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Articles by Ilana Nissim in JoVE
JoVE General
Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans
1Department of Pediatrics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania
Stabile mediante l'analisi isotopica profilazione di massa gas-cromatografia spettrometria di flusso intermediario metabolica è descritto nel nematode,
Other articles by Ilana Nissim on PubMed
Regolazione Della Sintesi Di Urea Da Agmatina Nel Fegato Perfusi: Studi Con 15N
Somministrazione di arginina o una dieta ricca di proteine aumenta il contenuto epatico di N-Acetilglutamatosintasi (NAG) e la sintesi dell'urea. Tuttavia, il meccanismo sottostante è sconosciuto. Abbiamo esplorato l'ipotesi che agmatina, un metabolita dell'arginina, possa stimolare la sintesi NAG e, quindi, sintesi di urea. Abbiamo testato questa ipotesi in un sistema di perfusione epatica per determinare 1) il metabolismo della l-[guanidino-15N2] arginina agmatina, ossido nitrico (NO), o urea; 2) epatica assorbimento di perfusato agmatina e la sua azione sul metabolismo epatico N; e 3) il ruolo di arginina, agmatina o NO nella regolazione della sintesi NAG e ureogenesi in fegati perfusi con glutammina 15N-etichettati e ammoniaca adenoide o 15NH4Cl e glutamina adenoide. I nostri risultati principali sono: 1) [guanidino-15N2] agmatina è formata nel fegato da perfusato [guanidino-15N2] l-arginina (circa il 90% dell'agmatina epatica è derivato da perfusato arginina); 2) perfusions con agmatina significativamente stimolata la sintesi di NAG 15N-etichettati e [15N] urea da ammoniaca 15N-etichettati o glutamina; e 3) l'aumento dei livelli di agmatina epatica è fortemente correlate con l'aumento dei livelli e sintesi di NAG 15N-etichettati e urea [15N]. Questi dati suggeriscono una possibile strategia terapeutica che comprende l'uso di agmatina per il trattamento della ureogenesi disturbato, se secondario a errori congeniti del metabolismo o a una malattia del fegato.
Regolazione Del Metabolismo Di Secrezione E Glutamina Insulina Stimolata Leucina in Isolotti Isolati Di Ratto
Glutammato deidrogenasi (GDH) sono regolata sia positivo (leucina e ADP) e fattori allosterici negativi (GTP e ATP). Abbiamo ipotizzato che il potenziale di fosfato di beta-cellule regola la sensibilità di stimolazione della leucina. Queste previsioni sono state testate misurando secrezione di insulina stimolata leucina in isolotti di ratto perifused seguito deplezione glucosio e tracciando il flusso di azoto [n 2-15] glutammina utilizzando tecniche di isotopo stabile. La sensibilità di stimolazione della leucina è stata rafforzata da deplezione di energia (120 min) tempo e inibita dal pretrattamento di glucosio. Dopo deplezione glucosio 50-min, leucina, non alfa-ketoisocaproate, non è riuscito a stimolare il rilascio di insulina. sensibilità beta-cellule di leucina si propone pertanto di essere una funzione di attivazione GDH. Leucina aumentato il flusso attraverso GDH 3 volte rispetto ai controlli, mentre provocando il rilascio di insulina. Glucosio alto inibito flusso attraverso sia glutaminase e GDH e leucina fu in grado di eseguire l'override di questa inibizione. Questi risultati mostrano chiaramente che leucina induce la secrezione di insulina aumentando glutaminolysis attraverso l'attivazione di glutaminase e GDH. Glucosio regola la sensibilità delle cellule beta di leucina elevando il rapporto di ATP e GTP all'ADP e P(i) e quindi diminuendo il flusso attraverso GDH e glutaminase. Questi meccanismi di forniscono una spiegazione per l'ipoglicemia causata da mutazioni di GDH nei bambini.
Metabolismo Degli Amminoacidi Cervello Dopo Il Trattamento Pentylenetetrazole
Abbiamo studiato gli effetti della pentylenetetrazole (PTZ) sul metabolismo dell'amminoacido cervello nei topi. Amministrazione di questo convulsivanti concentrazioni proencefalo di aminoacidi non cambia, ma quando gli animali trattati inoltre ha ricevuto un'iniezione di leucina [15N], che ha servito come un tracciante del metabolismo cerebrale azoto, proencefalo totale (14N + 15N) [leucina] superato il controllo e [glutammato] e [aspartato] erano meno di controllo, come concentrazioni proencefalo di glutammina glutammato e [2-15N] [15N]. Questi dati suggeriscono una maggiore assorbimento di leucina [15N] ma diminuita transaminazione della leucina di glutammato nei topi sperimentali. In contrasto con gli studi di leucina [15N], che sono stati associati con aumento cervello [leucina], l'amministrazione di alanina [15N] non ha modificato i livelli di alanina, glutammato o glutammina. Tuttavia, etichetta apparso in [2-15N] glutammina molto più facilmente con alanina [15N] rispetto con leucina [15N] come precursore e il rapporto di arricchimento in glutammina [2-15N] / [15N] alanina era molto superiore a quello di glutammina [2-15N] / [15N] leucina, una constatazione che è compatibile con metabolismo preferenziale di alanina negli astrociti, che sono il luogo primario della sintetasi glutamina cervello. Concludiamo che PTZ trattamento favorisce l'assorbimento degli aminoacidi selezionati quali leucina, ma diminuisce anche la transaminazione di leucina per produrre glutammato via aminoacidi a catena ramificata transaminasi. Trattamento PTZ può favorire la transaminazione "inversa" di 2-cheto-isocaproato (CCI), il ketoacid di leucina, per formare la leucina e consumare glutammato. Un risultato netto di questi processi possa essere per attivare il cervello più facilmente a smaltire il glutammato che è rilasciato dai neuroni durante l'attività convulsiva.
