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Articles by Jackson C. Kirkman-Brown in JoVE

 JoVE General

イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング


JoVE 1996 6/16/2010

1School of Biosciences, University of Birmingham, 2School of Medicine, University of Birmingham, 3Centre for Human Reproductive Science, Birmingham Women’s Hospital

刺激誘発の[Ca

Other articles by Jackson C. Kirkman-Brown on PubMed

透明帯とプロゲステロン誘発性Ca2 +シグナル伝達とヒト精子の先体反応

どのように精子を誘致します。

ヒト精子細胞内[Ca2 +の]([Ca2 +の] I)によってプロゲステロン刺激強度のエンコーディング

プロゲステロンは二相性のCa(2 +)流入と人間の精子の結果先体反応を誘導する。我々は、細胞によって刺激の強さのエンコーディングを調べるために(投与量およびそれ以前の受容体脱感作)刺激を変化させるために2つの手順を使用しているの[Ca(2 +)]([Ca(2 +)の(I))。一過性の先体反応と振幅(ただし動力学)の[Ca(2 +)](i)の応答(人口測定)の範囲でシグモイド用量の感度を示し、0.3 NM-3マイクロモル、約300nmで飽和(ED(50)約30 nM)を。持続的な応答の振幅は3マイクロモルで飽和。単一細胞イメージングは​​、一時的と持続的の両方の[Ca(2 +)](i)の応答の振幅が非常に用量依存性であることが、発生と動態のその頻度は、主に用量に依存したこと。示された蛍光測定は、確認したプロゲステロン誘発性の[Ca(2 +)](i)の流入は、3マイクロモルのプロゲステロンが無効であることの二番目以降のアプリケーションでは、脱感作の対象となった。しかし、3 nMで、30 nMの3マイクロモルのプロゲステロンの順次追加は発生する過渡の[Ca(2 +)](i)の応答を各濃度に対する応答の振幅と持続時間3マイクロモルのプロゲステロンは、非前処理細胞と比較して減少して。単一細胞イメージングは​​、前処理が応答した細胞の割合に影響を及ぼさなかったことを明らかにしたが、同様に人口の応答に単一セルの応答は、[Caの遅いコンポーネントの脱感作の効果と一致して小さかったと著しく持続時間が減少(2 +)](i)の一時的な。私たちは、投薬量又は脱感作によって変化プロゲステロンの刺激の強さは、アナログの[Ca(2 +)](i)の信号によりエンコードされている。結論先体反応の用量依存性は、したがってませプロゲステロン応答細胞の数ではなく、 '定数'の応答の人口のエキソサイトーシスの確率の変化によって決定されます。

ヒト精子の遅いカルシウム振動

我々は細胞内Ca2 +プロゲステロン(3マイクロモル)で刺激したヒト精子のシグナリングを調査するために、単一細胞イメージングを使用しています。約である。細胞のプロゲステロンの9%は、記録時間(20-30分)持続した1から4分の周期で、ゆっくりと反復的な[Ca2 +の] I(細胞内Ca2 +濃度)の振動の活性化を引き起こした。精子細胞にT-およびL-型電位作動性Ca2 +チャネルをブロックしますニフェジピンとの前処理は、振動の特性を変更するが、彼らが観察された細胞の割合が減少していませんでした。ベイK 8644またはFPL64176による刺激による[Ca2 +の] I細胞の5-10%の振動が、その周波数(周期4-5分)で低かった。 E(K)(カリウム平衡電位)で膜電位をクランプするバリノマイシンの応用(1マイクロモル)は、細胞膜電位と電圧駆動のコンダクタンスの活性化により、機構に関与していないことを示す、細胞を振動での活動を変更しなかった精子[Ca2 +の] iの振動が生成されます。

