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Articles by Ingrid Brust-Mascher in JoVE
JoVE General
Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial
Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, Davis
Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en el
Other articles by Ingrid Brust-Mascher on PubMed
Microtúbulos Flujo Y Deslizamiento En Husos Mitóticos De Embriones De Drosophila
Hemos propuesto que la morfogénesis husillo en embriones de Drosophila implica progresión a través de cuatro estructuras transitorias isométricas en las que se mantiene un espaciamiento constante de los polos del huso por un equilibrio de fuerzas generadas por los microtúbulos múltiple (MT) y los motores que inclinar este equilibrio conduce polo-polo separación. Aquí se utilizó la microscopía fluorescente de speckle para evaluar la influencia de la dinámica de MT en el estado isométrica que persiste a través de la metafase y anafase A y en la separación de polo-polo en la anafase B. Durante la metafase y anafase A punctae, fluorescente y el cinetocoro interpolar el flujo hacia el MT polos en 0,03 micras / s, demasiado lento para conducir cromátidas a polo movimiento a 0,11 micras / s, y durante la anafase B, punctae fluorescente en interpolar MTs alejarse del ecuador del huso en la misma proporción que los polos, de acuerdo con MT MT-deslizamiento. La pérdida de ENT, un motor de flujo candidato o freno, no afectó flujo en el metafase / anafase Un estado isométrica o MT deslizante en anafase B pero disminuyó la duración del estado isométrica. Nuestros resultados sugieren que, a lo largo de este estado isométrica, una fuerza externa ejercida sobre los polos del huso por MT motores deslizamiento está equilibrado por el flujo, y que la supresión de flujo podría inclinar el equilibrio de fuerzas en el inicio de la anafase B, permitiendo MT deslizamiento y polimerización para impulsar los polos opuestos.
División Celular
En la creación del huso mitótico y el anillo contráctil, la selección natural ha diseñado máquinas fascinantes de precisión, cuyos movimientos dependen de las fuerzas generadas por conjuntos de proteínas del citoesqueleto. Estas máquinas segregar cromosomas y dividir la celda con alta fidelidad. La investigación actual sobre los mecanismos y la regulación de la morfogénesis del husillo, la motilidad cromosomas y la citocinesis hace hincapié en cómo los conjuntos dinámicos de polímeros del citoesqueleto y motores múltiples cooperar para generar las fuerzas que guían a la célula a través de la mitosis y la citocinesis.
El Chromokinesin, KLP3A, Mitótica Inmersiones Separación Del Eje Polo Durante La Prometafase Y Anafase Y Facilita La Motilidad Cromatídica
La mitosis requiere que las actividades concertadas de los microtúbulos múltiple (MT) a base de proteínas motoras. Aquí se analizó la contribución de la chromokinesin, KLP3A, a la morfogénesis huso mitótico y los movimientos de los cromosomas en los embriones de Drosophila y células cultivadas S2. Por inmunofluorescencia, se asocia con KLP3A punctae fibrosa que se concentran en los núcleos y mostrar MT-dependientes de las asociaciones con husillos. Estos se concentran en los dominios punctae indistintas asociados con los cromosomas y los ejes centrales y las bandas de forma distinta asociados con midbodies telofase. La alteración funcional de KLP3A por los anticuerpos o proteínas dominantes negativas en los embriones, o de ARN de interferencia (RNAi) en células S2, no bloquea la mitosis, pero produce defectos en los husos mitóticos. Time-lapse observaciones confocal de la mitosis en embriones vivos revelan que la inhibición KLP3A altera la organización de interpolar (ip), MTS y produce ejes corta. El análisis cinético sugiere que KLP3A contribuye a la separación del cabezal polo durante la transición prometafase a metafase (cuando se antagoniza NCD) y B anafase, a tasas normales de la motilidad cromátida durante anafase A, y para la separación adecuada de los núcleos durante la telofase hija. Proponemos que los actos KLP3A en MTs asociados con los brazos cromosómicos y el eje central para organizar paquetes IPMT, para impulsar la separación del eje poste y para facilitar la movilidad de cromátidas.