Ruolo Della Reazione Deidrogenasi Del Glutammato in Arredamento Azoto Aspartato Per La Sintesi Di Urea: Studi Nel Fegato Di Ratto Perfusi Con 15N
Il presente studio è stato progettato per determinare: (i) il ruolo dell'amminazione riduttiva di alfa-chetoglutarato tramite reazione glutammato deidrogenasi in arredamento glutammato mitocondriale e sua transaminazione in aspartato; (ii) la relativa incorporazione di perfusato 15NH4Cl, glutammina [2-15N] o [5-15N] glutammina carbammilfosfato e aspartato-N e, quindi, [15N] urea isotopomers; e (iii) nella misura in cui perfusato [15N] aspartato è preso dal fegato e incorporato in urea [15N]. Abbiamo utilizzato un sistema di perfusione di fegato contenente una miscela di aminoacidi e ammoniaca simile a concentrazioni in vivo, con etichetta 15N solo in glutammina, ammoniaca o aspartato fisiologica. I risultati dimostrano che in perfusions con una miscela di aminoacidi fisiologica, circa 45 e il 30% della produzione totale di urea-N derivava da perfusato ammoniaca e glutammina-N rispettivamente. Circa due terzi dell'ammoniaca utilizzata per la sintesi di carbamoil fosfato è stato derivato da perfusato ammoniaca e un terzo da glutammina. Perfusato [2-15N] glutammina, glutammina [5-15N] o [15N] aspartato forniti 24, 10 e 10% rispettivamente della piscina aspartato-N epatica, mentre il perfusato 15NH4Cl fornito circa il 37% di aspartato-N utilizzati per la sintesi di urea, secondaria alla formazione netta di glutammato [15N] tramite la reazione di glutammato deidrogenasi. I risultati suggeriscono che il glutammato mitocondriale formata tramite l'amminazione riduttiva di alfa-chetoglutarato può avere un ruolo chiave nella disintossicazione di ammoniaca tramite i processi seguenti: (i) d'arredo aspartato-N per ureogenesi; (ii) che serve come un tesoro per ammoniaca in eccesso; e (iii) migliorare la disponibilità di mitocondriale [glutammato] per la sintesi di N - Acetilglutamatosintasi. Inoltre, i risultati attuali suggeriscono che la formazione di aspartato tramite la reazione di mitocondriale aspartato aminotransferasi possa svolgere un ruolo importante nella sintesi di argininosuccinate citosolico.
Un Segnalazione Ruolo Della Glutammina Nella Secrezione Di Insulina
I bambini con ipoglicemia a causa della perdita recessiva delle mutazioni di funzione del potassio ATP-sensibili alla beta-cellule (K(ATP)) canale può sviluppare l'ipoglicemia in risposta alla somministrazione di proteine. Abbiamo ipotizzato che gli amminoacidi potrebbe stimolare la secrezione di insulina da meccanismi sconosciuti, perché la via del canale-dipendente K(ATP) della secrezione dell'insulina è difettosa. Abbiamo quindi studiato gli effetti degli amminoacidi sulla secrezione di insulina e calcio intracellulare in isolotti da normale e sulfonylurea knockout recettore 1 (SUR1-/-) topi. Anche se SUR1/topi sono euglicemico, loro isolette sono considerati un modello adatto per gli studi del difetto genetico umano. SUR1/isolotti, ma non normale isolotti, rilasciata insulina in risposta a una rampa di miscela di amminoacidi. Questa risposta di aminoacidi è diminuita del 60% quando la glutammina è stata omessa. Rilascio di insulina da SUR1/isolotti è stato anche stimolato da una rampa di glutamina da solo. Glutamina è stato più potente della leucina o dimetil glutammato. Calcio intracellulare basale è stato elevato in SUR1/isolotti ed è stato aumentato ulteriormente da glutammina. Nel normale isolotti, metionina sulfoximine, un inibitore di glutamina sintetasi, soppresse rilascio di insulina in risposta ad una rampa di glucosio. Questa inibizione è stata invertita di glutammina o da 6-diazo-5-oxo-l-norleucine, un analogo non metabolizzabile glutammina. Glucosio alto raddoppiato livelli di glutammina di isolotti. Inibizione di metionina sulfoximine di glucosio stimolata la secrezione di insulina è stata associata con accumulo di glutammato e aspartato. Ipotizziamo che glutamina svolge un ruolo critico come una molecola di segnalazione in aminoacidi e glucosio stimolato secrezione di insulina e tale depolarizzazione delle cellule beta ed elevazione successivo calcio intracellulare sono necessari per questo effetto di glutammina a verificarsi.
Dieta Chetogenica, Metabolismo Glutammato Cerebrale E Controllo Di Grippaggio
Non sappiamo la modalità d'azione della dieta chetogenica nel controllare l'epilessia. Una possibilità è che la dieta altera la manipolazione del cervello di glutammato, il principale neurotrasmettitore eccitatorio ed un probabile fattore evocando e perpetuare una convulsione. Abbiamo trovato che metabolismo cerebrale del chetone corpi possono arredare tanto quanto il 30% del carbonio di glutammato e glutammina. Metabolismo corpo chetonici fornisce anche l'acetil-CoA alla reazione citrato sintetasi, nel processo di consumare ossalacetato e quindi diminuendo la transaminazione di glutammato di aspartato, un percorso nel quale ossaloacetato è un reagente. Relativamente più glutammato è quindi disponibile per la reazione di decarbossilasi del glutammato, che aumenta il cervello [GABA]. Chetosi aumenta anche il cervello [GABA] di metabolismo cerebrale aumentante di acetato, che glia convertire in glutammina. Neuroni GABA-ergic prontamente prendono quest'ultimo aminoacido e usano come un precursore del GABA. Chetosi possono anche essere associato con amminoacido alterato trasporto presso la barriera emato - encefalica. In particolare, chetosi possono favorire l'uscita dal cervello di glutamina, quali trasportatori presso la barriera emato - encefalica cambio di leucina di sangue. Poiché glutammina cervello è formata negli astrociti dal glutammato, l'effetto complessivo sarà per favorire il rilascio di glutammato dal sistema nervoso.
