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Articles by Hongshan Li in JoVE
JoVE General
Purificación simplificada de ADN plásmido de las Culturas procariotas
Este protocolo es una alternativa rentable para la clarificación eficiente en paralelo y purificación del ADN plasmídico a partir de
Other articles by Hongshan Li on PubMed
Farmacocinética Y Celular Trata De Monos Cangrejeros Dinámica De 2-amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]propane-1,3-diol Clorhidrato (FTY720) Después De Una Dosis Orales E Intravenosas
La farmacocinética y la célula trata de dinámica de 2-amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]propane-1,3-diol clorhidrato (FTY720), un nuevo agente inmunosupresor, se examinaron en monos cangrejeros (tres varones y tres hembras). Después de una dosis única de 0,1 mg/kg p.o. o bolo i.v. y 1 mg/kg p.o. fueron administradas a los animales, las concentraciones de FTY720 y el número de linfocitos, células CD20 + CD2-B, y células de CD2 + CD20-T en la sangre se midieron durante 23 días. Un modelo lineal de tres compartimientos caracteriza el curso temporal de las concentraciones de FTY720 con una vida media terminal de aproximadamente 31 h, separación de unos 0.53 l/h/kg y la biodisponibilidad de alrededor del 38%. Las respuestas dinámicas no fueron proporcional del área bajo la curva (o dosis) para machos o hembras. Un modelo de respuesta indirecta con un grupo de distribución capturado los datos de tráfico celular para todas las dosis para cada tipo de célula, donde inicial hemogramas (R(0)) trataban de 7650, 2100 y 5250 células/microl; máxima inhibición fraccional (I(max)) sobre 0,88 0,85 y 0,91; afluencia (k(in)) 6014, 1312 y 5662 células/microl/h; emanación (k(out)) sobre 0.798 0.555 y 1,08 h; intercompartmental k(cp) sobre 0.134 0,192 y 0.082 h; y k(pc) intercompartmental tarifa constantes unos 3,9 x 10(-4) y 0.016 y 8,9 x h 10(-6) de linfocitos, células B y células T, respectivamente. La concentración de inhibición IC(50) era aproximadamente 0.48 microg/l para todas las células, que era extraordinariamente baja. Los volúmenes de distribución aparente de piscina periférica (V(p)) fueron notablemente más grande que el volumen de la sangre (V(b)) para todas las células. El I(max) de la célula trata logró en dosis más pequeñas que eso produce protección del injerto, indicando central más fuerte que los efectos periféricos de esta droga. La célula profunda trata de efectos de FTY720 puede ser fácilmente capturada e interpretada con un modelo de respuesta indirecta extendido.
Rata Transgénica Modelos Con Un Fenotipo De La Acumulación Intracelular De Abeta En El Hipocampo Y La Corteza
En esta comunicación se presenta la caracterización de varias líneas de ratas transgénicas que expresan AbetaPP humano portador de las mutaciones suecos e Indiana (codificado UKUR28), la presenilina 1 humana transgénicos con el 'Finn' mutación (codificado UKUR19) y dobles ratas transgénicas que expresan tanto los transgenes (codificado UKUR25). En estas ratas Tg, la AbetaPP y la expresión del transgen PS1 se limitaba en gran medida en el hipocampo y el neocórtex. Los ratones transgénicos PS1 no produjo cambios visibles en la inmunorreactividad Abeta. Las ratas transgénicas AbetaPP (tanto la única Tg UKUR28, y doble Tg UKUR25) genera un fenotipo del comercio intra-neuronalbeta acumulación sin la formación de placa y sin aumento de inmunoreactividad para epítopos AbetaPP amino y carboxilo terminal. Este fenotipo fue evidente desde los 6 meses de edad en las líneas de ratas transgénicas que llevan el transgen AbetaPP humana. No hay placas seniles de Abeta agregada se observó en ninguna de las líneas transgénicas generadas, hasta 24 meses de edad. El hAbetaPP sola línea homocigótica Tg (UKUR28) mostraron un incremento en ERK2, sin cambios en la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) la actividad. Un análisis preliminar de las proteínas en el hipocampo de la rata de doble transgénico (UKUR25) por espectrometría de masas mostraron diferencias en el perfil de proteínas entre esta línea transgénica y los controles.