Dos Motores De Transporte Anterógrado Intraflagellar Cooperar Para Construir Cilios Sensoriales En El C. Elegans Neuronas
Los cilios tienen diversos roles en la motilidad y la recepción sensorial y su disfunción contribuye a las enfermedades relacionadas con cilios. Montaje y mantenimiento de los cilios depende de la intraflagellar transporte (IFT) de axonema, la membrana, las proteínas de la matriz y de señalización a destinatarios apropiados dentro de los orgánulos. En el modelo actual, estas proteínas se unen a la carga diversos sitios múltiples en las partículas IFT macromoleculares, los cuales son movidos por un solo motor anterógrada IFT, kinesin-II, a partir de la base ciliar a su extremo distal, donde la carga-descarga se produce. A continuación, describimos la observación de los fluorescentes y las partículas de los motores IFT IFT en movimiento a lo largo de distintos dominios dentro de los cilios sensoriales del Caenorhabditis elegans tipo silvestre y mutante IFT-motor-. Demostramos que dos holoenzimas anterógrada motor IFT, kinesin-II y la OSM-3 quinesina, cooperan de una manera sorprendente para el control de dos vías de IFT que construyen distintas partes de los cilios. En lugar de cada motor se mueven independientemente de su carga específica propia a un destino distinto, los dos motores funcionan de forma redundante para transportar partículas a lo largo de los microtúbulos TIF doblete adyacentes a la zona de transición para formar el segmento medio axonema. A continuación, OSM-3-quinesina solo transporta partículas IFT lo largo de los microtúbulos singlete distales para estabilizar el segmento distal. Así, la actividad de coordenadas sutil de estos motores IFT crea dos vías de transporte secuenciales.
Dinámica De Huso Mitótico En Drosophila
La mitosis, el proceso por el cual los cromosomas replicados se separan igualmente en células hijas, se ha estudiado por más de un siglo. Drosophila melanogaster es un organismo ideal para esta investigación. Embriones de Drosophila se adaptan bien a la mitosis de imagen, debido a que durante los ciclos de 10-13 núcleos se dividen rápidamente en la superficie del embrión, pero las células mitóticas durante estadios larvales y espermatocitos también se utilizan para el estudio de la mitosis. Drosophila se puede mantener fácilmente, muchas poblaciones de mutantes existen, y las moscas transgénicas que expresan mutado o fluorescente proteínas marcadas se pueden hacer. Además, el genoma se ha completado y la interferencia de ARN se puede utilizar en células de Drosophila cultivo de tejidos. En este artículo examinamos nuestra comprensión actual de la dinámica del huso, mirando a los experimentos y los modelos cuantitativos en los que se basa. Muchos jugadores moleculares en el huso mitótico Drosophila son similares a los de los mamíferos husillos, por lo que los resultados en Drosophila se puede extender a otros organismos.
Análisis Cuantitativo De Un Interruptor Anafase B: Predicción De Papel Para Un Gradiente De Catástrofe Microtúbulos
Anafase B en embriones de Drosophila se inicia mediante la inhibición de microtúbulos (MT) despolimerización en los polos del huso, que permite deslizar hacia afuera interpolar (ip) MTs para conducir polo-polo separación. Uso de la recuperación después de fluorescencia photobleaching, se observó que las MTs en todo el eje B preanaphase son muy dinámicos y la recuperación de la pantalla completa de la fluorescencia, pero durante la anafase B, próxima a los polos MTs estabilizar y por lo tanto, presentan una menor recuperación que los de otros países. La microscopia de fluorescencia de la punta de MT de seguimiento EB1 reveló que cada vez más extremos MT localizar a través del husillo B preanaphase sino que se concentran en la región de superposición de interpolar MTS (ipMTs) en la anafase B de aparición. Ninguno de estos cambios se produjeron en la presencia de ciclina no degradable Modelado B. sugiere que dependen de la creación de un gradiente espacial de las frecuencias MT catástrofe, más extremo, disminuyendo hacia el ecuador. La redistribución resultante de PAGOINT más extremos de la zona de solapamiento, junto con la supresión de menos de fin de despolimerización en los polos, podría constituir un interruptor mecánico que inicia alargamiento del husillo.
