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Articles by Ingrid Brust-Mascher in JoVE
JoVE General
Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale
Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, Davis
Questo protocollo descrive l'uso di microiniezione e di imaging ad alta risoluzione nel
Other articles by Ingrid Brust-Mascher on PubMed
Flusso Dei Microtubuli E Scorrevoli in Fusi Mitotici Di Embrioni Della Drosofila
Abbiamo proposto che mandrino morfogenesi negli embrioni della drosofila comporta la progressione attraverso quattro strutture isometriche transitori in cui una spaziatura costante dei poli mandrino è mantenuto da un equilibrio di forze generate da molteplici motori di microtubuli (MT) e ribaltamento che questo equilibrio unità separazione pole-pole. Qui abbiamo usato Microscopia di fluorescenza speckle per valutare l'influenza delle dinamiche MT sullo stato isometrico che persiste attraverso metafase e anafase A e sulla separazione di pole-pole in anafase B. Durante la metafase e anafase A, fluorescente punctae il cinetocore e interpolar MTs flusso verso i poli a 0,03 microm/s, troppo lenta per movimento di unità tra cromatidi fratelli a poli a 0,11 microm/s e durante l'anafase B, punctae fluorescente su MTs interpolar allontanarsi dall'equatore mandrino allo stesso tasso come i polacchi, coerenti con scorrevole MT-MT. Perdita della Ncd, un candidato flusso motore o freno, non influisce sulla flux in metafase/anafase A stato isometrica o MT scorrevole in anafase B ma diminuito la durata dello stato isometrico. I nostri risultati suggeriscono che, in tutto questo stato isometrico, una forza verso l'esterno esercitata sui poli mandrino da MT motori a scorrimento è bilanciata dal flusso e che soppressione del flusso potrebbe pendere l'equilibrio di forze all'inizio dell'anafase B, permettendo MT scorrevole e polimerizzazione a spingere oltre i poli.
Divisione Delle Cellule
Nel creare il fuso mitotico e l'anello contrattile, la selezione naturale ha progettato macchine di precisione affascinante cui movimenti dipendono da forze generate dall'ensemble di proteine citoscheletriche. Queste macchine segregano i cromosomi e dividono la cella con l'alta fedeltà. La ricerca attuale sui meccanismi e regolazione della morfogenesi mandrino, cromosoma motilità e Citocinesi in sottolinea come Ensemble di polimeri dinamiche del citoscheletro e più motori cooperano per generare le forze che guidano la cellula in mitosi e Citocinesi in.
Chromokinesin, KLP3A, Immersioni Separazione Pole Mitotico Durante Prometafase E Anafase E Facilita La Motilità Cromatidio
Mitosi richiede le attività concordate del microtubule multiple (MT)-basato su proteine motrici. Qui abbiamo esaminato il contributo della chromokinesin, KLP3A, ai movimenti di morfogenesi e cromosoma mitotico in drosofila embrioni e cellule coltivate S2. Con l'immunofluorescenza, KLP3A associa punctae nonfibrous che si concentrano nei nuclei e visualizzare le associazioni MT-dipendente con mandrini. Questi punctae concentrato nell'indistinti domini associati con cromosomi e centrale fusi e fasce distinte forma associate midbodies telofase. La perturbazione funzionale di KLP3A da anticorpi o proteine negative dominante in embrioni o di interferenza del RNA (RNAi) nelle cellule di S2, non bloccare la mitosi ma produce difetti di fusi mitotici. Time-lapse osservazioni confocale di mitosi in embrioni di vita rivelano che l'inibizione KLP3A sconvolge l'organizzazione del interpolar (ip) MTs e produce Mandrini corti. Analisi cinetica suggeriscono che KLP3A contribuisce a mandrino separazione Polo durante la transizione della metafase prometafase (quando esso antagonizza Ncd) e anafase B, per tariffe normali della motilità cromatidi durante l'anafase A e per la corretta spaziatura dei nuclei della figlia durante la telofase. Proponiamo che KLP3A agisce su MTs associati con bracci del cromosoma e il perno centrale per organizzare i fasci di interessi, alla separazione di azionamento mandrino pole e a facilitare la motilità Cromatidio.