Biosintesi Della Agmatina in Mitocondri Isolati E Perfusi Ratto Fegato: Studi Con Arginina 15N-etichettati
Una questione importante ma non risolta è se i mitocondri mammiferi metabolizzano arginina ad agmatina dalla reazione ADC (decarbossilasi dell'arginina). 15N-etichettati arginina è stato utilizzato come un precursore di affrontare questa questione e di determinare il flusso attraverso la reazione di ADC in mitocondri isolati ottenuti da fegato di ratto. Inoltre, sistema di perfusione di fegato è stato utilizzato per esaminare una possibile azione dell'insulina, glucagone o cAMP su un flusso attraverso la reazione di ADC. Nei mitocondri e perfusione epatica, 15N-etichettati agmatina è stato generato da esterno arginina 15N-etichettati. La produzione di 15N-etichettati agmatina era tempo - e dose-dipendente. La formazione del tempo-corso di [U-15N4] agmatina da arginina 2 mM [U-15N4] era meglio equipaggiata una curva esponenziale monofase con un tasso di produzione di circa 29 pmol x min(-1) x (mg di protein)(-1). Esperimenti con una crescente concentrazione (0-40 mM) di arginina [guanidino-15N2] hanno mostrato un Km costante di Michaelis per arginina di 46 mM e una Vmax di nmol 3,7 x min(-1) x (mg di protein)(-1) per il flusso attraverso la reazione di ADC. Esperimenti con i mitocondri rotti ha mostrato piccoli cambiamenti nei valori Vmax o Km, suggerendo che assorbimento di arginina mitocondriale ha avuto poco effetto sui valori osservati Vmax o Km. Esperimenti con perfusione epatica ha dimostrato che oltre il 95% dell'agmatina degli effluenti derivava da arginina perfusato [guanidino-15N2] indipendentemente dalla condizione sperimentale. Tuttavia, l'output dell'agmatina 15N-etichettati (nmol x min(-1) x g(-1)) aumentato di circa 2 volte (P < 0.05) in perfusions con cAMP. I risultati del presente studio forniscono prove convincenti che l'ADC mitocondriale è presente nel fegato di ratto e suggeriscono che cAMP può stimolare il flusso attraverso questo percorso.
Il Ruolo Dell'arginase Mitochondrially Associato Nella Regolazione Della Sintesi Di Urea: Studi Con Arginina [U-15N4], Isolato I Mitocondri E Perfusione Fegato Di Ratto
L'obiettivo principale di questo studio è quello di spiegare il ruolo del metabolismo mitocondriale arginina nella regolazione della sintesi di N-Acetilglutamatosintasi e urea. Abbiamo ipotizzato che catabolismo arginina via mitochondrially associato arginase potenziati ureogenesi fornendo ornitina per sintesi netta di citrullina, N-Acetilglutamatosintasi, glutammato e aspartato. Arginina [U-(15)N(4)] è stato usato come precursore e mitocondri isolati o perfusione epatica come sistema di modello per monitorare il catabolismo di arginina e l'incorporazione di (15) N in vari metaboliti intermedi del ciclo dell'urea. I risultati indicano che circa l'8% dell'attività totale arginase mitocondriale si trova nella matrice, e il 90% si trova nella membrana esterna. Esperimenti con i mitocondri isolati hanno dimostrato che circa il 60-70% del catabolismo di arginina esterno [U-(15)N(4)] è stato recuperato come ornitina N-etichettati (15), glutammato, N-Acetilglutamatosintasi, citrullina e aspartato. La produzione di metaboliti N-etichettati (15) era tempo - e dose-dipendente. Durante la perfusione epatica, uno contenente urea (U(m+1)) o due (U(m+2)) (15) N è stato generato da arginina perfusato [U-(15)N(4)]. L'output di U(m+2) era tra 3 e 8% di urea totale, coerenza con la percentuale di attività di arginase matrix. U(m+1) è stata costituita a seguito di produzione mitocondriale di [(15) N] glutammato da [alpha,delta-(15)N(2)] ornitina e transaminazione di [(15) N] glutammato a [(15) N] aspartato. Quest'ultimo è trasportato al citosol e incorporato in argininosuccinate. Circa 70, 75, 7 e 5% di epatica ornitina, citrullina, N-Acetilglutamatosintasi e aspartato, rispettivamente, sono stati derivati da arginina perfusato [U-(15)N(4)]. I risultati suffragare l'ipotesi che intramitochondrial arginase, presumibilmente l'isoenzimatici arginase-II, possono svolgere un ruolo importante nella regolazione della ureogenesi epatica da ornitina d'arredo per la sintesi netta di N-Acetilglutamatosintasi, citrullina e aspartato.
