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Articles by Halyna R. Shcherbata in JoVE
JoVE General
Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli
Gene Expression and Signaling Research Group, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry
Identificazione dei meccanismi alla base danno muscolare è cruciale. Qui vi presentiamo la tecnica istologica per la preparazione inclusi in paraffina e congelati sezioni dei muscoli toracici Drosophila. Questo permette l'analisi della morfologia muscolare e la localizzazione di proteine e altri componenti delle cellule muscolari.
Other articles by Halyna R. Shcherbata on PubMed
Espressione Fizzy-correlati/Hec1/Cdh1 Tacca-dipendente è Necessaria Per La Transizione Mitotica-a-endocycle in Cellule Del Follicolo Della Drosofila
Durante l'ovogenesi drosofila, funzione di tacca regola il passaggio dal ciclo cellulare mitotica di endocycle in cellule del follicolo in fase 6. Perdita di funzione di tacca o suo ligando Delta (Dl) sconvolge il normale passaggio; Questa perturbazione provoca mitotica ciclismo continuare e conduce ad un fenotipo overproliferation. In questo contesto, la componente unico noto ciclo cellulare che risponde per il pathway di Notch è String/Cdc25 (Stg), un regolatore del ciclo cellulare G2/M. Abbiamo trovato che espressione prolungata della stringa non è sufficiente per mantenere efficientemente le cellule nel ciclo cellulare mitotica passato fase 6, suggerendo che la tacca regola anche altri componenti del ciclo cellulare nella transizione. Utilizzando uno schermo di espressione, abbiamo trovato un componente di questo tipo: Fizzy-correlati/Hec1/Cdh1 (Fzr), una proteina di ripetizione di WD40. FZR regolamenta l'anafase-promozione complesso/cyclosome (APC/C) ed è espresso alla transizione mitotica-a-endocycle in maniera dipendente dalla tacca. Cloni mutanti di Fzr ha rivelato che la Fzr è superfluo per mitosi ma essenziale per endocycles. A differenza di in cloni di tacca, nelle cellule mutanti Fzr mitotica marcatori sono assenti passato fase 6. Solo una riduzione combinata di Fzr ed espressione ectopica di Stg prolunga mitotici cicli nelle cellule del follicolo, suggerendo che questi due regolatori del ciclo cellulare, Fzr e Stg, sono importanti mediatori del percorso tacca nella transizione mitotica a endocycle.
L'interruttore Mitotica-a-endocycle in Cellule Del Follicolo Della Drosofila è Eseguito Da Regolazione Tacca-dipendente Di Transizioni Di Ciclo Cellulare G1/S, G2/M E M/G1
Il Notch signaling pathway controlla la transizione follicolo cellula mitotica a endocycle nella ovogenesi drosofila fermando il ciclo mitotico e promuovere il endocycle. Per capire come il pathway di Notch coordina questo processo, abbiamo identificato ed eseguita un'analisi funzionale di geni la cui trascrizione è reattivo per il pathway di Notch a questa transizione. Questi geni includono il regolatore G2/M fosfatasi Cdc25, String; un regolatore dell'APC ubiquitination Hec/CdhFzr complesso e un inibitore del complesso CyclinE/CDK, Dacapo. Attività tacca conduce a downregulation della stringa e Dacapo e l'attivazione di Fzr. Tutti e tre i geni sono sensibli a reagire in modo indipendente a tacca. Inoltre, CdhFzr, un gene essenziale per endocycles, è sufficiente per interrompere il ciclo mitotico e promuovere endocycles precoce quando espresso prematuramente durante fasi mitotica. Al contrario, iperespressione del controller crescita Myc non indurre endocycles prematuro ma accelera la cinetica di endocycles normale. Mostriamo anche che arcipelago (fa), un regolatore di SCF è superfluo per mitosi, ma cruciale per endocycle progressione nell'epitelio follicolare. I risultati supportano un modello nel quale tacca attività esegue l'interruttore mitotica a endocycle regolando tre principali ciclo cellulare tutte le transizioni. Repressione della stringa blocca la fase M, attivazione di Fzr permette di progressione G1 e repressione di Dacapo assicura la fase S in entrata. Questo studio fornisce un quadro completo della logica che vie di segnalazione esterne possono utilizzare per controllare le transizioni ciclo cellulare dal regolamento coordinato del ciclo cellulare.