Particionamiento Dinámico De Mitótica Kinesin-5 Reticuladores Entre Estados Microtúbulos Y Con Plazos De Difusión Libremente
El comportamiento dinámico de homotetrameric kinesina-5 durante la mitosis es poco conocida. Kinesin-5 puede funcionar sólo mediante la unión, la reticulación, y deslizando los microtúbulos del huso adyacentes (MTS), o, alternativamente, puede unirse a una "matriz de husillo" estable para generar los movimientos de mitosis. Hemos creado transgénico Drosophila melanogaster expresar fluorescentes kinesina-5, KLP61F-GFP, en un fondo klp61f mutante, donde se rescata la mitosis y la viabilidad. KLP61F-GFP se localiza en paquetes de MT, los ejes interpolares la mitad, y áster, y se enriquece en torno a los polos del huso. En la recuperación después de fluorescencia photobleaching experimentos, KLP61F-GFP muestra la movilidad dinámica similar a la tubulina, que es incompatible con una nutrida estática de la quinesina-5. Los datos se ajustan a un modelo de reacción-difusión en los que está enlazado a más KLP61F husillo MT, con el resto de difusión libremente. KLP61F parece obligar transitoriamente MTs, moviéndose a lo largo de distancias cortas antes de la separación. Así, kinesin-5 motores pueden funcionar por reticulación y deslizante adyacente husillo MTs sin la necesidad de una matriz de husillo estática.
Kinesin-5-dependiente Hacia El Polo De Flujo Y De Control Del Eje De Longitud En La Mitosis Embrión De Drosophila
Se utilizó la microinyección de anticuerpos y la manipulación genética para diseccionar las distintas funciones de la homotetrameric kinesina-5, KLP61F, en el astral, centrosoma controlado embrión de Drosophila husillos y para poner a prueba la hipótesis de que se desliza además interpolar (ip) microtúbulos (MT), controlando de esta manera hacia el polo flujo y la longitud del husillo. En tipo salvaje y mutantes ncd embriones nulos, anti-KLP61F disociado el motor de husos, produciendo un gradiente espacial en el contenido de KLP61F diferente husillos, que era visible en KLP61F-GFP embriones transgénicos. Los defectos resultantes de mitosis, con el apoyo de los experimentos de dosis de genes y time-lapse microscopía de mutantes klp61f de vida, revelan que, después de la NEB, KLP61F impulsa la agrupación MT persistente y el deslizamiento hacia el exterior de antiparalela MTs, contribuyendo así a varios procesos que todos parecen insensibles a la cortical interrupción. KLP61F actividad contribuye al flujo hacia los polos de ambos ipMTs y MTs cinetocoro y la longitud del husillo metafase. La actividad KLP61F mantiene el eje prometafase por ncd antagonizar y otra fuerza desconocida-generador y las unidades de la anafase B, aunque la tasa de alargamiento del husillo es relativamente insensible a la concentración del motor. Por último, la actividad contribuye a KLP61F congression cromosoma normal, interlineado cinetocoro, y anafase A las tasas. Por lo tanto, un mecanismo impulsado por KLP61F deslizamiento de los filamentos contribuye a múltiples aspectos de la mitosis en este sistema.