Risposta Del Metabolismo Degli Aminoacidi Cervello Di Chetosi
Il nostro obiettivo era di studiare il metabolismo dell'amminoacido cerebrale in risposta a chetosi. L'ipotesi sottostante è che chetosi sono associato a un cambiamento fondamentale della gestione dell'amminoacido di cervello e che questa alterazione è un fattore nell'effetto antiepilettico della dieta chetogenica. In particolare, si ipotizza che il cervello converte corpi chetonici in acetil-CoA e che questo si traduce in maggiore flusso attraverso la reazione di citrato sintetasi. Di conseguenza, ossalacetato è consumato ed è meno disponibile per la reazione di aspartato aminotransferasi; quindi, meno glutammato viene convertito in aspartato e glutammato relativamente più diventa disponibile per le reazioni glutamina sintetasi e glutammato decarbossilasi. Abbiamo trovato in un modello murino di chetosi che la concentrazione di aspartato proencefalo è stata diminuita, ma è stata aumentata la concentrazione di acetil-CoA. Studi di incorporazione di 13 C glutammato e glutammina con glucosio [1-13 C] o [2-(13) C] acetato come precursore ha mostrato che il cervello chetotico metabolizzati relativamente meno glucosio e relativamente più acetato. Quando sono stati somministrati i topi chetotici un donatore di azoto e acetato ad esempio alanina o leucina, hanno manifestato una concentrazione maggiore proencefalo di glutamina e GABA. Questi risultati supportato l'ipotesi che in chetosi c'è una maggiore produzione di acetil-CoA e una conseguente alterazione nell'equilibrio della reazione di aspartato aminotransferasi che si traduce in aspartato diminuita produzione e potenzialmente una maggiore sintesi di glutamina e GABA.
Requisiti Dell'amminoacido E Tossicità Del Cervello: L'esempio Della Leucina
L'acido glutammico è un importante neurotrasmettitore eccitatorio del cervello. Due obiettivi fondamentali della gestione dell'amminoacido cervello sono per mantenere una concentrazione agisce molto bassa di acido glutammico e anche per fornire il sistema con precursori da cui sintetizzare glutammato. Il glutammato agisce livello deve essere mantenuto basso per massimizzare il rapporto segnale-rumore dopo il rilascio di glutammato dai terminali nervosi e ridurre al minimo il rischio di eccitotossicità conseguente alla stimolazione eccessiva glutamatergico di neuroni sensibili. Il cervello deve inoltre fornire i neuroni con una costante fornitura di glutammato, che sia i neuroni e glia robustamente ossidare. Aminoacidi a catena ramificata (BCAA), particolarmente della leucina, svolgono un ruolo importante in questo senso. Leucina entra nel cervello dal sangue più rapidamente di qualsiasi altro aminoacido. Gli astrociti, che sono in stretta approssimazione ai capillari del cervello, sono probabilmente il sito iniziale del metabolismo della leucina. Un aminotrasferasi mitocondriale catena ramificata sono molto attivo in queste cellule. Infatti, dal 30 al 50% di tutti i gruppi amminici alfa del cervello glutammato e glutammina sono derivati dalla leucina da solo. Astrociti rilasciare le cognate ketoacid [alfa-ketoisocaproate (KIC)] ai neuroni, che hanno un aminotrasferasi citosolica catena ramificata che reaminates la CCI di leucina, nel processo di consumo di glutammato e fornire un meccanismo per il "buffering" del glutammato se concentrazioni diventano eccessivi. Nella malattia di urina di sciroppo d'acero, o un deficit congenito della catena ramificata deidrogenasi, può aumentare la concentrazione cerebrale di CCI e altre ketoacids di catena ramificata 10-20 volte. Questo porta ad una deplezione di glutammato e conseguente riduzione della concentrazione di glutammina cervello, aspartato, alanina e altri aminoacidi. Il risultato è un compromesso di metabolismo energetico a causa di un guasto di shuttle del malato-aspartato e un diminuito tasso di sintesi proteica.
Agmatina Stimola L'ossidazione Epatica Degli Acidi Grassi: Un Possibile Meccanismo Per Up-regulation Di Ureogenesi
Abbiamo dimostrato in precedenza in un sistema di perfusione epatica che agmatina aumenta il consumo di ossigeno, come pure la sintesi di N-Acetilglutamatosintasi e urea da un meccanismo definito. In questo studio il nostro obiettivo era quello di identificare i meccanismi comprendono da cui agmatina up-regola ureogenesi. Abbiamo ipotizzato che l'ossigeno aumentato consumo e N-Acetilglutamatosintasi e urea di sintesi sono accoppiati alla stimolazione indotta da agmatina dell'ossidazione mitocondriale degli acidi grassi. Abbiamo usato 13 acidi grassi C-etichettato come tracciante in un sistema di perfusione epatica o mitocondri isolati a monitor ossidazione degli acidi grassi e l'incorporazione di acetil-CoA C-etichetta 13 in corpi chetonici, prodotti intermedi del ciclo dell'acido tricarbossilico, aminoacidi e N-Acetilglutamatosintasi. Con [U-13 C 16] palmitato di perfusato, agmatina significativamente aumentato l'uscita di 13 C-etichetta beta-idrossibutirrato, acetoacetato e CO2, indicando stimolata ossidazione di acidi grassi. La stimolazione di [U-13 C 16] ossidazione palmitato era accompagnato da una maggiore produzione di urea e un maggiore arricchimento 13 C in N-Acetilglutamatosintasi glutammato e aspartato. Queste osservazioni suggeriscono che agmatina conduce per incorporazione aumentata e flusso di acetil-13 C-etichetta COA nel ciclo dell'acido tricarbossilico e maggiore utilizzazione di acetil-13 C-etichetta COA per la sintesi di N-Acetilglutamatosintasi. Esperimenti con i mitocondri isolati e Acido ottanoico marcato C 13 ha anche dimostrato che agmatina aumentata sintesi di 13 C-etichetta beta-idrossibutirrato, acetoacetato e N-Acetilglutamatosintasi. I dati correnti documento che agmatina stimola metaboliti mitocondriali e suggeriscono un accoppiamento tra la stimolazione dei metaboliti epatici e up-regulation di ureogenesi. Questa azione di agmatina può essere mediata attraverso un secondo messaggero come cAMP, e gli effetti sull'ossidazione ureogenesi e acidi grassi possono verificarsi contemporaneamente o in modo indipendente.