Segnale Di Cellule Staminali Per La Nicchia Attraverso Il Pathway Di Notch Nell'ovaio Di Drosophila
Le cellule staminali sono mantenute e mantengono la loro capacità di continuare a dividere a causa dell'influenza di nicchia. Sebbene nicchie sono importanti per mantenere la "stemness" in un'ampia varietà di tessuti, controllo di queste nicchie è capito male. Le cellule staminali germinali drosofila (artigiano) risiedono in una nicchia di cellule somatiche. Mostriamo che attivazione tacca può indurre l'espressione di marcatori di nicchia-cellula anche in un volo degli adulti; sovraespressione di Delta nella linea germinale o Notch attivato nelle cellule somatiche, risultati nelle cellule di nicchia extra, fino a 10 volte sopra il numero normale. A loro volta, queste cellule ectopiche nicchia inducono ectopica artigiano. al contrario, quando GCSs non producono funzionale ligandi tacca, Delta e dentellato, il pathway di TGF-beta non è attivato nell'artigiano, e che differenziano e successivamente lasciare la nicchia. Soprattutto, analisi clonale rivelano che alla fine del percorso tacca ricevente è necessaria nelle cellule somatiche. Questi dati mostrano che un ciclo di feedback esiste tra cellule staminali e cellule di nicchia. Dimostrazione che le cellule staminali possono contribuire alla funzione di nicchia ha conseguenze di vasta portata per le terapie con cellule staminali e possa fornire spaccato come il cancro può diffondersi in tutto un organismo tramite delle popolazioni di cellule staminali tumorali.
Dissezione Muscolare E Disturbi Neuronali in Un Modello Di Drosophila Di Distrofia Muscolare
Perturbazione in distroglicano (Dg)-distrofina (dis) complesso risultati nelle distrofie muscolari e anomalie cerebrali nell'uomo. Qui riportiamo che Drosophila è un eccellente modello geneticamente trattabili per studiare le distrofie muscolari e neuronali anomalie dovute a difetti di questo complesso. Utilizzando un dosaggio di polarizzazione di fluorescenza, mostrano un'elevata conservazione in Dg-dis interazione tra umani e drosofila. Genetiche e RNAi indotta da perturbazioni di Dg e dis in drosofila causano polarità cellulare e distrofia muscolare fenotipi: diminuita mobilità, degenerazione muscolare età-dipendente e fotorecettore difettoso path-finding. DG e dis sono tenuti in cellule gliali e neuroni per la corretta migrazione neuronale. D'importanza, riportiamo ora che Dg interagisce con il recettore insulina e molecola Nck/Dock SH2/SH3-adattatore in fotorecettori path-finding. Questa è la prima dimostrazione di un'interazione genetica tra Dg e InR.
Un Motivo Di Associazione Dominio Putativo Src Homology 3 Ma Non Il C-terminale Distrofina WW Domain Binding Motif è Richiesto Per Funzione Distroglicano in Polarità Cellulare in Drosofila
Il complesso conservati distroglicano-distrofina (Dg.Dys) collega la matrice extracellulare al citoscheletro. In esseri umani così come Drosophila, perturbazione di questo complesso risultati nelle distrofie muscolari e malformazioni cerebrali e in alcuni casi difetti polarità cellulare. Tuttavia, il regolamento dei Dg.Dys complessi è capito male in qualsiasi tipo di cellula. Sovraespressione studi più della metà e che troviamo ora in perdita di funzione (34 residui) della Dg regioni conservate di C-terminale ricco di prolina possono essere troncati senza compromettere notevolmente la sua funzione nella regolazione della polarità cellulare in drosofila. In particolare, il troncamento elimina il motivo obbligatorio del dominio WW presso il C molto terminus della proteina pensato per mediare le interazioni con la distrofina, suggerendo che un motivo di associazione secondo, interno WW può anche mediare questa interazione. Confermiamo questa ipotesi utilizzando un dosaggio di polarizzazione di fluorescenza sensibili per mostrare che due siti di legame del dominio WW della Dg associare a dis negli esseri umani (K(d) = 7,6 e 81 microM, rispettivamente) e drosofila (K(d) = 16 e 46 microM, rispettivamente). In contrasto con l'ampia delezione sopra menzionati, una singola prolina per una mutazione puntiforme dell'alanina all'interno di un sito di legame dominio (SH3) predetto Src homology 3 abolisce la funzione Dg in polarità cellulare. Questo suggerisce che una proteina SH3-contenenti, che deve ancora essere identificato, funzionalmente interagisce con Dg.