Mantenimiento Prometafase Del Eje Por Un Equilibrio De Fuerzas Antagonistas Del Motor Dependiente De Hecho Robusto Por Un Desensamblado Lamin-B De Sobres
Hemos probado la hipótesis clásica de que la astral, prometafase bipolar husos mitóticos son mantenidos por las fuerzas equilibradas externas e internas ejercidas sobre los polos del huso por kinesin-5 y -14 utilizando modelos in vitro e in vivo de Drosophila melanogaster embriones. A lo largo de la prometafase, puntos lagrimales de los dos motores alineados en los microtúbulos interpolares (MTs [ipMTs]), y la perturbación del motor cambia la longitud del eje, como se predijo. Competitiva de la motilidad purificada kinesina-5 y -14 fue bien descrito por un modelo estocástico, oponiéndose a la incorporación de la carrera de modelo de la cinética del motor y la separación depende de la carga. Los parámetros del motor de este modelo se aplica a una nueva estocástico de equilibrio de fuerzas de modelo para prometafase ejes, proporcionando un buen ajuste a los datos procedentes de embriones. Mantenimiento de los ejes virtuales requiere ipMTs dinámicas y una gama estrecha de kinesin-5 a kinesin-14 relaciones de coincidencia que encuentran en los embriones. Perturbación funcional y modelado sugieren que este rango puede ser ampliado de manera significativa por un desmontaje de lamina-B sobre que rodea el eje prometafase y aumenta la afinada, el balance de la fuerza antagónica kinesina para mantener sólida husos prometafase como MTS montar y los cromosomas son empujados hacia el ecuador.
Kinesin-6 Mitótico, Pav-KLP, Media Dinámica Cortical Interdependiente De La Reorganización Y Huso En Embriones De Drosophila
Investigamos el papel de Pav-KLP, kinesin-6, en la coordinación de la dinámica cortical y del huso durante la mitosis en embriones de Drosophila. Pav-KLP in vitro, se comporta como un dímero. In vivo, localiza a surcos y husos mitóticos. Inhibición de Pav-KLP causa defectos en tanto dinámica del huso y un surco, como provocando cambios en la distribución de actina y vesículas. Así, Pav-KLP estabiliza el eje por los paquetes de microtúbulos intrapolar reticulación y contribuye a la formación del surco de actina posiblemente mediante el transporte de vesículas de membrana, actina y/o moléculas reguladoras de la actina a lo largo de los microtúbulos astrales. Modelado sugiere eso surco ingresión durante cellularization depende de: (1) Pav-KLP-dependiente de la fuerza conduce a una primera fase lenta de agresión; y (2) el transporte posterior de Pav-KLP-conducido de vesículas que contienen actina y membrana al surco durante una etapa rápida de agresión. Presumimos que la APV-KLP es un motor mitótico multifuncional que contribuye tanto a un mecanismo bifásico de ingresión surco a liarse de microtúbulos interpolar, estabilizando así el husillo, tirando abajo el surco y transporte de vesículas que ofrecen nuevo material al surco descendente.
El Acoplamiento Entre Los Microtúbulos Deslizante, Plus De Fin De Crecimiento Y Longitud Del Eje Revelado Por Kinesin-8 Agotamiento
Huso mitótico control de longitud requiere coordinación entre los microtúbulos (MT), la dinámica y las fuerzas generadas por el motor. Para investigar cómo MT plus de fin de polimerización contribuye a la longitud del eje en los embriones de Drosophila, se estudió la dinámica de la MT plus de fin de despolimerasa, kinesin-8, y los efectos de la inhibición de la kinesina-8 con los mutantes y microinyección de anticuerpos. Como se esperaba, quinesina-8 se encontró que contribuyen a anafase A. Además, quinesina-8 agotamiento causado: (i) polimerización excesiva de interpolar (ip) MT más extremos, que "sobrecrecimiento" para penetrar distal medio husos, (ii) un aumento de la tasa de deslizamiento hacia el polo PAGOINT que está acoplado a MT más extremo de polimerización, (iii) prematura alargamiento del husillo durante metafase / anafase A, y (iv) un aumento en la tasa anafase B alargamiento del husillo que se correlaciona linealmente con la velocidad de deslizamiento MT . Esto se explica mejor por una versión revisada del "PAGOINT deslizante / menos de fin de despolimerización" modelo para el control del cabezal de longitud que incorpora un acoplamiento entre PAGOINT más dinámica de los extremos y hacia afuera del IPMT deslizante que conduce el flujo hacia el polo y el alargamiento del husillo.