Ribosa Polimerasa Promueve La Remodelación Cardiaca, Insuficiencia Contráctil Y Desplazamiento Del Factor Que Inducen Apoptosis En Un Modelo Experimental Murino De Bandas Aórtica E Insuficiencia Cardíaca
La activación inducida por estrés oxidante de ribosa polimerasa (PARP) desempeña un papel en la patogenia de diversas enfermedades cardiovasculares. Ahora hemos investigado el papel de PARP en el proceso de remodelación cardiaca y la insuficiencia cardíaca en un modelo murino de insuficiencia cardiaca inducida por la constricción aórtica transversal (bandas). La actividad catalítica de PARP fue inhibida por el inhibidor PARP de basadas en isoindolinone potente INO-1001 o por deficiencia genética de PARP-1. Inhibición de la PARP prevenir la disminución de la presión inducida por sobrecarga en la función contráctil cardiaca, a pesar de la gradiente de presión entre ambas arterias carótidas ser comparable en los dos grupos experimentales. El desarrollo de la hipertrofia, la formación de colágeno en los corazones y la translocación mitocondrial-a-nuclear del factor de muerte celular que inducen apoptosis (AIF) del factor fueron atenuadas por inhibición de la PARP. La capacidad del inhibidor para bloquear la actividad catalítica de PARP fue confirmada por la detección inmunohistoquímica de la ribosa, el producto de la enzima en el corazón. Los niveles plasmáticos de INO-1001, medida al final de los experimentos, estaban en la gama de concentración suficiente para bloquear la activación mediada por oxidante de PARP en miocitos cardiacos murinos in vitro. Hipertrofia del miocardio y desplazamiento de la AIF se redujo también en ratones PARP-1-deficientes sometidos a bandas aórtica, en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje. En general, los resultados actuales demuestran la importancia de poly(ADP-ribos) ylation en la patogenia de la insuficiencia cardíaca inducida por las bandas.
Vectores De Plásmido Para La Producción De La Proteína, Expresión Génica Y Manipulaciones Moleculares De Aspergillus Niger
Construimos tres conjuntos de plásmidos para su uso en Aspergillus niger. Estos plásmidos fueron ensambladas con varias combinaciones de una serie de cintas de ADN modulares que incluye un marcador seleccionable, pyrG, derivado de Aspergillus nidulans; dos regiones promotoras para dirigir la expresión de la proteína; un cassette derivado de la secuencia de replicator AMA1 para apoyar la replicación autónoma; y un gen reportero basados en el gen de la lacA de a. niger. Un sistema incluye integración y autónomamente replicando plásmidos para la expresión de proteínas heterólogas y homólogas. El segundo era un conjunto de replicación autónoma plásmidos, con un gen reportero codificación secretada beta-galactosidasa, para estudiar los eventos de regulación génica. El tercer juego había incluido cintas gen pyrG-derivado-blaster adecuados para la manipulación del genoma por el reemplazo de genes específicos.
Descubrimiento De Ribosa Potentes Inhibidores De La Polimerasa-1 De La Modificación De Isoquinolinone Men [1, 2-c]
Derivados de isoquinolinone novela Men [1, 2-c] se sintetiza y evaluaron como inhibidores de la enzima nuclear ribosa polimerasa-1 (PARP-1). Estos potentes inhibidores de PARP-1 nonmutagenic poseen un anillo de cinco miembros adicional entre los anillos B y C de 6(5H)-phenanthridinone. Los más potentes inhibidores de PARP-1 se obtuvieron de la sustitución del anillo D en la posición C-9, en particular sulfamida y N-acil análogos (6 y 11). Los análogos de la sulfamida 9 11a y 12a exhibieron IC(50) valores de 1 a 10 nM, respectivamente.
