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Articles by Ida Rishal in JoVE
JoVE Neuroscience
Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata
Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science
Demostramos un protocolo para el aislamiento de axoplasma del nervio ciático de rata adulta basada en la disección de los fascículos nerviosos y la incubación en un medio hipotónico para liberar la mielina y la lisis no axonal estructuras, seguido de la extracción del resto del axón material enriquecido.
Other articles by Ida Rishal on PubMed
Na + Promueve La Disociación Entre Galpha GDP Y Gbeta Gamma, Activación De Canales K + Proteína-bloqueados De G
G proteína-k canales bloqueados (GIRK o Kir3) son activados por la Unión directa de Gbetagamma o de na citosólica. Na activación es rápida, independiente de la Gbetagamma y probablemente vía directa, de baja afinidad (EC(50), 30-40 mm) de unión de na al canal. Aquí demostramos que un aumento en la concentración intracelular de na, [Na(+)](in), dentro de la gama fisiológica (5-20 mm), activa GIRK dentro de minutos a través de un mecanismo adicional, lento. Se observa la activación lenta en mutantes GIRK falta el efecto directo del na (+). Es inhibida por un limpiador de Gbetagamma, por lo tanto es Gbetagamma-dependiente; pero no requiere GTP. Presumimos que na eleva la concentración celular de Gbetagamma libre mediante la promoción de la disociación de la heterotrimer Galphabetagamma en Galpha(GDP) libre y Gbetagamma. Mediciones directas de bioquímicas demostraron que na (+) provoca una disminución moderada (aproximadamente 2) en la afinidad de la interacción entre Galpha(GDP) y Gbetagamma. Además, de acuerdo con las predicciones de nuestro modelo, activación de na lenta fue realzada por el suave coexpresión de Galpha(i3). Nuestros resultados revelan un mecanismo previamente desconocido de regulación de las proteínas G y demuestran una novela Reglamento Gbetagamma-dependiente de GIRK por na (+). Proponemos que na (+) pueden actuar como un factor regulador, o incluso un segundo mensajero, que regula los efectores vía Gbetagamma.
Mapeo De Los Sitios De Unión a Gbetagamma En GIRK1 Y GIRK2 De Subunidades De La Proteína Activada K + Canal De G
G proteína-K + canales activados (Kir3 o GIRK) son activados por la Unión directa de Gbetagamma. Los sitios de unión de Gbetagamma en el GIRK1 ubicuo subunidad (Kir3.1) no han sido inequívocamente planeadas y en el GIRK2 neuronal subunidad (Kir3.2) no se ha estudiado la Unión de Gbetagamma. Hemos verificado y ampliado el mapa de sitios de Unión Gbetagamma en GIRK1 mediante el uso de dos enfoques: Unión directa de Gbetagamma a fragmentos de subunidades GIRK (tire hacia abajo) y la competencia de estos fragmentos con la subunidad Galphai1 Unión Gbetagamma. También asignan los sitios de unión a Gbetagamma en GIRK2. En ambas subunidades, la terminal N une Gbetagamma. En la terminal C, los sitios de Gbetagamma-Unión de las dos subunidades no son idénticos; GIRK1, pero no GIRK2, tiene un segmentos previamente desconocida de interacción Gbetagamma en la primera mitad del terminal C. El principal segmento c-terminal Gbetagamma enlace encontrado en ambas subunidades se encuentra aproximadamente entre los aminoácidos 320 y 409 (por cuenta de GIRK1). Mutación de leucines C-terminal 262 o 333 en GIRK1, reconocido previamente como crucial para la regulación de la Gbetagamma del canal y de las correspondientes leucines 273 y 344 en GIRK2 alterado drásticamente las propiedades de K + corrientes GIRK1/GIRK2 vía expresa en ovocitos de Xenopus pero no apreciable redujeron la Unión de Gbetagamma a las correspondientes proteínas de fusión, indicando que estos residuos son principalmente importantes para la regulación de los cambios inducidos por Gbetagamma en canal compuerta en lugar de enlace Gbetagamma.