プロゲステロンによって誘発される先体反応および個々の人間の精子のカルシウム応答の細胞内との関係の動態

3マイクロモルでプロゲステロンは細胞内カルシウムの相性(一時的かつ持続的な)増加(の[Ca(2 +)](i))はプロゲステロンによって誘発される先体反応(AR)のための前提条件であると考えられているヒトの精子、でトリガされます。ほとんどは、ARの発生、遅延、および補完の特性にどのように関連するかについては知られているように、プロゲステロン誘発性の[Ca(2 +)](i)の信号を、我々は個々の生きている人間の精子の蛍光顕微鏡を用いてこれらのイベントを検討した。カルシウムイメージング動態やの[Ca(2 +)](i)のその振幅を示している先体反応のとアクロソーム-無傷の細胞、内の先行プロゲステロン誘発性カルシウム応答の振幅に差は認められなかった後、先体状態の直接評価信号がARの重要な決定要因ではありません。プロゲステロンの刺激後に時間を変化させることでARを逮捕するために細胞外カルシウムのキレート化が最大のARは初期の一時的なカルシウム流入中ではなく持続的なカルシウム応答時に、すぐに次のプロゲステロンの刺激が発生したことを明らかにした。酸性オルガネラプローブLysoTracker DND-99とdapoxyl(2 - アミノエチル)スルホンアミド(DAE)をで染色することにより、リアルタイムで先体分散に従うことをしようとすると、原因で細胞集団の不均一なラベリングに決定的証明した。驚くべきことに、染料は、多くの場合、先体に閉じ込められますが、ヒトの精子細胞の唯一の集団が十分に酸性のアクロソームが含まれていることを示唆している全体の精子の頭部を、染色していませんでした。

人間の精子の非ゲノムのステロイド アクション。「永続くすぐりビンラディンの環境から」。

精子女性管から膣卵母細胞を走査しながら、彼らは転写不活動による彼らだけ非ゲノム シグナル伝達を介して応答できますステロイド環境、経験します。この環境は受精能獲得を含むイベントを仲介する、運動パターン、走化性、および先体反応に変更されます。イベント、カルシウム シグナル伝達経路や受容体関与の潜在的なアイデンティティの現在のナレッジは、最近のデータ フィールド、および混合の刺激剤としてステロイドの重要性を強調、さらに仕事のコンテキストに照らして審査されます。プロゲステロン受容体の候補者は、プロゲステロン膜受容体コンポーネント-1 または-2 serpine 1 mRNA 結合タンパク質, これまでのところひと精子でプロゲステロンの活動に最適な候補と複雑なような受容器の新規クラスを含む最近の知見に照らしてと見なされます。他の代替候補の数と活性化シグナル伝達経路の見かけの多様性を考えるは複数種のプロゲステロン受容体の存在除外されません。これらの経路のイベント現在限られた知識の進歩は、精子機能不全不妊症の最も一般的な定義された原因であることを考えるより良い治療法を作成するだけでも合理的な診断を改善することが重要です。

精子数をカウントするとこれ以上アップ追加されません。新しい方程式の時間か?

精子の機能不全が不妊の最も一般的な原因ですが、我々は診断の貧しい人々のメソッドと驚くほど効果的な治療(生殖補助技術を除く)を持っています。このレビューでは、基本的な精液分析の有用性に挑戦し、新しいパラダイムが即座に必要とされると主張している。我々は潜在的に男性の診断を向上させるために、サブ肥沃なカップルの管理を合理化するために自宅でのスクリーニングの使用について説明します。さらに、我々は、精子機能の新たなバイオマーカーの開発を可能にするプロテオミクスでは、たとえば、フィールド内の最近の進展を概説しています。この新しい知識は、マシンとして精子の我々の理解を変革し、精子の機能不全を有する男性の非ART治療法につながる可能性があります。

精子の運動性: 粘度が進行する基礎的ですか?

内部の受精の成功は、成功した精子の移動女性の管に依存です。タイムリーな場所何で卵母細胞の複雑な三次元、非常に陥入の一連の湿った対向面のみの万精子がこれまでに成功チャレンジです。一部でこのスケールの違いのため 20 cm 以上も複雑なアーキテクチャのための考えられる移行に直面しては 50 μ m の長いセルを持つかもしれない。多くのグループ精子受精サイト数の増加に導く遊走 '魅力的な卵' 効果の役割に焦点を当てています。何を検討するほとんどの研究を無視している精子の選別と彼らの行動の継続的な変調では、全体の管コートし、精子泳いではを通じて、粘液の層の粘性を果たしている役割です。精子が子宮頸部を介してそれらアクション女性の避妊ピルの入り口を否定する、排卵のフェーズの間に入力することができますから粘性効果は管を通して移行する精子人口を制御する基本となります。粘性の生理的影響も設計および in vitro の実験からデータ in vivo での状況に外挿する際に考慮することが重要です。

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