Ribosa Polimerasa-1 Inhibición Invierte Temozolomida Resistencia En Un Xenoinjerto De Glioma Maligno Carentes De Reparación De ADN Desajuste
La temozolomida es un agente de metilación de ADN utilizado en el tratamiento de gliomas malignos. En este estudio, hemos examinado si la inhibición de la ribosa polimerasa (PARP) podría aumentar la citotoxicidad de temozolomida, particularmente en las células deficientes en la reparación del ADN desajuste. Athymic ratones, transplantados con desajuste reparación dominio [D-245 MG] o xenoinjertos deficiente en [D-245 MG (PR)], fueron tratados con una combinación de temozolomida y el inhibidor PARP, INO-1001. Para los tumores deficientes en reparación de desajuste, la dosis más efectiva de INO-1001 fue encontrada para ser 150 mg/kg, dado i.p. tres veces a intervalos de 4 horas con la primera inyección en combinación con temozolomida de 262.5 mg/kg (0.75 LD(10)). Esta dosis de temozolomida por sí mismo había inducida no regresiones parciales y un retraso en el crecimiento de 4 días. En dos experimentos independientes, la terapia de combinación incrementa el retraso en el crecimiento de 21,6 y 9,7 días con regresiones parciales observados en cuatro de ocho y tres de nueve ratones, respectivamente. La adición de INO-1001 tuvo un incremento más modesto, pero estadísticamente significativo, por retraso en el crecimiento tumoral en los xenoinjertos de dominio reparación de desajuste. En estos experimentos, trataron a ratones con una menor cantidad de temozolomida (88 mg/kg), resultando en retrasos del crecimiento de 43.1 y 39.2 días. Cuando el tratamiento de temozolomida estaba en combinación con 200 mg/kg INO-1001, hubo un aumento en el retraso en el crecimiento a 48,9 y 45,7 días, respectivamente. Estos resultados sugieren que la inhibición de PARP puede aumentar la eficacia de temozolomida en el tratamiento de gliomas malignos, especialmente en tumores deficientes en la reparación del ADN desajuste.
Molecular Clonación Y Nucleótido Secuencia De CYP6BF1 De La Palomilla, Plutella Xylostella
Se proyectó un clong cDNA novela codificación un citocromo P450 de la cepa insecticida-susceptible de Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera:Yponomeutidae). Se determinó la secuencia de nucleótidos del clon, señalado CYP6BF1. Se trata de la primera secuencia integral de la familia CYP6 de Plutella xylostella (L.). El cDNA es 1661bp de largo y contiene un marco de lectura abierto de pares de bases 26 a 1570, codificando una proteína de 514 residuos de aminoácidos. Es similar a los otros insectos P450s en familia de gen 6, incluyendo CYP6AE1 de Depressaria pastinacella, (46%). El número de adhesión de GenBank es AY971374.
