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Articles by James M. Flynn in JoVE
JoVE General
Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto
1Buck Institute for Research on Aging, 2Department of Physiology & Biophysics, University of Washington
Perfiles de expresión de células individuales permite el análisis detallado de la expresión génica de células individuales. Se describen los métodos para el aislamiento de los cardiomiocitos, y la preparación de los lisados resultantes, ya sea para toda microarrays transcriptoma o qPCR de objetivos específicos.
Other articles by James M. Flynn on PubMed
17beta-estradiol Estimula MAPK Señalización Vía En Cultivos De Células Epiteliales De La Lente Humano Impidiendo Colapso Del Potencial Durante El Estrés Oxidativo Agudo De La Membrana Mitocondrial
17beta-estradiol (17beta-E2) protege contra H2O2 mediada por agotamiento de ATP intracelular y disminuye el grado de despolarización del potencial de membrana mitocondrial (DeltaPsi(m)) en cultos consecuentes a insulto oxidativo de las células epiteliales de la lente. Ahora divulgamos que eso 17beta-E2 actúa como un regulador positivo de la vía de transducción de la señal de supervivencia, MAPK que, a su vez, actúa para estabilizar DeltaPsi(m) en efecto, atenuando la magnitud de la despolarización de la membrana mitocondrial potencial frente a estrés oxidativo agudo. El SV-40 viral había transformado línea celular humana, HLE-B3 trataron con 17beta-E2 sobre un curso de tiempo de 60 minutos y fosforilación de ERK1/2 se analizó mediante Western blot. ERK1/2 se fosforila dentro de 5-15 minutos en presencia de 17beta-E2. Cultivos celulares fueron expuestos al inhibidor MEK1/2, UO126, con posterioridad a H2O2 + /-tratamiento de 17beta-E2 y el DeltaPsi(m) examinado usando JC-1, un tinte potenciométrico que sirve como un indicador del estado del potencial de membrana mitocondrial. UO126 tratamiento atenúa la fosforilación de ERK1/2 independientemente de si se administró estradiol. Despolarización de la membrana mitocondrial resultantes de H2O2 estrés fue sustancialmente mayor en presencia de UO126. Cuanto mayor sea el grado de despolarización, el tratamiento menos efectivo de 17beta-E2 fue en la comprobación de la despolarización de la membrana mitocondrial, lo que indica que el relativo grado de fosforilación de ERK influye en la estabilidad mitocondrial con insulto oxidativo. Los datos apoyan una correlación positiva entre la estimulación 17beta-E2 de fosforilación de ERK1/2 y estabilización mitocondrial que de lo contrario causaría un colapso completo de DeltaPsi(m).
Estradiol Atenúa Despolarización Mitocondrial En Células Epiteliales De La Lente De Poliol-tensionado
Este estudio examinó el estado de la fisiología mitocondrial con posterioridad a exponer el epitelio de la lente a la galactosa ambiente alta (Gal), que con la conversión a galactitol (GalOH) y la acumulación intracelular resultante, conduce a profunda desestabilización de potencial de membrana mitocondrial (Deltapsim). Además, se determinó si el inhibidor de aldosa reductasa (AR), Sorbinil o estrógeno (17beta-E2 y su isómero, 17alpha-E2, que exhibe marginal afinidad para los receptores de estrógeno), administrados antes y concomitante con Gal exposición pudiera impedir o retrasar la despolarización de la membrana mitocondrial.
Supresión De RNA De ERK2 Conduce Al Colapso Del Agudo Estrés Oxidativo En Las Células Epiteliales De La Lente Humano Potencial De Membrana Mitocondrial
17beta-Estradiol (E(2)) reduce la despolarización inducida por estrés oxidativo del potencial de membrana mitocondrial (MMP) en las células epiteliales de la lente humanas cultivadas (HLE-B3). El mecanismo por el cual los efectos nongenomic de e (2) contribuyeron a la protección contra la despolarización de la membrana mitocondrial fue investigado. Integridad de la membrana mitocondrial está regulada por la fosforilación del malo, y se sabe que la fosforilación de Ser(112) inactiva malo e impide su participación en la vía mitocondrial de la muerte. Se encontró que la e (2) aumentó rápidamente tanto la fosforilación de ERK2 y Ser(112) en BAD. Ser(112) es fosforilado por p90 ribosomal S6 quinasa (RSK), un Ser/Thr, que es un efector downstream de ERK1/2. Inhibición de la RSK por el inhibidor específico RSK SL0101 no redujo el nivel de E (2)-inducida por fosforilación de Ser(112). Silenciamiento malo utilizando ARN interferente pequeño no alteró despolarización de la membrana mitocondrial provocada por insulto peróxido. Sin embargo, en las mismas condiciones, silenciamiento ERK2 dramáticamente creciente despolarización de la membrana en comparación con el ARN interferente pequeño control. Por lo tanto, ERK2, funcionamiento a través de un mecanismo independiente del BAD regula MMP en células epiteliales de la lente de los seres humanos. Proponemos que la activación inducida por estrógeno ERK2 actos para proteger las células contra el estrés oxidativo agudo. Por otra parte, a pesar del hecho que ERK2 desempeña un papel regulador en el potencial de membrana mitocondrial, estrógeno encontraron para bloquear la despolarización de la membrana mitocondrial mediante un mecanismo de ERK-independiente.
