Trasporto Rapido Di Actina Durante La Protrusione Delle Cellule

Science (New York, N.Y.). Apr, 2003  |  Pubmed ID: 12677069

Fibroblasti di ratto trasformato esprimendo due varianti della proteina fluorescente verde, ogni fuso a beta-actina, sono stati utilizzati per studiare la dinamica dell'actina durante la protrusione delle cellule. Il metodo FLAP (localizzazione di fluorescenza dopo photobleaching) recentemente sviluppato permette il tracciamento di un fluoroforo dopo photobleaching localizzata utilizzando l'altro come riferimento colocalized. Qui, visualizzando il rapporto di sbiancato a molecole totale, abbiamo trovato che actina è stato consegnato a sporgenti zone di avanguardia della cella ad una velocità che superava di 5 micrometri al secondo. Modellazione Monte Carlo ha confermato che questo flusso non può essere spiegato dalla diffusione e possa coinvolgere trasporto attivo.

Istone H2A Fosforilazione E Metilazione H3 Sono Necessari Per Una Funzione Di Riparazione Rad9 DSB Romanzo Dopo L'attivazione Del Punto Di Arresto

DNA Repair. Jun, 2006  |  Pubmed ID: 16650810

Nel lievito gemmante, la proteina Rad9 è un giocatore importante nel mantenimento dell'integrità genomica e ha un ruolo importante nell'attivazione di checkpoint danni del DNA. Recentemente, ruoli per le modifiche dell'istone di alberino-di traduzione differenti nella risposta danni del DNA, compreso la fosforilazione della serina 129 H2A e H3 lisina 79 metilazione, inoltre sono stati dimostrati. Qui, ci mostra quel reclutamento Rad9 ai fuochi e alla rinfusa cromatina si verifica in particolare dopo ionizzanti alla radioterapia in celle G2. Questa assunzione stabile correla con le fasi finali del doppio filamento (DSB) riparazione e, sorprendentemente, è la forma hypophosphorylated di Rad9 che viene mantenuto sulla cromatina piuttosto che iperfosforilata, associato al checkpoint, forma. Stabile Rad9 accumulo in foci richiede la chinasi Mec1 e due modifiche dell'istone indipendentemente regolamentate, H2A fosforilazione e metilazione H3 Dot1-dipendente. Inoltre, Rad9 è reclutati selettivamente a un sottoinsieme di Rad52 riparazione foci. Questi risultati, insieme con l'osservazione che le cellule rad9Delta sono difettose nella riparazione delle rotture IR in G2, fortemente indicano un ruolo di attivazione post romanzo checkpoint per Rad9 nella promozione efficace riparazione del DNA DSBs di ricombinazione omologa.

Mobilità E Distribuzione Della Proteina A Di Replica Nelle Cellule Viventi Mediante Spettroscopia Di Correlazione Di Fluorescenza

Experimental and Molecular Pathology. Apr, 2007  |  Pubmed ID: 17303118

Replication protein A (RPA), eukaryotic DNA single-stranded (ssDNA) binding protein, è essenziale per tutti i percorsi del metabolismo del DNA. Per studiare la funzione di RPA in cellule viventi il secondo più grande RPA subunità e un mutante di delezione N-terminale dello stesso furono fuse alla proteina fluorescente verde (GFP; GFP-RPA2 e GFP-RPA2deltaN, rispettivamente) in maniera biologica controllata, molecolare. Queste proteine sono state espresse in cellule HeLa sotto il controllo del sistema di espressione inducibile tetraciclina. GFP-RPA2 e GFP-RPA2deltaN sono prevalentemente proteine nucleari come determinato dalla scansione microscopia confocal del laser. Bassa espressione basale di GFP-RPA2deltaN ha permesso la misurazione dei parametri cinetici della RPA. Mediante fluorescenza correlazione spettroscopia (FCS) due popolazioni - un veloce e una specie di movimento lenta - sono stati rilevati nel nucleo e nel citosol delle cellule umane. I tassi di diffusione traslazionale di queste due popolazioni di RPA erano circa 15 microm2/s e 1,8 microm2/s. Questa nuova scoperta rivela l'esistenza di diversi complessi multiprotein e ssDNA-proteina di RPA in due compartimenti cellulari e si apre la possibilità per le loro analisi.