El Inhibidor De Parp-1 Ino-1001 Facilita La Estabilización Hemodinámica Sin Afectar a La Reparación Del ADN En Porcina Torácica Aórtica Cruz-sujeción-inducida Por Isquemia/reperfusión
Inhibición de la poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1) mejoró la función hemodinámica y órgano en varios modelos de descarga inducida por sepsis o isquemia/reperfusión. PARP-1, sin embargo, también se conoce para desempeñar un papel fundamental para el mantenimiento de la integridad genómica. Por lo tanto, investigamos el efecto del PARP-1 bloqueador INO-1001 en hemodinámica, función renal y daños en el ADN y reparación durante porcino torácico aórtico pinzamiento. Los animales experimentaron 45min de pinzamiento aórtico después de recibir el vehículo (n = 9) o i.v. INO-1001 (n = 9; dosis total, 4 mg.kg, administrada antes de sujeción y durante la reperfusión), se registraron datos antes de sujeción, antes declamping y 2 y 4 h después de declamping. Durante la reperfusión, norepinefrina i.v. continua incremental fue ajustado para mantener la presión arterial mayor o igual al 80% del nivel pre-clamping. Los niveles plasmáticos de INO-1001 analizados con cromatografía líquida de alta presión fueron 1 a 1.4 micromol/L y 0.4 a 0.6 micromol/L antes y después de la fijación con abrazadera, respectivamente. Aunque los animales tratados con INO-1001 requieren menos apoyo de norepinefrina, función renal fue comparable en ambos grupos. No hubo diferencias intergrupo ya sea en el tiempo curso de ADN daños y reparación (ensayo cometa) como evaluaron tanto in vivo en sangre entera antes de cirugía, antes de la fijación con abrazadera, antes declamping, 2 h después de declamping y ex vivo de linfocitos aislados (gradiente de Ficoll) muestreado inmediatamente antes de la fijación con abrazadera y analizado antes, inmediatamente y 1 y 2 h después de la exposición a 4 bar 100% O2 por 2 h. No hubo diferencias en la expresión del gen inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, p27, en el riñón (inmunohistoquímica). Los requisitos de la norepinefrina reducida durante la reperfusión sugieren un efecto inotrópico positivo de INO-1001, según lo demostrado por otros autores. En nuestro modelo, INO-1001 demostró para ser seguro con respecto a la reparación del ADN.
Fisiológicamente Basado En Modelos Farmacocinéticos De FTY720 (clorhidrato De 2-amino-2[2-(-4-octylphenyl)ethyl]propane-1,3-diol) En Ratas Después De Dosis Orales E Intravenosas
FTY720 (clorhidrato de 2-amino-2[2-(-4-octylphenyl)ethyl]propane-1,3-diol) es un agonista del receptor de la esfingosina-1-fosfato de nuevo está desarrollando para la esclerosis múltiple y la prevención de órgano sólido rechazo al trasplante. Se desarrolló un modelo farmacocinético fisiológicamente base para predecir la concentración de FTY720 en varios órganos del cuerpo. Solas dosis orales e intravenosas de FTY720 fueron administradas a ratas Wistar macho, con sangre y tejido de muestreo más 360 h analizado por espectrometría de masa de cromatografía/tándem líquido. Un modelo bien agitado (perfusión tasa limitada) describe la cinética de FTY720 en corazón, pulmones, bazo, músculo, riñones, huesos y hígado, con un modelo de tasa limitada de permeabilidad han sido recogido, cerebro, timo y ganglios linfáticos. Coeficientes de partición del tejido sangre (RT) varió de 4,69 (músculo) a 41.4 (pulmones). En los ganglios linfáticos y bazo, principales sitios para cambios inducidos por el FTY720 en el secuestro de linfocitos, valores de RT fueron 22,9 y 34.7, respectivamente. Productos de permeabilidad-superficie para el cerebro, timo y ganglios linfáticos eran 39.3, 122 y 176 ml/min intrínseco separación hepática era 23.145 l/h/kg para la droga libre en sangre (f(ub) 0.000333); espacio sistémico fue 0.748 l/h/kg y terminal de Half-Life fue 23,4 h. La fracción absorbida por vía oral fue del 71%. El modelo caracterizado bien FTY720 disposición para este estudio colección extensa de dosificación y tejido en la rata. Escala el modelo para perros y seres humanos, buen acuerdo fue encontrado entre los perfiles de concentración-tiempo actual y prevista de la sangre. Más importante aún, las concentraciones cerebrales en perros bien fueron predichas de los de la rata. En términos absolutos, las predicciones eran ligeramente inferiores a los valores observados, justo debajo de una desviación de sufrir, pero el modelo predijo con exactitud la eliminación terminal de FTY720 del cerebro.
