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Articles by Ilya A. Shestopalov in JoVE
JoVE General
Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University
Dieses Protokoll zeichnet ein Weg, um Etiketten und Spurenelemente das Schicksal der kleinen Gruppen von Zellen Zebrafischembryonen mit UV-Uncaging der Käfig Fluorescein, durch whole mount Immunomarkierung, um das Signal aus dem uncaged Fluoreszein verstärken gefolgt.
Other articles by Ilya A. Shestopalov on PubMed
Lichtgesteuerte Gen-silencing in Den Zebrafish Embryos
Genomische Funktionsstudien in Zebrafish verwenden häufig synthetische Oligonukleotide genannt Morpholinos, die RNA-Spleißen oder Übersetzung zu blockieren. Allerdings schränkt die konstitutive Aktivität der diese Reagenzien die ein experimentelle Programm. Wir berichten hier die Synthese einer Photoactivatable Morpholino gezielt das kein Schwanz (Ntl)-Gen. Dieser Käfig Reagenz erlaubt raumzeitliche Genregulation in-vivo und die photochemische Generation funktional Mosaik Organismen.
Chemische Technologien Zur Sondierung Der Embryonalen Entwicklung
Embryogenese ist ein bemerkenswertes Programm der Zellproliferation, Migration und Differenzierung, die eine einzige befruchtete Eizelle in einem komplexen vielzelligen Organismus umwandelt. Verständnis dieses Prozesses auf der molekularen und Systeme erfordert einen interdisziplinären Ansatz, einschließlich die Konzepte und Technologien der chemischen Biologie. Dieses Lernprogramm Überprüfung bietet eine Übersicht über chemische Werkzeuge, die benutzt wurden, in der Entwicklungsbiologie Forschung konzentriert sich auf Methoden, die raumzeitliche Kontrolle der Genfunktion und die Visualisierung der embryonalen Musterung zu ermöglichen. Einschränkungen der aktuellen Ansätze und Herausforderungen der Zukunft werden auch erläutert.
Vielseitige Synthese Und Rationelle Gestaltung Der Käfig Morpholinos
Embryogenese wird durch genetische Programme, die dynamisch auf stereotype Weise ausgeführt werden, und Entzifferung dieser molekularen Mechanismen erfordert die Fähigkeit, embryonalen Genfunktion mit ähnlichen räumlichen und zeitlichen Präzision zu steuern. Chemische Technologien können derartige genetischen Manipulationen, wie durch den Einsatz von Käfig Morpholino (cMO) Oligonukleotide an Genen im Zebrafisch und andere optisch transparenten Organismen mit raumzeitliche Steuerelement zu inaktivieren. Hier berichten wir optimierte Methoden für das Design und die Synthese der Einbeziehung einer Dimethoxynitrobenzyl (DMNB) Haarnadel-cMOs-basierten bifunktionelle Linker, die GMO für Montage in nur drei Schritten aus handelsüblichen Reagenzien erlaubt. Bei diesem vereinfachte Verfahren haben wir systematisch vorbereitet cMOs mit unterschiedlichen strukturellen Konfigurationen und untersucht, wie die in-vitro-thermodynamischen Eigenschaften von diese Reagenzien mit ihren in-vivo Aktivitäten korrelieren. Durch diese Studien haben wir Allgemeine Gestaltungsleitsätze GMO gegründet und erfolgreich angewendet, um mehrere Entwicklungsstörungen Gene. Unsere optimierte Kunststoff und Design, die Methoden konnten wir eine nächste Generation GMO vorzubereiten, die eine Bromohydroxyquinoline (BHQ) enthält auch-Linker für zwei-Photonen-uncaging basiert. Zusammen diese Fortschritte der Allgemeingültigkeit der GMO-Technologien schaffen und erleichtert die Anwendung der die chemischen Sonden in-vivo für genomische Funktionsstudien.
Oligonukleotid-basierte Tools Für Zebrafisch-Entwicklung Zu Studieren
Nonnatural und synthetischen Oligonukleotide wurden ausgiebig Genfunktion in Zebrafisch Verhören verwendet. In diesem Bericht befragen wir die Möglichkeiten und Grenzen verschiedener Oligonukleotid-basierte Technologien für RNA-Funktion hineingebracht und tracking-RNA Ausdruck. Wir prüfen auch den letzten Strategien zum Erreichen der raumzeitliche Kontrolle der Oligonukleotid-Funktion, insbesondere Licht-Gating-Technologien, die die optische Transparenz der Zebrafisch-Embryonen zu nutzen.
Raumzeitliche Kontrolle Der Embryonalen Genexpression Mit Käfig Morpholinos
Embryonalentwicklung hängt von der räumlichen und zeitlichen Steuerung der Genfunktion und Entschlüsselung der molekularen Mechanismen, die Strukturbildung zugrunde liegen Methoden für hineingebracht Genexpression mit ähnlicher Präzision erfordert. Neue chemische Technologien können solche Störungen, wie durch den Einsatz von Käfig Morpholino (cMO) Oligonukleotide an Foto-Gene in den Zebrafish Embryos mit raumzeitliche Steuerelement inaktivieren. Dieses Kapitel beschreibt Allgemeine Gestaltungsleitsätze cMO und Methoden für GMO Assembly in drei Schritten aus handelsüblichen Reagenzien. Experimentelle Techniken für die Mikroinjektion und Photoaktivierung diese Reagenzien sind beschrieben im Detail sowie die Vorbereitung und Anwendung der Käfig Fluoreszein Dextran (cFD) zum Beschriften von bestrahlten Zellen. Verwenden diese Protokolle, ist cMOs effiziente Tools zur genomischen Funktionsstudien in Zebrafisch und sonstige Modellorganismen.
Raumzeitliche Auflösung Der Ntla Transkriptom Axial Mesoderm Entwicklung
Transkriptionsfaktoren haben unterschiedliche Rollen während der Embryonalentwicklung, combinatorially Steuerung zelluläre Staaten in einer räumlich und zeitlich definierte Weise. Auflösen der dynamischen transkriptionelle Profile, die diese Musterung Prozesse zugrunde liegen, ist essentiell für Verständnis Embryogenese auf molekularer Ebene. Hier zeigen wir wie Temporale, Gewebe-spezifischen Änderungen in embryonalen Transkription Faktor Funktion erkannt werden können, durch die Integration mit Käfig Morpholino Oligonucleotides mit Photoactivatable Fluorophore, Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren und Microarray Technologien. Als Beweis des Prinzips, haben wir keinen Schwanz ein (Ntla) dynamisch profiliert-abhängigen Gene in verschiedenen Entwicklungsstadien axial Mesoderm in Zebrafisch, diskrete Gruppen von Abschriften, die zusammenfallend mit Chorda dorsalis Zelle Schicksal Engagement oder Differenzierung sind zu entdecken. Unsere Studien zeigen neue Regler der Chorda dorsalis Entwicklung und die sequenzielle Aktivierung der unterschiedlichen Transcriptomes innerhalb einer Zelle-Linie durch einen einzigen transcriptional Faktor und demonstrieren wie optisch kontrolliert, dass chemische Werkzeuge können Entwicklungsprozesse mit raumzeitliche Präzision zu sezieren.