Autofluorescent Proteins

Methods in Cell Biology. 2008  |  Pubmed ID: 18155456

Autofluorescent proteine (AFPs) hanno rivoluzionato la biologia molecolare delle cellule, e le applicazioni continuano a sfruttare la potenza di questi tag fluorescenti geneticamente codificati. Qui, passiamo in rassegna la scoperta e le proprietà fisiche dell'AFPs così come il loro sviluppo attraverso ottimizzazione mutazionale per diversi parametri funzionali. Una guida pratica per la selezione e l'uso delle principali AFPs è fornita così come una panoramica delle tecniche per applicazioni sperimentali.

Isolamento Delle Camere Uovo Drosofila Per L'imaging

Cold Spring Harbor Protocols. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20360356

Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è un importante modello per la ricerca di base sui meccanismi molecolari sottostanti la funzione delle cellule e lo sviluppo, nonché uno strumento importante nella ricerca biomedica. Un vantaggio significativo di Drosophila è la capacità di applicare live cell imaging ad una varietà di tessuti viventi che può essere sezionata e imaging in vivo, ex vivo o in vitro. Camere di uovo di Drosophila, ad esempio, hanno dimostrato di essere un sistema utile modello per lo studio della migrazione cellulare di bordo, trasporto unità Golgi, il rapido movimento delle particelle di mRNA e di proteine e il ruolo dei microtubuli nella differenziazione meiosi e ovocita. Un primo passo fondamentale prima di imaging è la preparazione del materiale sperimentale per garantire rilevanza fisiologica e per ottenere le migliori condizioni per la qualità dell'immagine. Chambers primi - a metà - stadio di uovo non può essere montato in un mezzo acquoso-based, perché questo provoca un cambiamento nella morfologia di cella microtubule organizzazione e follicolo. Tali alloggiamenti uovo sopravvivono meglio in Olio halocarbone, che permette la libera diffusione dell'ossigeno, ha bassa viscosità e quindi impedisce la disidratazione e l'ipossia. Con un indice di rifrazione simile a glicerolo, olio di halocarbone ha anche buone proprietà ottiche per l'imaging. E inoltre fornisce un buon ambiente per iniezione ed è particolarmente utile per l'imaging a lungo termine degli embrioni. Tuttavia, a differenza con soluzioni acquose, modifiche a medio non sono possibili. Questo protocollo descrive l'isolamento delle camere uovo di Drosophila.

Raccolta E Montaggio Degli Embrioni Di Drosophila Per L'imaging

Cold Spring Harbor Protocols. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20360357

Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è un importante modello per la ricerca di base sui meccanismi molecolari sottostanti la funzione delle cellule e lo sviluppo, nonché uno strumento importante nella ricerca biomedica. Un vantaggio significativo di Drosophila è la capacità di applicare live cell imaging ad una varietà di tessuti viventi che può essere sezionata e imaging in vivo, ex vivo o in vitro. Ad esempio, tali immagini possono essere utilizzato per visual schermi genetici quali l'analisi delle caratteristiche morfologiche o della distribuzione delle proteine fluorescente contrassegnate in embrioni viventi. Infatti, gli embrioni di Drosophila hanno dimostrato di essere un sistema utile modello per lo studio di una varietà di processi cellulari come la divisione asimmetrica, migrazione, la guarigione della ferita, apoptosi e fascicolazioni, così come per rilevamento motilità gocce lipidiche, proteine riciclaggio, trasporto veloce di mRNA e il movimento dei loci cromosomici all'interno di singole celle. Un primo passo fondamentale prima di imaging è la preparazione del materiale sperimentale per garantire rilevanza fisiologica e per ottenere le migliori condizioni per la qualità dell'immagine. Perché esso contribuisce ad autofluorescenza e mancanza di trasparenza, è utile rimuovere il corion prima imaging trattando gli embrioni con la candeggina. Questo protocollo descrive la raccolta e il montaggio degli embrioni di Drosophila per imaging cellulare dal vivo.