Differenze Di Fase in Condizioni Per Il Mantenimento Delle Cellule Staminali Germinali Nell'ovaio Di Drosophila
In questo studio, abbiamo scoprire un ruolo di microRNA nella manutenzione di Drosophila germline stem cell (GSC). Alterazione della funzione di Dicer-1 in artigiano durante la vita adulta si traduce in perdita di GSC. Sorprendentemente, però, perdita di Dicer-1 durante lo sviluppo non comporta un difetto di manutenzione del GSC, anche se un difetto è visto se sia Dicer-1 e la funzione di Dicer-2 sono interrotti. Perdita dei microRNA bantam imita il difetto di manutenzione Dicer-1 quando indotta in artigiano adulto, suggerendo che bantam gioca un ruolo chiave nel GSC self-renewal. Mad, un componente del percorso TGF-beta, si comporta similmente alla cubettatrice-1: adulti GSC manutenzione richiede Mad se è perso durante la vita adulta, ma se non è perso durante lo sviluppo di pupa. Nel complesso, questi risultati mostrano sensibilità differenziale fase-specifici di manutenzione GSC per determinate perturbazioni e suggeriscono che ci possa essere Dcr-2 dipendente dalla ridondanza dei meccanismi di manutenzione GSC durante lo sviluppo che si perde nella vita adulta.
Modificatore Genetica Schermi Rivelano Nuovi Componenti Che Interagiscono Con Il Complesso Distrofina-distroglicano Drosofila
Il complesso distroglicano-distrofina (Dg-dis) ha una capacità di trasmettere informazioni da matrice extracellulare al citoscheletro all'interno della cellula. Si propone che questa interazione è sotto stretto regolamento; i componenti di segnalazione/normativo del complesso Dg-dis rimangono tuttavia inafferrabili. Comprendere il regolamento del complesso è fondamentale poiché difetti in questo complesso causa la distrofia muscolare negli esseri umani. Per rivelare nuovi regolatori della Dg-dis complessi, abbiamo utilizzato un organismo modello Drosophila melanogaster ed eseguito gli schermi di interazione genetica per identificare i modificatori di Dg e dis mutanti nelle vene ala della drosofila. Questi schermi mutanti ha rivelato che il complesso Dg-dis interagisce con i geni coinvolti nella funzione muscolare e componenti della tacca, TGF-beta ed EGFR signaling pathways. Inoltre, componenti di percorsi che sono necessari per la migrazione cellulare e/o assonale attraverso la regolazione del citoscheletro, quali Semaforine-Plexine, netrina Frazzled e Robo-fessura percorsi mostrano interazioni con disfunzioni e/o Dg. Questi dati suggeriscono che il complesso Dg-dis e le altre vie che regolano il trasferimento di informazioni extracellulare per la dinamica del citoscheletro sono più intercalati quanto si pensasse.