A Breve Termine Digiuno, Sequestro Controllo E Cervello Metabolismo Degli Aminoacidi
La dieta chetogenica è un trattamento efficace per i sequestri, ma il meccanismo di azione è sconosciuto. È incerto se l'effetto antiepilettico presuppone la chetosi, o se la restrizione delle calorie o di carboidrati potrebbe essere sufficiente. Abbiamo trovato che un relativamente breve periodo (24 h) di glucosio basso e apporto calorico basso attenuato notevolmente la gravità delle crisi epilettiche nei giovani ratti Sprague-Dawley (50-70 gms) nei quali convulsioni erano indotta dalla somministrazione di pentylenetetrazole (PTZ). La glicemia era bassa negli animali che hanno ricevuto meno glucosio alimentare, ma il livello di glucosio nel cervello non differiscono dal sangue di controllo [3-OH-butirrato] tendevano ad essere più elevati nel sangue, ma non nel cervello, di animali su un apporto basso-glucosio. La concentrazione nel cervello di glutamina è aumentato e quello di alanina declinarono significativamente con l'ingestione di glucosio basso. Il livello di alanina sangue cadde più di quella di alanina del cervello, con un marcato aumento (50% circa) del rapporto cervello: sangue per alanina. Al contrario, il rapporto cervello: sangue per la leucina è diminuita di circa il 35% nel gruppo di basso-glucosio. Quando gli animali ricevuto glucosio [C 1-13], un precursore metabolico di alanina, l'aspetto della (13) C in alanina e glutamina è aumentato in modo significativo rispetto al controllo. Il rapporto cervello: sangue [(13) C] alanina superato 1, che indica che l'alanina deve sono stato formato nel cervello e non trasportato dal sangue. L'elevata brain(alanine):blood(alanine) potrebbe significare che un componente dell'effetto antiepilettico del basso di carboidrati è rilascio di alanina dal cervello al sangue, nel processo di favoreggiamento allo smaltimento di glutammato, livelli in eccesso di cui nella fessura sinaptica contribuirebbe allo sviluppo di crisi epilettiche.
Effetti Di Una Mutazione GTP-insensibile Di Glutammato Deidrogenasi Sulla Secrezione Di Insulina Nei Topi Transgenici
Glutammato deidrogenasi (GDH) svolge un ruolo importante nella secrezione di insulina, come evidenziato in bambini di guadagno delle mutazioni di funzione di questo enzima che causa una Sindrome iperinsulinismo-iperammoniemia (GDH-HI) e sensibilizzare le cellule beta alla stimolazione della leucina. Topi transgenici GDH sono stati generati per esprimere la mutazione GDH-HI H454Y umano e umano selvaggio-tipo GDH in isolotti guidato dal promotore insulina ratto. Espressione del transgene H454Y è stata confermata da aumentata attività dell'enzima GDH in isolotti e diminuita sensibilità all'inibizione di GTP. I topi transgenici H454Y GDH ha avuto ipoglicemia con tassi di crescita normale. Isolotti transgenici H454Y GDH erano più sensibili alla leucina e glutamina stimola secrezione di insulina ma erano diminuita risposta alla stimolazione di glucosio. I flussi via GDH e glutaminase sono stati misurati dal flusso 15N tracciatura da glutammina [2-15N]. Il transgene H454Y in isolotti aveva maggiore secrezione di insulina in risposta a glutammina da solo e aveva 2 volte maggiore flusso GDH. Glucosio alto inibito sia glutaminase e GDH flux e leucina non potrebbe ignorare questa inibizione. 15NH4Cl analisi studi hanno mostrato 15N non fu incorporata nel glutammato in entrambi H454Y transgenici o normale isolotti. In conclusione, abbiamo generato un modello murino di malattia del GDH-HI che ha un fenotipo di ipoglicemia e ha confermato che la mutazione di H454Y è la malattia che causa. La stimolazione del rilascio di insulina tramite la mutazione H454Y GDH o attivazione della leucina è associata con aumentato Deaminazione ossidativa del glutammato via GDH. Questo studio suggerisce che la GDH funzioni prevalentemente in direzione di ossidazione del glutammato piuttosto che la sintesi di glutammato nelle isolette del mouse e che questo flusso è strettamente controllato dal glucosio.
Nefrotossicità Indotta Ifosfamide: Meccanismo E Prevenzione
L'efficacia di ifosfamide (IFO), un farmaco antineoplastico, è gravemente limitata da un'alta incidenza di nefrotossicità ad eziologia sconosciuta. Abbiamo ipotizzato che l'inibizione del complesso I (C-I) da chloroacetaldehyde (CAA), un metabolita dell'IFO, è la principale causa di nefrotossicità, e quel agmatina (AGM), che abbiamo trovato per aumentare la fosforilazione ossidativa mitocondriale e metaboliti, impedirebbe la nefrotossicità. Il nostro sistema di modello era mitocondri isolati ottenuti dalla corteccia renale di ratti trattati con IFO o IFO + AGM. La fosforilazione ossidativa è stata determinata con donatori di elettroni specifici per complessi I, II, III o IV (C-I, II C, III C o C-IV, rispettivamente). Uno studio parallelo è stato fatto con piruvato C-etichetta (13) per valutare la disfunzione metabolica. Ifosfamide trattamento significativamente inibito della fosforilazione ossidativa con solo C-I substrati. Inibizione della C-mi è stato associato con una significativa quota di [NADH], deplezione di [NAD] e diminuito flusso attraverso il ciclo TCA e piruvato deidrogenasi. Tuttavia, la somministrazione di AGM con IFO aumentato [AMP ciclico (cAMP)] e impedito inibizione indotta da IFO di C-I. Studi in vitro con vari metaboliti dell'IFO ha mostrato che solo CAA inibito C-I, anche con la supplementazione con acido solfonico 2-mercaptoethane. Dopo il trattamento IFO al giorno per 5 giorni con 50 mg/kg, il livello di CAA nella corteccia renale era circa 15 micromol/L. prese insieme, queste osservazioni supportano l'ipotesi che CAA è accumulato nella corteccia renale ed è responsabile della nefrotossicità. AGM può essere protettivo aumentando il tessuto [campo], che fosforila NADH: ossidoriduttasi. I risultati attuali possono avere un'implicazione importante per la prevenzione della nefrotossicità indotta da IFO e/o malattie mitocondriali secondarie a C difettoso-io.
