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Articles by James N. Warnock in JoVE
JoVE Bioengineering
のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で研究
Department of Agricultural and Biological Engineering, Mississippi State University
生理学的および病理学的圧力の条件に心臓弁組織を施すことのできる周期的圧力のバイオリアクターを設計されています。 LabVIEWプログラムは、ユーザーが圧力の大きさ、振幅と周波数を制御することができます。このデバイスは、心臓弁の組織または単離された細胞のmechanobiologyを研究するために使用することができます。
Other articles by James N. Warnock on PubMed
ブタ大動脈弁尖の生物学的特性に関する定数静的圧力の影響
弁尖内でどのように機械的な力への影響細胞の理解が非常に組織工学心臓弁の開発を恩恵を受けるだろう。本研究では、心臓弁尖の生物学的特性に関する一定の周囲圧力の効果は、カスタム設計圧力システムを用いて評価した。ネイティブブタ大動脈弁尖は、静的な100の圧力、140、または48時間、170 mmHgにさらされた。コラーゲン合成、DNA合成、硫酸glycoaminoglycan（sGAG）の合成、α-SMCアクチンの発現と、細胞外マトリックス（ECM）の構造を調べた。結果は、上昇圧力はコラーゲン合成の増加を引き起こしたことを示した。この増加は、100mmHg以下で統計的に有意ではなかったが、140 mmHgと170 mmHgでのコラーゲン合成でそれぞれ、37.5および90％増加した。 DNAまたはsGAG合成に有意差は100 mmHgでのDNA合成が減少したことを除いて、高い圧力で観察されなかった。有意差は圧力とコントロール群間で観察されなかったものの、α-SMCアクチンの顕著な低下は、実験の過程で観察された。それは上昇圧力がブタの大動脈弁尖のコラーゲン合成に比例して増加を引き起こしたが、α-SMCアクチン陽性細胞を維持することができませんでしたと結論づけられた。
環状の圧力は大きさと周波数に依存した方法でブタ大動脈弁尖の生物学的特性に影響を与える
弁尖内でどのように機械的な力への影響細胞の理解が非常に組織工学心臓弁の開発を恩恵を受けるだろう。このグループによる以前の研究では、一定の静圧への曝露は、ブタの大動脈弁尖に強化されたコラーゲン合成につながることが示されている。本研究では、周期的な圧力の効果は、カスタム設計圧力システムを用いて評価した。異なった圧力の大きさ（100、140、170 mmHg）で同様にパルス周波数は、（0.5、1.167、2 Hz）を検討した。コラーゲン合成、細胞増殖、sGAG合成、α-SMCアクチンの発現と、細胞外マトリックス（ECM）構造は、弁膜症の生物学的応答のためのマーカーとして選ばれました。結果は、大動脈弁尖の大きさと周波数に依存する方法で周期的な圧力に対応したことを示した。 DNA合成は横ばいながら、圧力の大きさ（1.167 Hzに固定された周波数を持つ）の増加は、コラーゲンとsGAG合成の両方の有意な増加をもたらした。パルス周波数（100 mmHgの固定の大きさを持つ）への応答はもっと複雑だった。コラーゲンとsGAG合成は0.5 Hzでそれぞれ25と14％増加した、しかし1.167と2 Hzで影響を受けませんでした。対照的に、DNA合成は、2 Hzではなく、0.5と1.167 Hzで72パーセント増加しました。極端な圧力条件（170 mmHgで、2 Hzの）の下で、コラーゲンとsGAG合成は170 mmHgで、と1.167 Hzでより低い程度に増加していたが。細胞増殖には影響しませんでした。有意差は周期的な圧力とコントロール群間で観察されなかったものの、-SMCアクチンの著しい減少は、実験の経過を観察した。それは、環状圧力は大きさと周波数に依存する方法で大動脈弁尖の生合成活性に影響を与えたと結論された。コラーゲンとsGAG合成は正の相関とパルス周波数よりも圧力の大きさに柔軟に対応しました。 DNA合成は、圧力の大きさよりも周波数をパルスに応答性であった。しかし、組み合わせた場合、圧力の大きさとパルス周波数はお互いに減衰させる効果を持っているように見えた。 α-SMCアクチン陽性細胞の数にかかわらず、パルス周波数と圧力の大きさの、環状の圧力によって変化しませんでした。