Cubettatrice-1-dependent Dacapo Soppressione Atti a Valle Del Recettore Insulina Nella Regolazione Della Divisione Cellulare Delle Cellule Staminali Di Drosophila Germline
È importante comprendere la regolazione della divisione delle cellule staminali perché difetti in questo processo possono causare l'omeostasi dei tessuti alterati o cancro. L'inibitore di chinasi ciclina-dipendente Dacapo (Dap), un omologo p21/p27, atti a valle del percorso microRNA (miRNA) per regolare il ciclo cellulare nelle cellule staminali germinali di Drosophila melanogaster (artigiano). Tessuto-estrinseco segnali, tra cui l'insulina, regolano anche la divisione delle cellule dell'artigiano. Segnaliamo che regolatori intrinseci ed estrinseci si intersecano nel controllo divisione GSC; il percorso di insulina recettore (InR) regola i livelli di Dap attraverso miRNAs, controllando così la divisione GSC. Usando GFP-dap 3'UTR sensori in vivo, mostriamo che in artigiano il dap 3'UTR è reattivo a Dicer-1, un'endonucleasi di RNA III necessaria per l'elaborazione di miRNA. Inoltre, il dap 3'UTR può essere direttamente mirato da miR-7, miR-278 e miR-309 luciferase dosaggi. Coerente con questa, mutante miR-278 e miR-7 artigiano è parzialmente difettosa nella divisione GSC e visualizza ciclo cellulare anormale espressione marcatore, rispettivamente. Questi dati suggeriscono che il ciclo cellulare GSC è regolamentato tramite il dap 3'UTR di miRNAs più. Inoltre, GFP-dap 3'UTR sensori rispondono a InR ma non di TGF-beta, segnalando, suggerendo che InR segnalazione utilizza Dap per la regolazione del ciclo cellulare GSC. Noi dimostrare ulteriormente che il regolamento di Dap basati su miRNA possa agire a valle dell'InR di segnalazione; DCR-1 e Dap sono necessari per la nutrizione-dipendente dal ciclo cellulare regolamento in artigiano e riduzione del dap parzialmente salvò il difetto del ciclo cellulare dell'artigiano InR-carenti. Questi dati suggeriscono che il miRNA e Dap-ciclo cellulare regolamentazione basata in artigiano può essere controllato da InR di segnalazione.
MicroRNA Regola Divisione Human Embryonic Stem Cell
microRNA (miRNAs) regola numerosi processi fisiologici quali la divisione cellulare e la differenziazione in molti tipi di tessuti tra cui le cellule staminali. Per sondare il ruolo che svolgono miRNAs nella regolazione dei processi rilevanti per la biologia delle cellule staminali embrionali, abbiamo usato interferenza del RNA al silenzio DICER e DROSHA, due enzimi di elaborazione principale miRNA. Coerente con un ruolo per miRNAs nel mantenimento di rinnovamento e divisione delle cellule staminali normali, abbiamo trovato che la perturbazione della funzione pathway miRNA nelle cellule staminali embrionali umane (hESC) attenua la proliferazione cellulare. Crescita cellulare normale può essere parzialmente restaurata dall'introduzione dei miRNAs maturo miR-195 e miR-372. Questi miRNAs regolano due geni oncosoppressori, rispettivamente: WEE1, che codifica per un modulatore negativo di chinasi G2/M del complesso CycB/CDK e CDKN1A, quale codifica p21, un CycE/CDK cyclin inibitore delle chinasi dipendente che regola la transizione G1/S. Che mostriamo nel selvaggio-tipo hESCs, WEE 1 livelli controllano il tasso di divisione hESC, mentre p21 livelli devono essere mantenuti ad un livello basso per hESC divisione di procedere. Questi dati supportano un modello per il controllo del ciclo cellulare hESC in cui miRNAs regolano modulatori negativi ciclo cellulare a due fasi del ciclo cellulare per garantire il corretto rifornimento della popolazione delle cellule staminali.
Lo Stress E La Distrofia Muscolare: Uno Schermo Genetico Per Gli Interactiani Distroglicano E Distrofina in Drosofila Identifica Componenti Della Risposta Di Stress Cellulare
In drosofila, come negli esseri umani, carenze Dystrophin Glycoprotein Complex (DGC) causano una durata di vita accorciando la malattia, associata a disfunzione muscolare. Abbiamo eseguito la prima schermata di interazione genetica in vivo nell'invecchiamento distrofici muscoli e identificati geni che non hanno dimostrati prima di avere un ruolo nello sviluppo della distrofia muscolare e interagire con distrofina e/o distroglicano. Mutazioni in molti geni interagenti trovati causano età-dipendente morfologici e indotta dal calore fisiologici difetti nei muscoli, suggerendo loro importanza nel tessuto. Maggioranza di loro è filogeneticamente conservata e implicato nei disturbi umani, principalmente tumori e miopatie. Funzionalmente possono essere divisi in tre categorie principali: proteine coinvolte nella comunicazione tra il muscolo e il neurone ed è interessante notare che, in percorsi di risposta di stress meccanico e cellulare. I nostri dati mostrano che lo stress induce degenerazione muscolare e accelera la distrofia muscolare di età-dipendente. Distrofici muscoli sono già compromesse; e di conseguenza sono meno adattiva e più sensibile alle sollecitazioni energetiche e ai cambiamenti nell'ambiente la temperatura. Tuttavia, solo distroglicano, ma non distrofina deficit cause estreme myodegeneration indotta da stress energetico suggerendo che distroglicano potrebbero essere una componente della via bassa energia e agire come un trasduttore di stress energetico dei muscoli normali e distrofiche.