Galphai1 Galphai3 Diferencialmente Interaccionan Y Regular, El Proteína Activada K + Canal De G
G proteína activada k canales (GIRKs; Kir3) son activados por la Unión directa de Gbetagamma subunidades de proteínas heterotriméricas G. En tejidos nativos, sólo tos ferina sensible a la toxina G las proteínas de la familia G(i/o), preferiblemente Galpha(i3) y Galpha(i2), es donantes de Gbetagamma para GIRK. No se sabe cómo se consigue esta especificidad. Aquí, usando un método de pull-down, confirmamos la presencia de Galpha(i3-GDP), sitio en el extremo N terminal de GIRK1 de enlace e identificado sitios de unión de novela en el extremo N terminal de GIRK2 y en los términos de la C de GIRK1 y GIRK2. El no hidrolizables guanosina analógico, GTP 5' -3 - O-(metiltio) trifosfato, reduce la Unión de Galpha(i3) por un factor de 2-4. Galpha(I1-GDP) obligado a GIRK1 y GIRK2 mucho más débil que Galpha(i3-GDP). Expresión valorada de componentes de señalización vía en ovocitos de Xenopus y su activación por los receptores muscarínicos m2 reveló que G(i3) activa GIRK más eficientemente que G(i1), como se indica por las corrientes más grandes y más rápido agonista-evocado. Activación de GIRK por Gbetagamma purificada en los parches de membrana suprimido fue fuertemente aumentada por la coexpresión de Galpha(i3) y menos por Galpha(i1). Las diferencias en las interacciones físicas de GIRK con subunidades de PIB-limite Galpha, o Galphabetagamma heterotrimers, pueden dictar diferentes grados de Galphabetagamma anclaje, influyen en la eficacia de la activación GIRK Gbetagamma y desempeñar un papel en la determinación de la especificidad de señalización.
Gbetagamma-dependientes E Independientes Del Gbetagamma Actividad Basal De Canales K + Activada Por La Proteína G
Neuronales y cardiacos G proteína-K + canales activados (GIRK; Kir3) abierto tras la Unión de subunidades Gbetagamma, liberado de las proteínas Gi/o activadas por neurotransmisores. GIRKs también poseen actividad basal que contribuyen al potencial de reposo en las neuronas. Parece que dependen en gran medida de Gbetagamma libre, pero también se ha previsto un componente independiente de la Gbetagamma. Investigamos Gbetagamma dependencia de la actividad basal del GIRK (A(GIRK,basal)) cuantitativamente, por expresión valorada de Gbetagamma carroñeros, en ovocitos de Xenopus expresando GIRK1/2 canales y receptores muscarínicos m2. El tesoro de Gbetagamma ampliamente utilizado, myristoylated C terminal del beta-adrenérgico quinasa (m-cbetaARK), reducido A(GIRK,basal) un 70-80% y eliminó la corriente acetilcolina-evocado (I(ACh)). Sin embargo, encontramos que m-cbetaARK se une directamente a GIRK, que complica la interpretación de datos fisiológicos. Entre varios recién construidas Gbetagamma carroñeros, phosducin con una señal de mayor myristoylation (m-phosducin) fue más eficaz en la reducción de las corrientes GIRK. m-phosducin se trasladó a la fracción de membrana y no ató GIRK. Expresión valorada de m-phosducin ha provocado una reducción de A(GIRK,basal) hasta un 90%. Expresión de GIRK fue acompañado por un aumento en el nivel de Gbetagamma y Galpha en la membrana plasmática, apoyando la existencia de complejos preformadas de GIRK con subunidades de la proteína G. Aumento de la expresión de Gbetagamma y su asociación constitutiva con GIRK pueden ser la base de la A(GIRK,basal) excesivamente alto observado en los niveles de alta expresión de GIRK. Sólo 10-15% de A(GIRK,basal) persistieron en expresión de m-phosducin y cbetaARK. Estos resultados demuestran que una gran parte de Ibasal es Gbetagamma-dependiente en todos los niveles de expresión de la canal y sólo una pequeña fracción (< 10%) puede ser independiente de la Gbetagamma.