Due Motori Di Trasporto Dell'omologo Anterograda Cooperano Per Costruire Ciglia Sensoriali Su Neuroni Di C. Elegans
Ciglia hanno ruoli diversi nella motilità e ricezione sensoriale e loro disfunzione contribuisce a malattie ciglia. Montaggio e manutenzione di ciglia dipende il trasporto dell'omologo (IFT) dell'assonema, membrana, matrix e proteine segnalamento appropriato destinazioni all'interno dell'organello. Nel modello corrente, queste proteine diverse cargo associare a più siti su particelle IFT macromolecolare, che sono mossi da un motore a singola anterograda IFT, chinesina-II, dalla base ciliare alla sua estremità distale, dove si verifica lo scarico di merci. Qui, descriviamo l'osservazione di fluorescenti IFT motori e IFT particelle in movimento lungo domini distinti all'interno di ciglia sensoriali di tipo selvatico e IFT-motore-mutante Caenorhabditis elegans. Mostriamo che holoenzymes motore due anterograda IFT, chinesina-II e Osm-3-chinesina, collaborare in modo sorprendente per controllare due percorsi di IFT che costruire parti distinte di ciglia. Invece di ciascun motore in movimento indipendentemente il proprio carico specifico per una destinazione diversa, i due motori funzione ridondante per il trasporto di particelle IFT lungo microtubuli doppietto adiacenti alla zona di transizione per formare il segmento medio assonema. Successivamente, Osm-3-chinesina solo trasporta particelle IFT lungo i microtubuli singoletto distale per stabilizzare il segmento distale. Così, il sottile attività coordinate di questi motori IFT crea due percorsi di trasporto sequenziale.
Dinamica Fuso Mitotico in Drosofila
Mitosi, il processo mediante il quale i cromosomi replicati sono segregati ugualmente in cellule della figlia, sono stato studiato per oltre un secolo. Drosophila melanogaster è un organismo ideale per questa ricerca. Embrioni di Drosophila sono particolarmente adatti per mitosi di immagine, perché durante i cicli di 10-13 nuclei dividono rapidamente sulla superficie dell'embrione, ma cellule mitotic durante stadi larvali e spermatociti sono utilizzate anche per lo studio della mitosi. Drosofila può essere facilmente mantenuta, esistono molti stock mutante e mosche transgenici che esprimono le proteine mutate o fluorescente contrassegnate possono essere fatto. Inoltre, il genoma è stato completato, e l'interferenza del RNA può essere utilizzato nelle cellule di coltura del tessuto della drosofila. Qui, passiamo in rassegna la nostra attuale comprensione della dinamica del mandrino, guardando gli esperimenti e quantitativa di modellazione su cui si basa. Molti giocatori molecolari in mitotico drosofila sono simili a quelle dei mammiferi mandrini, così risultati in drosofila possono essere estesa ad altri organismi.
Analisi Quantitativa Di Un Interruttore Di Anafase B: Ruolo Previsto Per Un Gradiente Di Catastrofe Dei Microtubuli
Anafase B negli embrioni della drosofila viene avviata tramite l'inibizione di depolimerizzazione dei microtubuli (MT) a poli mandrino, che permette scorrevoli esteriormente MTs interpolar (ip) alla separazione di disco polo-Polo. Tramite fluorescenza recovery dopo photobleaching, abbiamo osservato che MTs in tutto l'alberino preanaphase B sono molto dinamiche e visualizzare il completo recupero della fluorescenza, ma durante l'anafase B, MTs prossimale ai poli stabilizzare e quindi visualizzare recupero inferiore rispetto a quelli altrove. Microscopia di fluorescenza del tracker MT punta EB1 ha rivelato che la crescente MT più finisce localizzare tutto il mandrino preanaphase B ma concentrato nella regione di sovrapposizione di MTs interpolar (ipMTs) all'esordio anafase B. Nessuno di questi cambiamenti si sono verificati in presenza di imputrescibile ciclina che b. modellazione suggerisce che essi dipendono l'istituzione di un gradiente spaziale di MT plus-fine catastrofe frequenze, diminuendo verso l'equatore. La conseguente ridistribuzione di ipMT più finisce per la zona di sovrapposizione, insieme con la soppressione di depolimerizzazione minus-fine ai poli, potrebbe costituire un interruttore meccanico che iniziati mandrino allungamento.