[Alimentación Preferencia De Plutella Xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) Larva a Sus Huéspedes]
El experimento de alimentación con diferentes tipos de hortalizas Brassica demostró que Plutella xylostella larva prefería las plántulas de Col China (Brassica campestris L.), rábano (Raphanus sativus L.) y caixin (Brassica campestris L.) a los de colza (Brassica napus L.) y col (Brassica olereacea L.), con una proporción de selección de 93,33% y 6,67% entre Col China y violación y de 16,67% y 83.33% entre Col y caixin. En total, la preferencia de alimentación de la larva de p. xylostella fue menos relacionado con el contenido de almidón en los vegetales y glúcido soluble, pero tuvo una correlación negativa definitiva a la relación del contenido de estos compuestos. La larva de p. xylostella alimentados con repollo chino caixin creció más que hartos de violación y col y el alimentación cantidad y el peso corporal de por larva fueron 0,583 - 0,637 cm2 y 2.07-2.18 mg, respectivamente. La larva preferida dañado plántulas vegetales, también.
Glucuronización in Vitro De Tiroxina Y Triyodotironina Por Microsomas Hepáticos Y Recombinante Humana UDP-glucuronosyltransferases
Glucuronización, que puede ocurrir en el hidroxilo fenólico y grupos carboxilo, es una vía importante del metabolismo de la tiroxina (T4) y triyodotironina (T3). En este estudio, se desarrolló un método de cromatografía de líquidos/masas espectrometría (LC/MS) para separar glucuronides fenólico y acil de T4 y T3. El método fue utilizado para recoger el glucurónido fenólico de T4 para la caracterización definitiva por RMN y determinar efectos de pH de incubación y diferencias de especies humanas UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) implicado en la formación de los glucuronides. Formación de glucurónido fenólico T4 fue favorecida a pH 7.4, mientras que la formación de T4 acil glucurónido se vio favorecida a pH 6.8. Todos los UGTs examinados catalizaron la formación de glucurónido fenólico T4 excepto UGT1A4; la mayor actividad se detectó con UGT1A3, UGT1A8 y UGT1A10, seguido por UGT1A1 y UGT2B4. Formación de glucurónido fenólico T3 se observó en el orden UGT1A8 > UGT1A10 > UGT1A3 > UGT1A1; actividad de seguimiento se observó con UGT1A6 y UGT1A9. UGT1A3 fue la isoforma principal catalizan la formación de T4 y T3 glucuronides acil. En los microsomas hepáticos, glucuronización fenólico fue la mayor en los ratones para T4 y en ratas para T3 y menor en monos para T4 y T3. Acil glucuronización fue mayor en los seres humanos y la más baja en ratones para T4 y T3. Glucuronización fenólico fue superior de glucuronización acil para T4 en los seres humanos; en contraste, la glucuronización acil fue ligeramente superior de glucuronización fenólico para T3. Actividades de UGT fueron inferiores hacia T3 T4 en todas las especies. El método de la LC/MS era una herramienta útil en el estudio de glucuronización de T4 y T3.