Cinética De Modelado De Na (+)-inducida, Activación De La Gbetagamma Dependiente De G Proteína-bloqueado K Canales
G proteína activada K(+)(GIRK) canales son activados por numerosos neurotransmisores que actúan sobre las proteínas Gi/o, mediante una interacción directa con la subunidad Gbetagamma de las proteínas G. Además, los canales GIRK positivamente son regulados por na intracelular a través de una interacción directa (vía rápida) y un mecanismo dependiente de GGbetagamma (vía lenta). La modulación lenta ha comenzado a surgir del fenómeno descrito recientemente de Na (+)-inducida por la reducción de la afinidad de la interacción entre las subunidades GalphaGDP y Gbetagamma de las proteínas G. En este escenario, elevada na mejora basal disociación de G proteína heterotrimers, elevación libre Gbetagamma celular y activar GIRK. Sin embargo, no está claro si esta hipótesis puede explicar los aspectos cuantitativos y cinéticos de la regulación observado. Aquí, se presenta el desarrollo de un modelo cuantitativo de lento, Na (+)-dependiente, activación mediada por la proteína de G de GIRK. Actividad de los canales de GIRK1F137S, que carezcan de una interacción directa con na, se midió en parches de membrana suprimido y utilizada como un indicador de niveles de GGbetagamma libres. El cambio en la actividad del canal se utilizó para calcular la Na (+)-cambio dependiente en la afinidad de la interacción de la subunidad de la proteína G. Bajo una amplia gama de condiciones iniciales, el modelo predijo que una relativamente pequeña disminución en la afinidad de la interacción de GalphaGDP y GGbetagamma (sobre la doble mayoría en condiciones) representa la activación del doble de GIRK inducida por na (+), de acuerdo con los datos bioquímicos publicados previamente. El modelo también correctamente se describe el curso del tiempo lento del efecto del na (+) y explicó la mejora observada previamente de Na (+)-inducida por la activación de GIRK por Galphai3 coexpressed. Este es el primer modelo cuantitativo que describe el equilibrio básico entre subunidades de proteína G libres y encuadernadas y sus consecuencias en la regulación de un generador de efectos GGbetagamma.
Amplitud Histograma Método Basado En Análisis De Grabaciones De Abrazadera Del Remiendo Que Implican Cambios Extremos En Los Niveles De Actividad De Canal
Muchos canales iónicos muestran actividad basal baja, que es mayor cientos veces por el correspondiente factor bloquea. Un ejemplo clásico es los activación k G-proteína-activa los canales (GIRK) por dímero de subunidades Gbetagamma. El grado de activación (actual comparado con basal), R(a), es un parámetro fisiológico importante, estimado generalmente fácilmente de grabaciones de células enteras. Sin embargo, cálculo de R(a) a menudo llega a ser no trivial en parches multicanal debido a cambios extremos en actividad después de la activación, de un patrón aparentemente un canal a otro macroscópico. En tales casos, el cálculo de la red corriente que fluye a través de los canales en el parche, que, antes y después de la activación puede requerir diferentes métodos de análisis. Para solucionar este problema, utilizamos canales GIRK neuronales activados por Gbetagamma purificada en parches suprimidos de ovocitos de Xenopus. Canales se expresaron en diferentes densidades, de algunos centenares por parche. Presentamos un método simple y rápido de calcular utilizando análisis del histograma de amplitud y establecer su exactitud comparando con lo calcula a partir de listas de eventos. Este método permite el análisis de cambios extremos en I en parches multicanales, que serían imposibles usando los métodos estándar de la idealización y la generación de listas de eventos.
Señalización Retrógrada En La Regeneración Axonal
La regeneración neuronal en el sistema nervioso periférico requiere la movilización de los mecanismos intrínsecos de neurite resultado. Este proceso depende de la señalización retrógrada entre sitio de la lesión y el soma para proporcionar información precisa y oportuna sobre la naturaleza y extensión del daño axonal, y para provocar una respuesta de las células del cuerpo apropiado. Una primera fase de señalización electrofisiológico es seguido por un conjunto de señales a motor, algunos de los cuales dependen de la traducción de proteínas local en el axón y la formación de un complejo retrógrada importins-coordinada. Además de provocar la respuesta de células del cuerpo, los análisis computacionales sugieren que este mecanismo bifásica puede proporcionar información sobre la distancia del sitio LeSon desde el cuerpo celular neuronal. Alentar a los datos recientes sugieren que puede ser posible aplicar este entendimiento emergente de los mecanismos de señalización retrógrada de activar los mecanismos intrínsecos de regeneración también en el crecimiento de las neuronas centrales refractarios.