Partizionamento Dinamico Di Mitotica Chinesina-5 Cross-linkers Tra Stati Associata Ai Microtubuli E Liberamente Diffondente
Il comportamento dinamico di homotetrameric chinesina-5 durante la mitosi è scarsamente compreso. Chinesina-5 può funzionare solo dall'associazione, cross-linking e scorrevoli microtubuli adiacenti mandrino (MTs), o, in alternativa, può associare a una stabile "matrice mandrino" per generare movimenti mitotici. Abbiamo creato transgenici Drosophila melanogaster, esprimendo la chinesina fluorescente-5, KLP61F-GFP, in uno sfondo mutante di klp61f, dove salvò mitosi e vitalità. KLP61F-GFP si localizza a MT interpolar fasci, metà fusi e gli astri e si arricchisce intorno ai poli mandrino. Nel recupero della fluorescenza dopo esperimenti photobleaching, KLP61F-GFP Visualizza mobilità dinamica simile alla tubulina, che è incompatibile con un sostanza pool statico di chinesina-5. I dati sono conformi ad un modello di reazione-diffusione, in cui la maggior parte dei KLP61F è associata al mandrino MTs, con il resto di diffondere liberamente. KLP61F sembra legare transitoriamente MTs, brevi distanze lungo li prima di smontare in movimento. Così, chinesina-5 motori possono funzionare da cross-linking e scorrevole mandrino adiacente MTs senza la necessità di una matrice statica mandrino.
Implicando Chinesina-5-dipendente Disossidante E Mandrino Lunghezza Controllo Nella Mitosi Dell'embrione Di Drosophila
Abbiamo usato la microiniezione anticorpale e manipolazioni genetiche per sezionare i vari ruoli del homotetrameric chinesina-5, KLP61F, in astrali, comandato da Centrosoma mandrini embrione della drosofila e per testare l'ipotesi che scivola microtubuli apart interpolar (ip) (MT), controllando così il flusso perturbato e lunghezza del mandrino. Nel wild-type e Ncd null embrioni mutanti, anti-KLP61F dissociato il motore da mandrini, producendo un gradiente spaziale del contenuto KLP61F di diversi fusi, che era visibile in embrioni transgenici KLP61F-GFP. I difetti risultanti mitotici, supportati da esperimenti di dosaggio del gene e microscopia time-lapse di vivere klp61f mutanti, rivelano che, dopo il NEB, KLP61F unità persistente MT impacchetta e lo scorrimento verso l'esterno delle MTs antiparallelo, contribuendo così a diversi processi che tutto appare insensibile alla interruzione corticale. KLP61F attività contribuisce per il flusso perturbato di ipMTs e di cinetocore MTs e la lunghezza del mandrino metafase. KLP61F attività mantiene il prometafase mandrino da inimicarsi Ncd e anafase generatore di forza e unità sconosciuta un altro B, anche se il tasso di allungamento mandrino è relativamente insensibile alla concentrazione del motore. Infine, KLP61F attività contribuisce alla normale cromosoma congression, spaziatura cinetocore e tariffe A anafase. Così, un meccanismo di scorrimento filamento KLP61F-driven contribuisce a molteplici aspetti della mitosi in questo sistema.
