencia de semenogelin de pacientes con obstrucción del conducto eyaculatorio son totalmente deficientes en la mejora de la actividad. Semen así alberga distintos amyloidogenic péptidos derivados de proteínas precursoras diferentes que comúnmente mejoran la infección por el VIH y es probable que contribuyen a la transmisión del VIH.

Un Flujo De Descubrimiento De Lectinas Cromatografía/masa Espectrometría Identifica Posibles Biomarcadores Del Cáncer De Mama Agresivo

Journal of Proteome Research. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22309216

Utilizamos un lectina cromatografía/MS-enfoque basado en pantalla acondicionado medio de un panel de luminal (menos agresivo) y triple negativo (más agresivas) líneas de células de cáncer de mama (n = 5/subtipo). Las muestras fueron fraccionadas utilizando las lectinas Aleuria aurantia (AAL) y Sambucus nigra aglutinina (SNA), que reconocen la fucosa y ácido siálico, respectivamente. Las fracciones consolidadas fueron enzimático N-deglycosylated y analizan por LC-MS/MS. En total, se identificaron 533 glicoproteínas, ~ 90% de los cuales eran los componentes de la célula matriz extracelular o superficial. Observamos 1011 único glycosites, 100 de los cuales fueron detectados únicamente en líneas negativas triple ≥ 3. Análisis estadístico indicaron que varios de estos glycosites fueron triple negativo específico y así potenciales biomarcadores para este subtipo de tumor. Un análisis de datos RNAseq reveló que aproximadamente la mitad de los mRNAs de codificación de los andamios de la proteína que lleva a glycosites de biomarcadores potenciales fueron alza en triple negativo frente a líneas celulares luminal, y que un número de genes que codifican Fucosil - o sialiltransferasas fueron expresado diferencialmente entre los dos subtipos, sugiriendo que alteraciones en la glicosilación pueden conducir también identificación de candidatos. En particular, las glicoproteínas de la que se derivan estos candidatos putativos biomarcador participan en procesos relacionados con el cáncer. Así, pueden representar nuevas dianas terapéuticas para este subtipo de tumor agresivo.

Romper El Cuello De Botella En La Tubería De Biomarcadores De Proteínas

Clinical Chemistry. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22140214