Anafase B Dinámica Del Huso En Las Células S2 De Drosophila: Comparación Con Embriones Husillos
En la Drosophila melanogaster sincitial blastodermo etapa embrión B anafase se inicia por un interruptor de ciclo celular en el que la supresión de la despolimerización de microtúbulos menos extremo y reorganización espacial de la más extremos de deslizamiento hacia fuera microtúbulos interpolares disparadores alargamiento del husillo. Interferencia de ARN en Drosophila S2 células cultivadas pueden presentar una herramienta útil para la identificación de nuevos componentes de este interruptor, pero debido a la diversidad de diseño del cabezal, es importante para determinar primero el grado de conservación del mecanismo de anafase B en los dos sistemas.
Transporte Intraflagellar Ofrece Isotipos De Tubulina Medio Cilio Sensorial Y Los Segmentos Distales
Cilios sensoriales están montados y mantenidos por kinesin-2-dependiente de intraflagellar transporte (IFT). Hemos investigado si los dos Caenorhabditis elegans alfa-tubulina y β-isotipos, identificados a través de los mutantes que carecen de los segmentos distales cilio, se entregan a sus lugares de concentración de IFT. Las mutaciones en los residuos conservados en ambas tubulinas desestabilizar a los microtúbulos distales singlete. Un isotipo, TBB-4, se constituye en los microtúbulos en las puntas del núcleo axonema y segmentos distales, donde la punta de seguimiento de los microtúbulos EB1 se encuentra, y se localiza a lo largo del cilio, mientras que el otro, TBA-5, se concentra en singletes distales. Ensayos TIF, la recuperación después de fluorescencia photobleaching análisis y la modelización indican que el transporte continuo de la sub-estequiométricas número de estas subunidades de tubulina por la maquinaria IFT puede mantener cilios sensoriales en su estado estacionario longitud.
Motores Mitóticas Y La Segregación De Cromosomas: El Mecanismo De La Anafase B
Anafase alargamiento del husillo B juega un papel importante en la segregación cromosómica. En el presente trabajo, se discute el modelo de la anafase B en embriones de Drosophila sincicial, en la que el alargamiento del husillo depende de una dirección IP (interpolar) MT (microtúbulos) mecanismo de deslizamiento de filamentos generado por homotetrameric kinesin-5 motores que actúan en concierto con los polos PAGOINT flujo, que actúa como un 'on / off "del interruptor. Específicamente, el cabezal de pre-anafase B se mantiene a una longitud en estado estacionario por el equilibrio entre PAGOINT deslizamiento y despolimerización IPMT en los polos del huso, produciendo hacia los polos flujo. Ciclina degradación B en anafase B de aparición disparadores: (i) un gradiente de catástrofe MT causando PAGOINT más extremos de invadir la zona de solapamiento donde IPMT fuerzas de deslizamiento se generan, y (ii) la inhibición de PAGOINT menos tan extremo despolimerización flujo se "apaga ', inclinando la balanza de las fuerzas hacia el exterior para permitir PAGOINT deslizante para impulsar además los polos del huso. Se comenta brevemente la relación de este modelo a anafase B en otros sistemas.
Actomyosin-dependiente De La Dinámica Cortical Contribuye Al Profase Equilibrio De Fuerza En El Embrión De Drosophila
La Asamblea del huso mitótico del embrión de Drosophila durante la profase depende de un equilibrio de fuerzas externas generadas por dineína cortical y hacia fuerzas generadas por la elasticidad kinesin-14 y nuclear. Miosina II es conocido por contribuir a la dinámica de la corteza de la célula pero no está claro cómo esto influye en el profase fuerza-equilibrio.