Ex Vivoでの器官培養に関する研究：正常な生理的条件下では、ブタ大動脈心臓弁の生物学的特性を維持
力依存性の細胞や組織の応答につながる複雑な機械環境における大動脈弁機能します。これらの応答の特性は、弁の病態の基本的な理解を提供しています。この研究の目的は、生理的な圧力（80分の120 mmHg）で、心拍出量（4.2リットル/ min）を維持することができるのex vivo拍動性の器官培養系で培養し、ネイティブのブタ大動脈弁の生物学的特性を検討した。弁尖のコラーゲン、エラスチンsGAGと内容を測定し、カスプの形態、細胞表現型、細胞増殖とアポトーシスを調べた。リーフレット表面上の内皮細胞（ECS）の存在も評価されました。コラーゲン、sGAGとエラスチン含量の違いが培養された新鮮な弁尖の間に（P> 0.05）に有意差はなかった。形態および細胞表現型を維持しながら培養バルブはチラシのネイティブECM組成を維持しています。大気条件下で静的にインキュベーションリーフレットの細胞表現型は、弁尖の自然な生物学を維持するために機械的な力の重要性を示す、新鮮な培養弁尖に比べて減少した。 ECは、リーフレットのない改造で培養されたチラシの表面上に保持された。培養されたリーフレットでアポトーシス細胞の数が少ない静的インキュベートチラシや新鮮なリーフレットに匹敵するよりも有意（p <0.05）が有意であった。無菌のex vivoでの器官培養系は、このように生存率および48時間の期間の動的な条件下で培養した大動脈弁のネイティブの生物学的特性を維持しています。
大動脈心臓弁のex Vivoでの研究のための滅菌器官培養系の設計
機械的な力へのバルブの生物学的応答はよく理解されていません。本研究の目的は、様々な血行動態の条件にさらさ大動脈弁のex vivoでの研究を有効にするには、拍動性のシステムを設計することでした。生存率と不稔性を維持しつつ、リアクターは、生理学的および病態生理学的圧力と流量の条件にブタ大動脈弁に設計されています。圧力と流量が独立して臨床的に関連する機械的な条件を作り出すように制御することができます。酸素移動速度が特徴とされ、無菌操作が96時間以上を達成しました。酸素化機能は、長時間の操作をできるように、バルブに十分な酸素輸送を確保する。
ブタ大動脈弁間質細胞では高い圧力に差即時型初期遺伝子応答
心血管リスク因子は大動脈弁疾患の病因に役割を果たすと考えられている。本研究では仮説は上昇圧力が典型的炎症誘発性遺伝子の発現の変化を引き起こすことが提案された。したがって、MCP-1、オステオポンチン（OPN）、VCAM-1、GM-CSFおよびPAI-1の発現は半定量的リアルタイムRT-PCRを用いて検討した。
機械心臓弁漏れ領域をシミュレートオリフィスの流量及び血栓症
それは被害血液要素が漏れ、前方の流れの中で（MHVs）は人工心臓弁を確立されている間、高せん断流れの形状による血小板活性化の血栓形成における役割は不明である。本研究では、継続的にrecalcified血液が凝固トロンビンの生成と血栓の結果形成に及ぼすオリフィス、モデルMHVs、血流の効果を測定するために使用された。このプロセスには血小板の貢献も評価されました。
環状の大動脈圧は、ブタ肺動脈弁のリーフレットの生物学的特性に影響を与える
ネイティブ肺動脈弁リーフレット（PVL）は、大動脈弁尖に比べて低い圧力にさらされています。大動脈の圧力にさらされるPVLの生物学の知識は限られています。したがって、研究の目的は、正常な大動脈の圧力にさらさPVLの生物学的特性を明らかにすることである。
動物細胞からバイオ医薬品の生産のためのバイオリアクターシステム
バイオ医薬品の需要は今後数年間で大幅な増加を見るために設定されています。結果として、これらの製品を生産するために使用されるプロセスは、市場の要件を満たすことができなければなりません。また、最近のケーススタディの詳細を提供しながら、本論文では、動物細胞培養のために利用できる現在の技術をレビューし、各方法の長所と短所を強調しています。プロセスは、サスペンションと足場依存性細胞株の両方に記載されています。
遺伝子治療を目的としたウイルスベクターの生産のための細胞培養プロセス
遺伝子治療は、いくつか取得し、遺伝性疾患の治療のための有望な技術です。しかし、商業的および臨床的成功を収めるための遺伝子治療のために、スケーラブルな細胞培養プロセスは、市場の需要を満たすために、ウイルスベクターの必要量を生産する場所でなければなりません。ベクトルの各タイプには固有の特性と生産の結果、独自の課題があります。この資料では、効率的な、大規模なレトロウイルスの製造、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスベクター、単純のために開発された現在の技術を検討します。