Tratamiento De La Superficie Celular De Extracelular Virus De Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 Vpr Convertasas Del Cualquiera
Creciente evidencia sugiere que Vpr extracelular podría contribuir a la patogénesis del VIH a través de su efecto sobre las células del espectador. Formas solubles de Vpr se han detectado en el suero y líquido cerebroespinal de pacientes infectados por VIH-1, y en estudios in vitro han implicado Vpr extracelular como un efector de respuestas celulares, incluyendo G2 arresto, apoptosis y la inducción de la producción de citoquinas y quimioquinas, presumiblemente a través de su capacidad para transducir en múltiples tipos de células. Sin embargo, el mecanismo subyacente Vpr lanzamiento de VIH-1-produciendo las células permanece indefinido y las modificaciones biológicas que puede sufrir la proteína extracelular son en gran parte desconocidas. Proporcionamos evidencia que indica que las formas solubles de Vpr están presentes en el medio extracelular de células productoras de VIH-1. Liberación de Vpr en el medio extracelular no se origina desde que se decae o interrumpido viriones del VIH-1 ese paquete Vpr pero algo apareció asociada con cytopathicity mediada por VIH-1. Curiosamente, Vpr encontraron para experimentar el proceso proteolítico en un sitio de la hendidura convertasa proproteína muy bien conservado (PC), R(85)QRR(88) flecha, situado dentro del dominio funcionalmente importante de ricos en arginina c-terminal de la proteína. VPR proceso ocurrió extracelularmente en estrecho contacto a las células y probablemente implicó una célula superficie asociada a PC. Constantemente, inhibidores de la PC suprimieron Vpr procesamiento, mientras que la expresión de extracelular matriz asociada PC5 y PACE4 había mejorado Vpr escote. Transformación mediada por PC de Vpr extracelular llevó a la producción de un producto de Vpr truncado que era defectuoso para la inducción de la detención del ciclo celular y apoptosis cuando se expresan en células humanas. Colectivamente, estos resultados sugieren que el procesamiento superficial de células de Vpr extracelular por PC podría regular los niveles de activo Vpr soluble.
Diferencias En La Formación De Vabicaserin Carbamoil Glucuronido En Especies
Vabicaserin es un agonista completo potente 5-hydroxtryptamine 2C con potencial terapéutico para una amplia gama de trastornos psiquiátricos. Perfiles de metabolitos indican que vabicaserin fue ampliamente metabolizado via glucuronización Carbamoil tras la administración oral en humanos. En el presente estudio, se investigaron las diferencias en el grado de formación de glucurónido (CG) de carbamoil vabicaserin en humanos como en animales utilizados para la evaluación de la seguridad. Después de la dosis oral, los cocientes de la exposición sistémica de CG a vabicaserin eran aproximadamente 12 y hasta el 29 en monos y seres humanos, respectivamente, y los cocientes de CG a vabicaserin eran aproximadamente 1.5 y 1.7 en ratones y perros, respectivamente. Estas diferencias en los niveles sistémicos de CG están probablemente relacionados con diferencias de especies en la velocidad y extensión de la formación de CG y eliminación. Considerando que la CG fue el metabolito circulante predominante en los seres humanos y un metabolito principal en ratones, perros y monos, es un metabolito relativamente menor en las ratas, en la cual el metabolismo oxidativo fue la principal vía metabólica. Aunque el CG no fue detectado en plasma u orina de ratas, aproximadamente el 5% de la dosis fue excretado en la bilis como CG en la postdose de la colección de 24 h, indicando que la rata tenía la capacidad metabólica de producción de la CG. In vitro, en un CO (2)-ambiente enriquecido, el centro de gravedad fue el metabolito predominante en el perro y los microsomas de hígado humanos, un metabolito principal en monos y ratones y sólo un metabolito muy menor en las ratas. Carbamoil glucuronización e hidroxilación tuvieron similares aportaciones vabicaserin metabolismo en hígado de ratón y mono microsomas. Sin embargo, sólo trazas de CG se formaron en microsomas de hígado de rata, y otros metabolitos fueron más prominentes que la CG. En conclusión, se observaron diferencias significativas en el grado de formación de la CG entre las distintas especies examinadas. La relación entre la exposición de CG a vabicaserin fueron más altos en los seres humanos, seguidos por monos, luego ratones y perros y menor en las ratas, y los perfiles de metabolitos in vitro se correlacionaron generalmente con los metabolitos in vivo.