Ecdysteroids Influenzano Formazione Nicchia Di Drosofila Ovarico Delle Cellule Staminali E Differenziazione Precoce Di Germline
In precedenza, è stato dimostrato che in Drosophila ormoni steroidei sono necessari per la progressione di ovogenesi durante le ultime fasi di maturazione di uovo. Qui, ci mostra che ecdysteroids regolano la progressione attraverso i primi passi del lignaggio delle cellule germinali. Su ecdisone segnalazione disavanzo germline stem cell progenie ritardare per passare su un programma di differenziazione. Questo impedimento di differenziazione è associato a ridotta TGF-β segnalazione nella linea germinale e aumento dei livelli di complessi di adesione delle cellule e le proteine del citoscheletro in cellule somatiche escort. Un Coattivatore del recettore ecdisone, Taiman è il regolatore nello spazio limitato di ecdisone segnalazione percorso nel soma. Inoltre, quando la segnalazione ecdisone è turbato durante il processo di istituzione di nicchia delle cellule staminali somatiche allargata nicchie funzionali in grado di host aggiuntivi le cellule staminali sono formate.
Nuovi Distrofina/distroglicano Interactiani Controllano Il Comportamento Del Neurone Nell'occhio Della Drosofila
Il complesso distrofina glicoproteina (DGC) è un grande complesso multicomponente che è ben noto per la sua funzione nel tessuto muscolare. Quando i componenti principali della DGC, distrofina (dis) e distroglicano (Dg) sono colpita cognitivo e ritardo mentale oltre alla degenerazione muscolare può verificarsi. In precedenza abbiamo eseguito una serie di schermi genetici utilizzando un modello di Drosophila per distrofia muscolare al fine di trovare nuovi interattori DGC volti a delucidare i ruoli di segnalazione in cui è coinvolto il complesso. Poiché la funzione della DGC nel cervello e nel sistema nervoso non è stato completamente definita, qui abbiamo continuato ad analizzare la funzione dei modificatori DGC nel cervello in via di sviluppo di drosofila e occhio.
Distrofina Orchestra I MiRNAs Epigenetici Profilo Del Muscolo Cellule Via
Muscolatura dei mammiferi è un tessuto molto robusto e dinamico che passa attraverso molti cicli di degenerazione e rigenerazione nel corso della vita di un individuo. C'è un programma biologico che mantiene le cellule progenitrici muscolari che, quando attivato, danno origine a progenie myoblast intermedi che di conseguenza differenziarsi in cellule muscolari maturo. Recenti lavori hanno fornito un quadro del ruolo che i microRNA (miRNAs) gioca nel mantenere gli aspetti di questo programma. Curiosamente, un sottoinsieme di questi miRNAs è sregolato nelle distrofie muscolari (MDs), un gruppo di fatale malattie neuromuscolari ereditarie che sono spesso associati con carenze nel complesso distrofina (dis). A quanto pare, transcriptional espressione di molti geni specifici del muscolo e miRNAs dipende della cromatina stato regolato con il sentiero dis-Syn-nNOS. Questo mette distrofina l'epicentro di un programma altamente regolamentato di espressione del gene muscolo in cui miRNAs aiutano a coordinare la creazione di reti tra molteplici fasi di mantenimento muscolare, degenerazione e rigenerazione. Quindi, comprendere il ruolo dei miRNAs nella fisiologia del tessuto muscolare normale e malati potrebbe essere utile per le future applicazioni nel migliorare le terapie MD e potrebbe aprire nuove prospettive cliniche.