Metabolismo Degli Amminoacidi Chetogenica Dieta E Cervello: Rapporto All'effetto Anticonvulsivante
In molti pazienti epilettici, anticonvulsivante farmaci o fail adeguatamente per controllare l'epilessia o che provocano gravi effetti collaterali. Un importante complemento alla terapia farmacologica è la dieta chetogenica, che spesso migliora il controllo delle crisi, anche nei pazienti che rispondono poco ai farmaci. I meccanismi che spiegano l'effetto terapeutico in modo incompleto sono capiti. Prova punti per un effetto sulla manipolazione del cervello di aminoacidi, soprattutto l'acido glutammico, il principale neurotrasmettitore eccitatorio del sistema nervoso centrale. La dieta può limitare la disponibilità di ossalacetato per la reazione di aspartato aminotransferasi, un'importante via di maneggiamento di glutammato cerebrale. Di conseguenza, più glutammato diventa accessibile per la reazione di decarbossilasi del glutammato per produrre acido gamma - aminobutirrico (GABA), il principale neurotrasmettitore inibitorio e un importante agente antiepilettici. Inoltre, la dieta chetogenica sembra favorire la sintesi di glutammina, un essenziale precursore del GABA. Questo si verifica sia perché carbonio corpo chetone viene metabolizzato a glutammina e perché in chetosi c'è aumentato consumo di acetato, che gli astrociti nel cervello rapidamente convertire in glutammina. La dieta chetogenica può anche facilitare meccanismi con cui il cervello Esporta in composti di sangue come la glutammina e alanina, nel processo favorendo la rimozione del glutammato carbonio e azoto.
Di Là Di Glicolisi Aerobica: Cellule Trasformate Possono Impegnarsi Nel Metabolismo Della Glutammina Che Supera Il Requisito Per La Sintesi Proteica E Nucleotidi
Proliferazione cellulare tumorale richiede rapida sintesi di macromolecole compresi i nucleotidi, proteine e lipidi. Molte cellule tumorali esibiscono consumo rapido di glucosio, con la maggior parte del carbonio derivato da glucosio viene secreta come lattato nonostante la disponibilità di ossigeno abbondante (l'effetto Warburg). Qui, abbiamo usato 13 spettroscopia NMR C per esaminare il metabolismo delle cellule di glioblastoma esibendo la glicolisi aerobica. In queste cellule, il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) era attivo, ma è stato caratterizzato da un efflusso di substrati per l'uso nelle vie biosintetiche, particolarmente la sintesi degli acidi grassi. Il successo di questa attività sintetica dipende dall'attivazione di percorsi di generare potere riduttivo (NADPH) e ripristinare ossalacetato per funzione di ciclo continuo TCA (anaplerosis). Sorprendentemente, entrambe queste esigenze sono state soddisfatte da un alto tasso di metabolismo della glutammina. In primo luogo, conversione di glutamina al lattato (glutaminolysis) è stato abbastanza veloce per produrre NADPH sufficienti per supportare la sintesi degli acidi grassi. In secondo luogo, nonostante il metabolismo del piruvato mitocondriale sostanziale, carbossilazione del piruvato è stato soppresso, e anaplerotic ossaloacetato è stato derivato da glutammina. Catabolismo glutammina è stato accompagnato da secrezione di alanina e ammoniaca, tale che la maggior parte dei gruppi amminici da glutammina sono stati persa dalla cellula piuttosto che incorporate in altre molecole. Questi dati dimostrano che le cellule trasformate presentano un alto tasso di consumo di glutamina che non può essere spiegato dalla domanda di azoto, imposta dalla sintesi del nucleotide o manutenzione del pool di aminoacidi non essenziali. Piuttosto, metabolismo della glutammina fornisce una fonte di carbonio che facilita la capacità della cellula di utilizzare carbonio derivato da glucosio e prodotti intermedi come precursori del ciclo TCA.
3-isobutylmethylxanthine Inibisce La Sintesi Epatica Di Urea: Protezione Da Agmatina
Abbiamo precedentemente dimostrato che agmatina stimolato ureogenesi epatica. In questo studio, abbiamo cercato di determinare se l'azione dell'agmatina è mediata tramite segnalazione cAMP. Un esperimento pilota ha dimostrato che l'inibitore della fosfodiesterasi, 3-isobutylmethylxanthine (IBMX), inibito sintesi urea, seppur aumentato [campo]. Così, abbiamo ipotizzato che IBMX inibisce la sintesi epatica di urea indipendente [campo]. Abbiamo ulteriormente teorizzato che agmatina sarebbe negare l'azione IBMX e migliorare ureogenesi. Gli esperimenti sono stati effettuati con i mitocondri isolati e Cl NH (4) (15) alla produzione di citrullina traccia [(15) N] o [5-15 N] glutammina e un sistema di perfusione fegato di ratto per traccia ureogenesi. I risultati dimostrano che IBMX indotta da quanto segue: (i) inibizione della catena respiratoria mitocondriale e diminuito consumo di apparato durante la perfusione epatica; (ii) esaurimento del potenziale di fosforilazione e capacità energetica complessiva epatica; (iii) inibizione di [(15) N] sintesi citrullina; e (iv) inibizione dell'uscita della perfusione epatica con poco effetto su [N-Acetilglutamatosintasi] urea. I risultati indicano quel complesso IBMX direttamente e specificamente inibito I respiratori catena e carbamoil fosfato sintasi-ho (CPS-ho), con un EC(50) di circa 0,6 mm nonostante una notevole elevazione di epatica [campo]. Perfusione di agmatina con IBMX stimolato apparato consumo, restaurato potenziale di fosforilazione epatica e stimolato significativamente ureogenesi. L'azione dell'agmatina può significare un effetto a cascata iniziato da aumentata della fosforilazione ossidativa e una maggiore sintesi di ATP. Inoltre, agmatina può impedire IBMX associazione a uno o più active site(s) di CPS-io e quindi proteggere contro l'inibizione della CPS-io. Insieme, i dati potrebbero suggerire una nuova applicazione sperimentale di IBMX negli studi di CPS-I malfunzionamenti e l'uso di agmatina come terapia di intervento.