Metabolismo De Metilnaltrexona Intravenosa En Ratones, Ratas, Perros Y Seres Humanos
Metilnaltrexona (MNTX), un antagonista selectivo de los receptores mu-opioides, funciona como un antagonista del receptor periférico actúa en los tejidos del tracto gastrointestinal. Este informe describe el destino metabólico de [3 H] MNTX o [(14) C] bromuro de MNTX en ratones, ratas, perros y seres humanos después de la administración intravenosa. Separación e identificación de metabolitos urinarios de la MNTX y plasma fue alcanzada por cromatografía líquida de alto rendimiento-radiactividad detección y líquido cromatografía/espectrometría de masas. Las estructuras de los metabolitos más abundantes de la humanas fueron confirmadas por síntesis química y análisis espectroscópico de NMR. Análisis de la radiactividad en plasma y orina demostró que MNTX experimentó dos vías principales del metabolismo en los seres humanos: sulfatación del grupo fenólico MNTX-3-sulfato (M2) y reducción del grupo carbonilo a dos epimeric alcoholes, metil-6alpha-naltrexol (M4) y metil-6beta-naltrexol (M5). Naltrexona ni su metabolito 6beta-naltrexol fueron detectados en plasma humano después de la administración de MNTX, confirmando una observación anterior que n-desmetilación no era un camino metabólico de MNTX en los seres humanos. Los perfiles de metabolitos urinarios en los seres humanos eran constantes con perfiles de plasma. En ratones, los metabolitos urinarios y circulación incluyen M5, MNTX-3-glucurónido (M9), 2-hidroxi-3-O-metil MNTX (M6) y su glucurónido (M10). M2, M5, M6 y M9 fueron observados en ratas. Perros producen sólo un metabolito, M9. En conclusión, MNTX no se metaboliza extensivamente en los seres humanos. Conversión a metil-6-naltrexol isómeros (M4 y M5) y M2 fueron los caminos principales del metabolismo en los seres humanos. MNTX se metaboliza a un grado más alto en los ratones que en ratas, perros y seres humanos. Glucuronización fue un importante camino metabólico en ratones, ratas y perros, pero no en seres humanos. En general, los datos sugieren diferencias de especies en el metabolismo de la MNTX.
Identificación De Biomarcadores De Novela Suero Diagnóstico Para La Enfermedad De Chagas En Sujetos Asintomáticos Perfilando Espectrometría De Masa
Más de 10 millones de personas se piensan para ser infectados con el Trypanosoma cruzi, principalmente en las Américas. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Chagas (CD) son variables, pero la mayoría de los sujetos permanece asintomática durante décadas. Sólo 15 a 30% eventualmente desarrollar complicaciones terminales. Todas las pruebas diagnósticas actuales tienen limitaciones. Se necesitan nuevos enfoques para la detección del Banco de sangre así como para mejor diagnóstico y pronóstico. Sueros de sujetos con CD asintomática (n = 131) se compararon con los de controles no infectados (n = 164) y sujetos con otras enfermedades parasitarias (n = 140), usando espectrometría de la matriz de la proteína. Para identificar biomarcadores asociados con CD, sueros fueron fraccionados por cromatografía de intercambio aniónico y obligados a dos químicos de matriz ProteinChip comerciales: WCX2 y IMAC3. Múltiples biomarcadores candidato encontradas en CD sera (3 a 75.4 kDa). Algoritmos que emplean de 3 a 5 de estos biomarcadores alcanzados hasta a 100% de sensibilidad y 98% de especificidad para CD. Los biomarcadores más útiles para el diagnóstico fueron identificados y validados. Éstos incluyeron MIP1 alfa, C3a anafilatoxina (anafilatoxinas) y formas inusualmente truncadas de fibronectina, apolipoproteína A1 (ApoA1) y C3. Un antisuero II.5 contra la terminal C de 28,9-kDa del fragmento fibronectina logra buena especificidad (90%) de CD en un formato de Western blot. Identificamos ApoA1 integral (28,1 kDa), el componente principal proteína estructural y funcional de la lipoproteína de alta densidad (HDL), como un bioindicador negativo importante para CD y relativamente poco ApoA1 integral fue detectado en sueros de CD. Este trabajo proporciona prueba de principio que tanto depende de la plataforma (es decir, basadas en espectrometría de masa) y las pruebas independientes de la plataforma (es decir, Western blot) pueden generarse utilizando perfiles de masas de alto rendimiento.