Axoplasma Aislamiento De Los Nervios Periféricos
Cambios localizados en la composición del citoplasma axonal (axoplasma) son fundamentales para muchos procesos biológicos, incluyendo el direccionamiento del axón, las respuestas a las lesiones, el crecimiento neurítico, y las interacciones axón-glia. Los estudios bioquímicos y moleculares de estos mecanismos han sido fuertemente centrado en sistemas in vitro debido a la dificultad de obtención de extractos subcelulares de tejidos de mamíferos in vivo. Al igual que en sistemas in vitro no se puede reproducir la situación in vivo, métodos confiables de la extracción de axoplasma de los nervios en su conjunto sería muy útil para los estudios sobre los mecanismos de los axones. Aquí desarrollar y evaluar un nuevo procedimiento para la preparación de axoplasma de nervio periférico de rata, basado en la incubación de separados segements cortos de fascículos nerviosos en medio hipotónico para separar la mielina y lisar las estructuras nonaxonal, seguido por extracción de los restantes axón material enriquecido. Se demuestra que este nuevo procedimiento reduce la contaminación de células glial y el suero y facilita los análisis proteómicos de contenidos axonal.
Señalización De Redes De Transcripción En La Respuesta De Lesión Neuronal Retrógrada
Señalización retrógrada del axón hasta el soma activa los mecanismos intrínsecos de regeneración en las neuronas sensoriales periféricas lesionadas, sin embargo, los vínculos entre la señalización de lesión axonal y la respuesta de las células del cuerpo no son bien entendidos. En este caso, hemos utilizado fosfoproteómica y microarrays para implicar a unos 900 fosfoproteínas en la lesión retrógrada de señalización en los axones del nervio ciático de ratas in vivo y de cerca de 4.500 expedientes en la respuesta in vivo a una lesión en los ganglios de la raíz dorsal. Análisis computacional de estos conjuntos de datos identificado aproximadamente 400 redes redundantes de señalización axonal conectados a 39 factores de transcripción implicados en la respuesta de las neuronas sensoriales a la lesión axonal. Perturbación experimental del individuo excesivamente representados proteínas de señalización del cubo, incluyendo Abl, AKT, p38 y la proteína quinasa C, fruto afectado neuritas en las neuronas sensoriales. Paradójicamente, sin embargo, perturbación combinada de Abl junto con las proteínas otro cubo tenía un efecto reducido en relación a la perturbación de las proteínas individuales. Nuestros datos indican que las respuestas nerviosas de lesiones son controlados por múltiples elementos de regulación, y sugieren que los despidos de red proporcionan robustez a la respuesta de la lesión.
Fenotipos Conductuales Y De Otro Con Una Luz Dineína Citoplasmática Intermedio De La Cadena Un Ratón Mutante
El complejo dineína citoplasmática es de importancia fundamental para todas las células eucariotas para el transporte de una variedad de cargas esenciales a lo largo de los microtúbulos de la célula. Este complejo también desempeña funciones más especializadas en las neuronas. El complejo consta de 11 tipos de proteínas que interactúan entre sí y con los adaptadores externos, reguladores y las cargas. A pesar de la importancia del complejo dineína citoplasmática, sabemos relativamente poco de los roles de cada componente proteico, y en los mamíferos existen pocos mutantes que nos permiten explorar los efectos de los defectos de dineína procesos controlados en el contexto de todo el organismo. Aquí hemos adoptado un enfoque basado en el genotipo del ratón (Mus musculus) para analizar el papel de una subunidad, la cadena ligera de dineína intermedio 1 (Dync1li1). Nos parece que, sorprendentemente, una mutación puntual en el N235Y esta proteína resulta en el desarrollo neuronal alterada, como se muestra en los estudios in vivo en el desarrollo de la corteza, y el análisis de la función electrofisiológica. Por otra parte, los ratones mutantes muestran aumento de la ansiedad, vinculando así las funciones de dineína a un fenotipo conductual en los mamíferos, por primera vez. Estos resultados demuestran el importante papel que dineína procesos controlados por jugar en el correcto desarrollo y funcionamiento del sistema nervioso de los mamíferos.
Los Factores De Transcripción Señal Axonal Retrógrada En El Nervio Periférico Lesionado
Señalización retrógrada lesión axonal estimula respuestas de las células del cuerpo lesionadas en las neuronas periféricas. La participación de importins en el transporte retrógrado sugiere que los factores de transcripción (TF) podrían estar directamente implicados en la señalización de lesión axonal. Aquí, mostramos que el TF se encuentran varios de los axones y de asociación con la dineína en el axoplasma del nervio lesionado. Validación bioquímica y funcional para una familia TF establece que STAT3 axonal se traduce a nivel local y activado después de la lesión, y es transportado retrógradamente con la dineína y la importina α5 para modular la supervivencia de las neuronas sensoriales periféricas después de la lesión. Por lo tanto, el transporte retrógrado de TFS de los sitios de lesión axonal proporciona un vínculo directo entre el axón y el núcleo.