N-carbamylglutamate Migliora Marcatamente Ureogenesi in N-Acetilglutamatosintasi Deficit E Propionico Acidemia Come Misurato Da Biomarcatori Isotopiche Di Incorporazione E Sangue
N-Acetilglutamatosintasi (NAG) sono un cofattore essenziale endogeno per la conversione di ammoniaca in urea nel fegato. Deficit di NAG provoca iperammoniemia e si verifica a causa di deficit ereditato di sua produzione enzima, NAG sintetasi (NAGS) o interferenza con la sua funzione di derivati degli acidi grassi breve. N-carbamylglutamate (NCG) può migliorare iperammoniemia da deficit di NAGS e acidemia propionica e metilmalonica. Abbiamo sviluppato un isotopo stabile (13) C tracciante metodo per misurare ureogenesi e per valutare l'effetto di NCG negli esseri umani. Diciassette adulti sani sono stati studiati per l'incorporazione dell'etichetta C (13) in urea. [(13) C] urea apparve nel sangue in pochi minuti, raggiungendo il massimo da 100 min, considerando che respiro (13)CO(2) raggiunto un massimo di 60 min. Un paziente con deficit di NAGS ha mostrato molto poco urea etichettatura prima del trattamento con NCG ed etichettatura normale da allora in poi. Corrispondentemente, i livelli plasmatici di ammoniaca e di glutamina è diminuito notevolmente e urea triplicato dopo trattamento NCG. Analogamente, in un paziente con acidemia propionica, trattamento NCG provocato un marcato aumento urea etichettatura e diminuzione di glutammina, alanina e glicina. Questi risultati forniscono un metodo affidabile per misurare l'effetto di NCG sul metabolismo dell'azoto e suggeriscono fortemente che NCG potrebbe essere un efficace trattamento per il deficit di NAGS ereditati e secondario.
Eliminazione Dei Canali KATP Nelle Isolette Del Mouse Si Traduce in Elevati [C U-13] Metabolismo Del Glucosio, Glutaminolysis E Piruvato Ciclismo Ma Un Diminuzione Acido Gamma - Aminobutirrico Shunt
Le cellule beta del pancreas sono iper-sensibile di aminoacidi ma sono diminuite la sensibilità di glucosio dopo l'eliminazione del recettore sulfonylurea 1 (SUR1) sia in uomo e topo. È stato ipotizzato che questi difetti sono la conseguenza di una ridotta integrazione di aminoacidi, glucosio e metabolismo energetico nelle cellule beta. Abbiamo utilizzato la metodologia gas cromatografia spettrometria di massa per studiare il metabolismo intermedio di SUR1 knock-out (SUR1(-/-)) e controllo mouse isolotti con [U-(13) C] d-glucosio come substrato e relativi risultati secrezione di insulina. I livelli e isotopo etichettatura di alanina, aspartato, glutammato, glutammina e acido gamma - aminobutirrico (GABA) servì come indicatori del metabolismo intermedio. Abbiamo trovato che lo shunt GABA di isolotti SUR1(-/-) è bloccato da circa il 75% e ha mostrato che questo difetto è dovuto alla sintesi di diminuito glutammato decarbossilasi, probabilmente causata da elevati calcio libero intracellulare. Glutaminolysis stimolata dall'acido d,l-beta-2-amino-2-norbornane-carboxylic analogica della leucina è stata, tuttavia, migliorata in SUR1(-/-) e trattati glyburide SUR1(+/+) isolotti. Ossidazione del glucosio e piruvato ciclismo è stato aumentato in isolotti SUR1(-/-) al glucosio basso ma era lo stesso controlli alla glicemia alta. Enzima malico isoforme 1, 2 e 3, coinvolti in piruvato ciclismo, sono stati espressi in isolotti. Glucosio alto abbassato aspartato e stimolato la sintesi di glutammina similmente in controlli e isolotti SUR1(-/-). I dati suggeriscono che l'interruzione di shunt GABA e la mancanza di regolazione del glucosio del piruvato in bicicletta può causare l'insensibilità di glucosio di isolotti SUR1(-/-) ma che enhanced basale piruvato ciclismo, flusso di shunt GABA abbassato e glutaminolytic rafforzata capacità possono sensibilizzare le cellule beta alla stimolazione dell'amminoacido.