Metabolismo in Vitro E Identificación De Humanas Enzimas Implicadas En El Metabolismo De Metilnaltrexona
Metilnaltrexona (MNTX) es un antagonista de receptores mu-opioides periféricamente temporario y actualmente está indicado para el tratamiento de la constipación inducida por opiáceos en pacientes con enfermedad avanzada que reciben cuidados paliativos, cuando la respuesta a la terapia laxante no ha sido suficiente. Sulfatación a MNTX-3-sulfato (M2) y reducción de carbonilo metil-6alpha-naltrexol (M4) y metil-6beta-naltrexol (M5) son los caminos metabólicos primarios para MNTX en los seres humanos. Los objetivos de este estudio fueron investigar MNTX en el metabolismo de vitro en la especie humana y no clínicos e identificar las enzimas humanas implicadas en el metabolismo MNTX. De los cinco Sulfotransferasas comercialmente disponibles investigados, sólo SULT2A1 y SULT1E1 catalizaron formación M2. Formación de M4 y M5 fue catalizada por enzimas citosólicas hepáticas NADPH-dependiente, que se identificaron con inhibidores selectivos de la químicos (10 y 100 microM) para aldo-ceto reductasa (AKR) isoformas, deshidrogenasa de cadena corta/reductasa incluyendo reductasa de carbonilo, alcohol deshidrogenasa y oxidorreductasa quinona. Entonces, los resultados fueron comparados con los efectos de los inhibidores de la mismos en la formación de 6beta-naltrexol de naltrexona, un análogo estructural de la MNTX, que es catalizado principalmente por AKR1C4. La fenolftaleína de inhibidor de la AKR1C inhibe MNTX y naltrexona la reducción de hasta un 98%. 3alpha ácido 5beta-colánico, 7alpha-diol, el inhibidor de la AKR1C2 y acetato de medroxiprogesterona, un inhibidor de la AKR1C1, AKR1C2 y AKR1C4, inhibe la reducción MNTX hasta un 67%. Otros inhibidores fueron menos potentes. En conclusión, la reducción de carbonilo de MNTX M4 y M5 en citosol hepático fue consistente con las observaciones anteriores en vivo. AKR1C4 parece jugar un papel importante en la reducción de carbonilo de MNTX, aunque pueden estar involucradas múltiples enzimas en la subfamilia AKR1C. Humano SULT2A1 y SULT1E1 participaron en la sulfatación de MNTX.
Significado De Tyr302, His235 Y Asp194 En La α-amilasa De Bacillus Licheniformis
Los residuos de calcio, Tyr302 y His235 y el residuo de enlace de sodio, Asp194, sobre la actividad de α-amilasa de Bacillus licheniformis se investigaron mediante mutagénesis sitio-dirigida. Tyr302 y His235 fueron reemplazados por ADN y Asp, respectivamente, para producir a los mutantes Y302N y H235D; Asp194 fue reemplazado por el Ala para producir D194A. Las amilasas mutantes se purificaron a homogeneidad; cada uno fue ~ 53 kDa. La actividad específica de la D194A fue 236 U mg(-1), inferior a la actividad específica de la enzima de tipo salvaje en un 55%. Cambios significativos de termoestabilidad, temperatura óptima y el nivel de pH óptimo no se observaron en D194A. Amilasas mutantes con H235D y Y302N mejoraron significativamente su actividad específica en un 43% (754 U mg(-1)) y el 7% (563 U mg(-1)), respectivamente, en comparación con la enzima de tipo salvaje. Sustitución de H235D disminuyó su pH óptimo por aprox. 0.5-1 unidad de pH.