Preparazione Dei Macrofagi Della Drosofila E Screening

Cold Spring Harbor Protocols. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20360358

Drosofila plasmatocytes, noto anche come macrofagi, fanno parte del sistema immunitario innato della drosofila e hanno anche ruoli durante lo sviluppo. In ritardo-fase embrioni, è possibile migrazione di macrofagi immagine in situ durante lo sviluppo, e quando essi convergono ai luoghi della ferita. Questo protocollo descrive l'isolamento dei macrofagi dal terzo instar larve di Drosophila. I macrofagi possono essere messi in coltura per diverse ore, e fluorescente contrassegnati macrofagi possono essere proiettati utilizzando un sistema di imaging-fluorescenza.

Preparazione Filetto Larvale Della Drosofila E Imaging Dei Neuroni

Cold Spring Harbor Protocols. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20360359

Drosofila è un sistema stabilito in cui studiare la plasticità, la funzione e lo sviluppo di synaptic. Un particolare vantaggio del sistema neuromuscolare larvale è sua coerente disposizione segmentale ben definito di neuroni e di muscolo target. Infatti, i motoneuroni del sistema nervoso centrale della drosofila sono particolarmente ben caratterizzati in termini di origine, identità, morfologia ed elettrofisiologia e sono stati utilizzati per gli studi sul trasporto assonale di organelli, vescicola traffico e riciclaggio. Per facilitare l'identificazione dei nervi e sinapsi in vivo, marcatori specifici della proteina fluorescente possono essere utilizzati. Per esempio, proteina fluorescente verde-UASmCD8 (GFP) e proteina fluorescente rosso-UASmyr (RFP) sia preferenzialmente etichetta plasma membrane, mentre grandi dischi (DLG) rivela sinapsi. GAL4 driver può essere utilizzato per indirizzare tutti i neuroni (per esempio, elavGal4) o specificamente etichetta motoneuroni (ad esempio, d42Gal4). Questo protocollo descrive la dissezione delle larve di Drosophila per isolare i neuroni per imaging cellulare dal vivo.

Live Imaging Cellulare in Drosophila Melanogaster

Cold Spring Harbor Protocols. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20360379

Sebbene molte delle tecniche di imaging cellulare live in Drosophila melanogaster sono utilizzati anche per la grande comunità dei biologi cellula lavorando su altri sistemi modello, studiando vivente tessuti fly presenta unica difficoltà per quanto riguarda mantenendo le cellule in vive, l'introduzione di sonde fluorescenti e imaging attraverso il citoplasma denso, nebbioso. In questo articolo sono illustrati i tipi di tessuto principale assoggettabile a studiare fotografia time-lapse e diversi metodi per mantenere in vita le cellule. Esso descrive le varie tecniche di imaging e associate più adatte ai seguenti cambiamenti nella distribuzione delle molecole fluorescente contrassegnati in tempo reale in questi tessuti. Imaging, in generale, è una disciplina in rapido sviluppo, e i recenti progressi nella tecnologia di imaging sono in grado di estendere notevolmente la cosa può essere realizzato con imaging diretta delle cellule dei tessuti della drosofila. Per quanto possibile, in questo articolo include i più recenti sviluppi tecnici e discute probabili sviluppi futuri in imaging metodi che potrebbero avere un impatto sulla ricerca usando della drosofila.