Myc Regola Un Programma Trascrizionale Che Stimola Glutaminolysis Mitocondriale E Porta Alla Dipendenza Di Glutammina
Le cellule di mammiferi di carburante la loro crescita e proliferazione attraverso il catabolismo delle due principali substrati: glucosio e glutammina. La maggior parte dei restanti metaboliti presi dalle cellule proliferanti non sono catabolizzata, ma invece sono usata come blocchetti di costruzione durante la sintesi macromolecolare anabolizzanti. Le indagini di phosphoinositol-3-chinasi (PI3K) e relativo effector downstream AKT hanno confermato che questi oncogeni giocano un ruolo diretto nell'assorbimento del glucosio e stimolanti del metabolismo, rendendo la cellula trasformata addicted di glucosio per il mantenimento della sopravvivenza. Al contrario, meno è conosciuto circa il regolamento di glutammina assorbimento e metabolismo. Qui, segnaliamo che la proprietà transcriptional normativa dell'oncogene Myc coordinare l'espressione dei geni necessari per le cellule a impegnarsi nel catabolismo di glutamina che supera il requisito per la biosintesi della proteina e nucleotide cellulare. Una conseguenza di questo glutaminolysis Myc-dipendente è la riprogrammazione del metabolismo mitocondriale a dipendono dal catabolismo di glutammina per sostenere la vitalità cellulare e TCA ciclo anapleurosis. La capacità delle cellule che esprimono Myc di impegnarsi in glutaminolysis non dipende dalla concomitante attivazione di PI3K o AKT. La stimolazione del metabolismo mitocondriale glutammina portato in carbonio glucosio ridotto entrando il ciclo TCA e un diminuito apporto di glucosio per la sintesi mitocondriale-dipendente dei fosfolipidi. Questi dati suggeriscono che livelli oncogeni di Myc inducono un programma trascrizionale che promuove glutaminolysis e innesca la dipendenza da cellulare di glutamina come substrato bioenergetico.
Gestione Di Chetosi E Cervello Di Glutammato, Glutammina E GABA
Ipotizziamo che un meccanismo dell'effetto antiepilettico della dieta chetogenica è alterare la manipolazione del cervello di glutammato. Secondo questa formulazione, nel cervello chetotico Astrocita metabolismo è più attivo, con conseguente maggiore conversione di glutammato in glutammina. In questo modo: (a) più efficiente rimozione del glutammato, il più importante neurotrasmettitore eccitatorio; e (b) conversione più efficiente di glutamina in GABA, il principale neurotrasmettitore inibitorio.
Effetti Di Una Singola Dose Di N-carbamylglutamate Sul Tasso Di Ureogenesi
Abbiamo studiato l'effetto sulla ureogenesi di una singola dose di N-carbamylglutamate (NCG) in giovani adulti sani che hanno ricevuto un'infusione costante (300 min) di NaH(13)CO(3). Spettrometria di massa rapporto isotopico è stata utilizzata per misurare l'aspetto dell'etichetta [(13) C] urea. A 90 min dopo l'avvio della H (13) CO3-infusione ogni soggetto ha preso una dose singola di NCG (50 mg/kg). In 5/6 studi la somministrazione di NCG aumentato la formazione di [(13) C] urea. Trattamento con NCG diminuito significativamente la concentrazione di alanina sangue, ma non quello di glutammina o arginina. La glicemia è stata influenzata dalla somministrazione di NCG. Sono stati osservati effetti collaterali spiacevole. I dati indicano che il trattamento con NCG stimola ureogenesi e potrebbe essere utile in situazioni cliniche di iperammoniemia acuta di varie eziologie.
Misurazione in Vivo Ureogenesi Con Isotopi Stabili
Isotopi stabili sono state un prezioso complemento alla ricerca biomedica per più di 70years. Infatti, l'approccio isotopica ha rivoluzionato la nostra comprensione del metabolismo, rivelando di essere un processo intensamente dinamico caratterizzato da un incessante ciclo di sintesi e degradazione. Studi isotopici ci hanno insegnato che il ciclo dell'urea è intrinseco a tale dinamismo, poiché essa offre un capiente meccanismo mediante il quale eliminare rifiuto azoto quando i tassi di degradazione delle proteine (o l'assunzione di proteine nella dieta) sono particolarmente alti. Gli isotopi hanno permesso un apprezzamento per il grado a cui ureogenesi sono compromessa in pazienti con difetti ciclo urea. Infatti, studi isotopici di urea cycle flux in correlazione con la severità del deficit cognitivo in questi pazienti. Infine, l'uso di isotopi offre uno strumento con cui valutare l'efficacia degli interventi terapeutici di aumentare il flusso residuo attraverso il ciclo ideale.
Down-regulation Della Sintesi Epatica Di Urea Da Oxypurines: Xantina E Acido Urico Inibisce La N-acetilglutamato Sintetasi
Abbiamo segnalato in precedenza che isobutylmethylxanthine (IBMX), un derivato di oxypurine, inibisce la sintesi di citrullina tramite un meccanismo ancora sconosciuto. Qui, noi dimostrare che IBMX e altri oxypurines che contiene un gruppo di 2,6-dione interferisce con il legame del glutammato nel sito attivo di N-acetilglutamato sintetasi (NAG), riducendo la sintesi di N-Acetilglutamatosintasi, l'attivatore obbligatoria di carbamoil fosfato sintetasi-1 (CPS1). Il risultato è la riduzione della sintesi di citrullina e urea. Esperimenti erano eseguiti con (15) con etichetta N substrati, purificato CPS1 epatica e mouse ricombinante NAGS come pure mitocondri isolati. Abbiamo usato anche negli epatociti isolati per esaminare l'azione dei vari oxypurines su ureogenesi e per valutare l'effetto di N-carbamylglutamate e/o l-arginina su NAGS inibizione migliorare. Tra i vari oxypurines testati, solo IBMX, xantina o acido urico significativamente aumentato l'apparente K(m) per glutammato e diminuita velocità di RONZINI, con scarso effetto sulla CPS1. L'inibizione di nag è tempo - e dose-dipendente e conduce alla formazione diminuita la CPS1-N-Acetilglutamatosintasi complesse e conseguente inibizione della sintesi citrullina e urea. Tuttavia, tale inibizione è stata invertita da integrazione con N-carbamylglutamate. I dati dimostrano che la xantina e acido urico, sia oxypurines che si verificano fisiologicamente, inibiscono la sintesi epatica di N-Acetilglutamatosintasi. Un concetto importante e romanzo emergono da questo studio è quello xantina e/o acido urico possono avere un ruolo nella regolazione della ureogenesi e, quindi, l'omeostasi dell'azoto negli stati normali e malattia.
