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Articles by Irina V. Getun in JoVE
JoVE General
Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique
1Genome Plasticity Laboratory, Department of Cancer Biology, The Scripps Research Institute, 2Flow Cytometry Core, The Scripps Research Institute
Une méthode efficace pour obtenir des fractions hautement purifiées viables méiotiques de la souris testicule est décrit, qui combine un cadre raffiné dissociation cellulaire protocole avec le tri de cellules fluorescentes (FACS). Cette méthode tire parti des différences dans le contenu en ADN et de la densité nucléaire de fractions distinctes méiotique.
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Conformations De Natif Sont échantillonnées Par Variantes Partiellement Repliées Et Désordonnées De L'inhibiteur De Trypsine Pancréatique Bovine
Partiellement repliées ensembles conformationnelles d'inhibiteur de trypsine pancréatique bovine (TPBE) sont accessibles en remplaçant Cys 5, 30, 51 et 55 de l'acide alpha-amino-n-butyrique (Abu) tout en conservant le disulfure entre Cys 14 et 38 ; la variante qui en résulte est appelée [14-38](Abu). Deux nouveaux analogues avec des modifications à la bêta-tour, P26D27[14-38](Abu) et N26G27K28[14-38](Abu), sont comparés aux partiellement repliée [14-38](Abu), aussi bien quant à [R](Abu), la protéine dépliée avec tous les six résidus Cys remplacé par Ahmed. Caractéristiques structurelles des nouveaux analogues de [14-38](Abu) ont été déterminées par dichroïsme circulaire (CD), RMN unidimensionnelle du (1), et les expériences de fluorescence de l'acide 8-anilino-1-sulfonique (SNA). Les deux analogues sont plus désordonnés que le parent [14-38](Abu), mais P26D27[14-38](Abu) a une petite population de type natif conformations observées par RMN, aucune structure ordonnée n'est détecté pour N26G27K28[14-38](Abu). Tests d'inhibition de la trypsine ont été réalisées à l'aide d'une trypsine rat modifié, C191A/C220A, ce qui minimise le clivage des peptides non pliés. [14-38](Abu) et P26D27[14-38](Abu) inhibent significativement modifiée par la trypsine. N26G27K28[14-38](Abu) a bas mais l'activité inhibitrice mesurables, alors que [R](Abu) n'exerce aucune activité même en excès molaire très élevé par rapport à la trypsine. Fluorescence et est renforcée par [14-38](Abu) et par les deux variantes, mais pas par [R](Abu). Nous concluons que partiellement repliées ensembles de TPBE, même ceux qui ont peu ou pas de structure CD - ou NMR détectables, contiennent des populations mineures des conformations de type natif. Partiellement repliée [14-38](Abu) et les deux variantes, comme [R](Abu), ont amélioré l'ellipticité négative dans les spectres de DC acquis en présence de l'osmolyte triméthylamine N-oxyde (TMAO). Structure induite par TMAO est formé en collaboration, telle qu'indiquée par les courbes de dépliement thermiques. L'activité inhibitrice en fonction de la concentration de TMAO implique que la structure induite par osmolyte est natif pour [14-38](Abu) et P26D27[14-38](Abu) et est probablement originaire-like pour N26G27K28[14-38](Abu). [R](Abu) montre également une augmentation structure CD-détecté en présence de TMAO, mais cette structure est susceptible d'être réduit et les non-autochtones.
Analogues D'inhibiteurs De La Trypsine Pancréatique Bovine Partiellement Plié Atteignent Entièrement Natif Structures Quand Co-crystallized Avec De La Trypsine Du Rat S195A
Structures cristallines, à 1,7 résolution, ont été résolus pour complexes entre chacune des deux analogues partiellement pliés par synthèse chimique d'inhibiteur de trypsine pancréatique bovine (BPTI) avec le mutant de la trypsine de clivage protéolytique inactif rat S195A. L'analogue de TPBE appelé [14-38](Abu) conserve uniquement la liaison disulfure entre Cys14 et Cys38, tandis que Cys5, Cys30, Cys51, et Cys55 sont remplacés par les résidus d'acide alpha-amino-n-butyrique isostères. L'analogue K26P,A27D[14-38](Abu) contient deux autre remplacement, par des résidus statistiquement favorisés, dans le type j'ai beta-tour qui a été suggéré d'être un site principal pour l'initiation du BPTI pliage. Comme un contrôle, la structure du complexe entre S195A la trypsine et sauvage BPTI a également résolue. Malgré les différences significatives dans le degré de structure détectée parmi ces trois BPTIs en solution par plusieurs techniques biophysiques, leurs plis tertiaires une fois liés à S195A la trypsine dans un réseau cristallin sont essentiellement superposables.
Anatomie Des Taches De Recombinaison De Souris Hot
L'échelle du génome analyses ont suggéré des milliers de points chauds de recombinaison méiotique à travers génomes de mammifères. Cependant, très peu de points chauds ont été analysés directement à une échelle sous-ko pour crossover (CO) d'activité. Utilisation de souches recombinantes consanguines comme une bibliothèque de CO, ici nous rapportons l'identification et la caractérisation détaillée de sept nouveaux points chauds méiotiques sur 19 chromosomes de la souris, a plus que doublé le nombre de places de souris actuellement disponibles chaudes. Même si une caractéristique commune est l'étroite 1.5 à 2.5 kb largeur de ces sites recombinogéniques, ces analyses ont révélé que les points chauds ont des attributs divers et séquences symétriques distinctes et les profils de CO asymétriques. Il est intéressant, avec de vastes molécules de CO conversion discontinus sont couramment observées, contrastant avec celles trouvées chez l'homme. En outre, contrairement à l'homme les points chauds, ceux qui sont présents chez la souris n'ont pas nécessairement une distribution de CO quasi-normale, mais les zones portuaires de CO dans les carottes de répulsion recombinogéniques. Nous proposons un modèle où le paysage chromatine locale dirige ces zones de répulsion.
Paysage D'occupation Des Nucléosomes Et Dynamique Au Points Chauds De Recombinaison De Souris
Au cours de la méiose, paternelle et maternelle homologue recombinent chromosomes sur les sites de recombinaison spécifique nommée hotspots. Ce qui rend 2% des génomes de mammifères permissives à la recombinaison méiotique en permettant Spo11 endonucléase de lancer des cassures double brin est largement inconnue. Travail dans la levure a montré que l'accessibilité chromatine semble être important pour cette activité. Ici, nous définissons les profils des nucléosomes et de la dynamique à quatre points chauds de recombinaison de la souris en purifiant fractions hautement enrichies de cellules méiotiques. Nous avons trouvé que l'occupation nucléosome est généralement stable pendant la progression de la méiose. Fait intéressant, les noyaux de points chauds de recombinaison ont largement ouvert structure de la chromatine, et la localisation des nucléosomes peu présents dans ces noyaux est corrélée précisément avec les zones de croisement-libres dans les domaines recombinogéniques. Collectivement, ces études à haute résolution indiquent que l'occupation nucléosome semble diriger, au moins en partie, comment les événements de recombinaison méiotique sont traitées.