Deterioro De La Capacidad Respiratoria De Repuesto En Sinaptosomas Corticales De Ratones Nulos SOD2
Terminales nerviosas presinápticas requieren altos niveles de ATP para el mantenimiento de la función sináptica. La falta de sináptica mitocondrias para generar suficiente ATP ha sido implicado como un evento causal que precede a la pérdida de las redes sinápticas en la enfermedad neurodegenerativa. El estrés oxidativo endógeno a menudo se ha postulado como una base etiológica de esta patología, pero ha sido difícil de probar in vivo. La inactivación del gen de la superóxido dismutasa (Sod2) que codifica la enzima principal defensa contra los radicales superóxido mitocondrial resulta en letalidad neonatal. Sin embargo, la intervención con un SOD mimética se extiende la vida útil de este modelo y descubre un fenotipo neurodegenerativo proporcionar un modelo único para el examen de estrés oxidativo en vivo. Presentamos aquí los estudios sobre terminales sinápticas aisladas de la corteza frontal de ratones nulos SOD2 que demuestran deterioro de la función bioenergética, como resultado del estrés oxidativo mitocondrial. Sinaptosomas corticales de ratones nulos SOD2 demuestran una disminución severa de la capacidad respiratoria mitocondrial de repuesto en respuesta a la demanda fisiológica inducida por la cadena respiratoria mitocondrial desacoplante FCCP con o por despolarización de la membrana plasmática inducido por 4-aminopiridina tratamiento. Sin embargo, SOD2 animales nulos compensar la alteración del metabolismo oxidativo en parte por el efecto Pasteur que permite la liberación de neurotransmisores en la sinapsis normales, la creación de un paradigma energético potencialmente perjudicial. Los resultados de este estudio demuestran que el alto rendimiento de respirometría es un método fácil para el análisis de regiones específicas del cerebro en modelos transgénicos y puede descubrir deficiencias bioenergéticos en regiones subcelulares, debido al estrés oxidativo endógeno.
El Estrés Oxidativo Mitocondrial Causada Por Deficiencia De Sod2 Promueve La Senescencia Celular Y Fenotipos Del Envejecimiento En La Piel
Detenciones celulares senescencia de la proliferación de células de mamíferos en riesgo de transformación neoplásica, y también se asocia con el envejecimiento. Sin embargo, los factores que causan la senescencia celular durante el envejecimiento no son claras. El exceso de especies reactivas del oxígeno (ROS) han demostrado que causa la senescencia celular en la cultura, y el daño acumulado molecular debido a mitocondrial de ROS ha sido pensado para impulsar el envejecimiento phenotypesin vivo. En este sentido, la hipótesis de que el estrés oxidativo mitocondrial puede promover la senescencia celular in vivo, y contribuyen al envejecimiento fenotipos in vivo, específicamente en la piel. Se demuestra que el número de células senescentes, así como deterioro mitocondrial (complejo II) aumento de la actividad en la piel del ratón, naturalmente, de edad avanzada. El uso de un modelo de ratón de la deficiencia genética de Sod2, nos muestran que el hecho de expresar esta importante mitocondrial enzima antioxidante también afecta la actividad mitocondrial complejo II, causa daño en el ADN nuclear, e induce la senescencia celular pero no la apoptosis en la epidermis. Sod2 deficiencia también se reduce el número de células y el espesor de la epidermis, al tiempo que aumenta la diferenciación terminal. Nuestros resultados apoyan la idea de que el estrés oxidativo mitocondrial y la senescencia celular contribuyen al envejecimiento de la piel fenotipos in vivo.