Segnale-dipendente Fatturato Il Batterico Flagellari Passare Proteine FliM

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20498085

La maggior parte dei processi biologici vengono eseguiti dai complessi multiproteici. Tradizionalmente descritto come entità statiche, prove ora sta emergendo che i componenti possono essere altamente dinamici, scambiando costantemente con piscine cellulare. Il motore flagellari batterico contiene circa 13 proteine differenti e fornisce un sistema ideale per lo studio funzionale molecolari complessi. È alimentato dal flusso di ioni transmembrana attraverso un anello di complessi di statore che spingere su un rotore centrale. Escherichia coli motore interruttori direzione casualmente in risposta al grippaggio del regolatore di risposta CheY al componente interruttore rotore FliM. Si sa molto della struttura motore statica, ma stiamo appena cominciando a comprendere le dinamiche dei suoi singoli componenti. Qui misuriamo la stechiometria e un fatturato di FliM in funzionamento motori flagellari, utilizzando la microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione di e. coli che esprimono genomically codificati YPet derivati di FliM a livelli fisiologici. Ci mostra che le molecole di FliM circa 30 per motore esistano in due popolazioni discrete, uno strettamente connesso con il motore e altri fatturato stocastico in corso. Questo fatturato di FliM molecole dipende dalla presenza di CheY attivo, suggerendo un ruolo potenziale in fase di accensione del motore. In molti modi il motore flagellari batterico è come un assemblaggio macromolecolare archetipo, e i nostri risultati possono avere ulteriori implicazioni per la rilevanza funzionale del fatturato della proteina in altri grandi complessi molecolari.

Rimodellamento Di Actina Corticale Dove Granuli Litici Dock a Sinapsi Immunitaria Delle Cellule Killer Naturali Rivelati Da Microscopia Di Super-risoluzione

PLoS Biology. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21931537

Naturale delle cellule Killer (NK) sono cellule del sistema immunitario innate che secernono granuli litici per uccidere direttamente le cellule infettate da virus o trasformate attraverso una sinapsi immunitaria. Tuttavia, una lacuna importante nella comprensione di questo processo è in granuli che stabilisce come litici passano attraverso le maglie della actina corticale noto sottendono alla membrana delle cellule NK. Ricerca è stato ostacolato dalla risoluzione di microscopia convenzionale, che è troppo basso per risolvere l'actina corticale durante la secrezione di granuli litici. Qui usiamo due tecniche di imaging ad alta risoluzione per sondare l'organizzazione sinaptica dei recettori delle cellule NK e filamentose (F)-actina. Una combinazione di una pinzetta ottica e microscopia confocale cell live rivela che microclusters del NKG2D assemblate in una struttura a forma di anello al centro della sinapsi intercellulare, dove Vav1 e Grb2 anche accumulare. All'interno di questa organizzazione a forma di anello di proteine delle cellule NK, granuli litici si accumulano per la secrezione. Utilizzando la microscopia illuminazione strutturata 3D (3D-SIM) per ottenere il Super-risoluzione di ~ 100 nm, actina corticale è stato rilevato in una regione centrale della sinapsi delle cellule NK indipendentemente se attivare o segnali inibitori dominano. Sorprendentemente, la periodicità della mesh actina corticale aumentato in domini specifici presso la sinapsi attivando le cellule NK. Imaging due colori Super-risoluzione ha rivelato che i granuli litici ancorata proprio in questi domini che sono stati anche prossimali al cui centro Organizzatore dei microtubuli (MTOC) polarizzati. Insieme, questi dati dimostrano che rimodellamento della mesh actina corticale si verifica presso la regione centrale della citolitica sinapsi immunitaria delle cellule NK. Questo è probabile che si verifichi per altri tipi di secrezione delle cellule e sottolinea anche l'importanza delle emergenti tecnologie di imaging di Super-risoluzione per rivelare nuova biologia.

OMX: Una Nuova Piattaforma Per L'imaging Multimodale, Multicanale Wide-field

Cold Spring Harbor Protocols. Aug, 2011  |  Pubmed ID: 21807861