Mandrino Prometafase Manutenzione Da Un Antagonista Dipendente Dal Motore Forza Equilibrio Fatto Robusto Da Una Busta Di Lamin-B Smontaggio
Abbiamo testato l'ipotesi classica che astrale, prometafase fusi mitotici bipolare sono mantenuti da equilibrato verso l'esterno e verso l'interno le forze esercitate sui pali del mandrino da chinesina-5 e -14 tramite la modellazione dei dati in vitro e in vivo da embrioni di Drosophila melanogaster. Tutto prometafase, puncta di entrambi i motori allineato su interpolar microtubuli (MTs [ipMTs]), e perturbazione motore cambiato lunghezza mandrino, come previsto. Motilità competitivo di purificato chinesina-5 e -14 è stato ben descritto da un modello di corsa potenza stocastico, avversaria che incorpora il motore cinetica e distacco di carico-dipendente. Parametri motore da questo modello sono stati applicati ad un nuovo modello di forza-equilibrio stocastico per mandrini prometafase, fornendo un buon adattamento ai dati da embrioni. Manutenzione di virtual mandrini ipMTs dinamica necessaria e una gamma ristretta di chinesina-5 chinesina-14 rapporti corrispondenti che si trovano negli embrioni. Modellazione e delle perturbazioni funzionali suggeriscono che questo intervallo può essere esteso in modo significativo da una busta di lamina-B smontaggio che circonda il mandrino prometafase e potenziati la chinesina finemente sintonizzato, antagonista della forza equilibrio a mantenere robuste prometafase fusi come assemblare MTs e cromosomi sono spinti verso l'equatore.
Un Mitotic Chinesina-6, Pav-KLP, Media Interdipendenti Dinamiche Di Riorganizzazione E Mandrino Corticali Negli Embrioni Della Drosofila
Abbiamo studiato il ruolo della Pav-KLP, una chinesina-6, il coordinamento del mandrino e dinamica corticale durante la mitosi negli embrioni della drosofila. In vitro, Pav-KLP si comporta come un dimero. In vivo, localizza ai solchi e fusi mitotici. Inibizione della Pav-KLP causa difetti sia dinamica del mandrino e solco ingressione, nonché provocando cambiamenti nella distribuzione dell'actina e vescicole. Così, Pav-KLP stabilizza il mandrino da fasci di microtubuli interpolar reticolazione e contribuisce alla formazione del solco di actina possibilmente trasportando le vescicole di membrana, actina e/o molecole regolatrici actina lungo microtubuli astrali. Modellazione suggerisce quel solco dipende dalla ingressione durante cellularization: (1) un pad-KLP-dipendente della forza guida una lenta fase iniziale di ingresso; e (2) il trasporto successivo Pav-KLP-guidato delle vescicole contenenti actina e a membrana per il solco durante una veloce fase di ingresso. Ipotizziamo che Pav-KLP è un motore mitotico multifunzionale che contribuisce a impacchettare dei microtubuli interpolar, stabilizzando così il mandrino e di un meccanismo bifasico di ingressione solco tirando giù il solco e trasporto di vescicole che trasportano materiale nuovo per il solco decrescente.
Accoppiamento Tra Microtubule Scorrevole, Plus-fine Crescita E Rivelato Da Deplezione Chinesina-8 Lunghezza Del Mandrino
Controllo lunghezza mitotico richiede coordinamento tra dinamica dei microtubuli (MT) e le forze generate dal motore. Per indagare come polimerizzazione plus-fine MT contribuisce per lunghezza negli embrioni della drosofila del mandrino, abbiamo studiato le dinamiche della MT plus-fine depolymerase, chinesina-8 e gli effetti di inibizione chinesina-8 mediante Microiniezione anticorpale e mutanti. Come previsto, chinesina-8 è stato trovato per contribuire a anafase A. Inoltre, ha causato deplezione chinesina-8: (i) eccessiva polimerizzazione di MT interpolar (ip) più fini, che "invadere" penetrare mandrini metà distali; (ii) un aumento l'ipMT implicando scorrevole tasso che è accoppiato alla polimerizzazione plus-fine MT; (iii) allungamento mandrino prematura durante la metafase/anafase A; e allungamento (iv) un aumento nel mandrino anafase B tasso che correla linearmente con la velocità di scorrimento MT. Questo è meglio spiegato da una rivista modello "ipMT depolimerizzazione scorrevole/minus-end" per lunghezza mandrino controllo che incorpora un accoppiamento tra dinamiche ipMT più fine e gli interessi verso l'esterno scorrevole che spinge implicando l'elongazione disossidante e mandrino.
Dinamiche Mandrino Anafase B Nelle Cellule Di Drosophila S2: Confronto Con Embrione Mandrini
Nella fase di Drosophila melanogaster blastoderma sinciziale anafase embrione B viene avviato tramite un interruttore del ciclo cellulare in cui la soppressione del microtubule meno fine depolimerizzazione e riorganizzazione territoriale delle estremità più esteriormente scorrevole interpolar microtubuli innesca allungamento mandrino. RNA interference in drosofila S2 in coltura le cellule possono presentare uno strumento utile per l'identificazione di nuovi componenti di questo interruttore, ma data la diversità del design mandrino, è importante determinare il limite di conservazione del meccanismo dell'anafase B nei due sistemi.
Dinamica Corticale Actomiosina-dipendente Contribuisce Alla Profase Forza-equilibrio Nell'embrione Precoce Della Drosofila
L'assemblaggio del fuso mitotico embrione della drosofila durante la profase dipende da un equilibrio delle forze verso l'esterno generate da corticale dineina e verso l'interno forze generate dall'elasticità chinesina-14 e nucleare. Miosina II è conosciuta per contribuire alle dinamiche della corteccia delle cellule, ma non è chiaro come questo influenzi la profase forza-equilibrio.
Trasporto Dell'omologo Batte Isotipi Di Tubulina a Segmenti Medio E Distale Sensoriali Cilio
Ciglia sensoriali è assemblati e mantenuto da trasporto dell'omologo chinesina-2-dipendente (IFT). Abbiamo studiato se due Caenorhabditis elegans α - e β-tubulina isotipi, identificati attraverso mutanti che la mancanza dei segmenti distali cilio, vengono consegnati ai loro siti di assemblaggio da IFT. Mutazioni in residui conservati entrambi tubulins destabilizzano microtubuli singoletto distale. Un isotipo, TBB-4, assembla in microtubuli alle punte del nucleo assonema e segmenti distali, dove il tracker di punta del microtubule EB1 è trovato e si localizza lungo le ciglia, mentre l'altra, TBA-5, concentra in Camiciole distale. IFT assays, recupero di fluorescenza dopo photobleaching analisi e modellizzazione indicano che il continuo trasporto di sub-stoichiometric numeri di queste subunità di tubulina della macchina IFT può mantenere ciglia sensoriali a loro lunghezza steady-state.
Motori Mitotici E Segregazione Del Cromosoma: Il Meccanismo Dell'anafase B
Allungamento mandrino anafase B svolge un ruolo importante nella segregazione del cromosoma. Nel presente documento, discutiamo il nostro modello per anafase B negli embrioni della drosofila sinciziale, nel quale mandrino allungamento dipende da un ip (interpolar) MT (microtubuli) facendo scorrere il meccanismo del filamento generato da homotetrameric chinesina-5 motori che agiscono di concerto con mitigazione ipMT disossidante, che agisce come un interruttore on/off. In particolare, il mandrino pre-anaphase B è mantenuto a una lunghezza di steady-state dal bilanciamento tra interessi scorrevole e depolimerizzazione ipMT presso poli mandrino, producendo il flusso perturbato. Degradazione B cyclin a trigger insorgenza anafase B: gradiente di catastrofe (i) un MT causando ipMT più finisce per invadere la zona di sovrapposizione dove vengono generate forze scorrevole ipMT; e (ii) l'inibizione della depolimerizzazione di meno-fine ipMT così flux è spento '', l'equilibrio di forze per consentire esternamente ipMT scorrevole per spingere oltre i poli del mandrino di ribaltamento. Commentiamo brevemente il rapporto di questo modello di anafase B in altri sistemi.