2次元および3次元培養で異なる血清型を使用したブタ大動脈弁間質細胞活性の評価
バイオテクノロジー業界で使用される確立された細胞株とは異なり、組織工学で使用される主要な細胞は、培地は血清を添加する必要があります。最も一般的な血清はウシ胎児血清（FBS）ですが、FBSは、負のプロセス経済に影響を与え、高価です。あまり高価な代替血清は市販されているが、その効果は実証されていません。したがって、子ウシ血清（BCS）、ウシ成長血清（BGS）、及び新生仔ウシ血清（NCS）は、FBSと比較した。ブタ大動脈弁間質細胞は、（VICS）2次元（2-D）単層として、または10％FBS、BGS、BCS、またはNCSを添加した培地を用いた3次元（3-D）コラーゲンゲルとして培養した。 BGSとNCSで培養した細胞はFBSで培養した細胞よりも著しく高い代謝活性と結合し有意に低い固有の成長率を持っていたのに対し、有意な差は、BCSで培養されたVICおよび2-Dの文化ではFBSで培養し、それらの間に細胞の活動に見られなかった。統計的に有意な差は細胞は3次元構造体で培養した血清のいずれかの間に細胞の活動は見られなかった。結論として、BCSは、組織工学弁を開発するために使用されるVICの2-Dおよび3-D培養用FBSに適した代替手段です。
大動脈心臓弁のメカノ
大動脈心臓弁は、複雑で洗練された構造になって機械的に厳しい環境で機能する。各心周期で、血流はせん断応力、曲げ応力および弁組織上の引張と圧縮力を発揮する。これらの力は、遺伝子発現、蛋白質の活性化と細胞表現型を含む生物学的応答の茄多を決定します。その結果、機械的な力は、バルブの改造または病理学的変化に影響を与える可能性があります。心臓弁のメカノを理解することは膨大な作業です。ここで、物理的な力を持つ内皮細胞と間質細胞の相互作用の現在の知識を増加している最近の研究のいくつかが検討されています。さらに、実験の共培養モデルは、さらに内皮細胞間の相互作用の理解を向上させるために開発されていることを説明されています。最後に、それによって生体内実験でに相補的なアプローチを提供して器官培養システムは、心臓弁の生物学を研究するために利用されている手段は、記載されています。
Chondroinduction上に静水圧とずれ応力に及ぼす影響
胚発生およびいくつかの治癒過程で発生する未分化な結合組織では、多能性間葉系幹細胞が含まれています。それは機械的な環境は、これらの細胞のための重要な分化因子であることがますます明らかになっています。私たちの研究室では、間葉系幹細胞の軟骨分化を誘導するための機械的な信号のための潜在的な焦点を当てている。モデルとしてC3H10T1 / 2細胞を用いて、我々は静水圧、等二軸収縮、およびchondroinductionに遠心圧力の影響を調べた。細胞は、アグリカンやコラーゲンII型遺伝子の発現をアップレギュレートすることにより環状の静水圧圧縮（1 Hzで5 MPa）と環状の収縮ひずみ（1 Hzで15％）に対応した。加えて、遠心圧力（30分4.1 MPa）との効果の予備的研究は、細胞増殖を増加させ、プロテオグリカンとII型コラーゲンの産生を刺激することを示唆している。我々は未分化結合組織に適用され、それが自然の中でねじれたり、水圧であるかどうかは、その圧縮率を推測する圧縮荷重をサポートするためにますますより高い静水圧を維持することが可能である透過性が低い細胞外マトリックスの軟骨細胞様表現型と生産に向けて差別化をトリガします。
繰返しひずみは、ブタ大動脈弁内皮細胞において炎症性蛋白質の発現調節
健全なバルブは、これらの前炎症性蛋白質を欠いている病気の心臓弁の内皮細胞は、接着分子VCAM-1、ICAM-1およびE-セレクチンを発現することが知られています。研究の目的は、機械的な力は、大動脈弁内皮細胞において炎症誘発性反応に責任があったかどうかを判断することでした。
繰返しひずみは大動脈弁間質細胞における急性炎症性遺伝子発現を抑制
in vitroでの機械的な組織工学心臓弁の前処理は、生体移植の前に、組織開発のための不可欠なプロセスとして表示されています。しかし、炎症誘発性遺伝子の数は機械受容であり、その精緻化は、ホスト内の有害反応を誘発する可能性があります。我々は、単離された弁間質細胞への歪みの正常な生理的レベルのアプリケーションは、炎症誘発性遺伝子の発現を抑制するという仮説を立てた。細胞は、0、5、10、15および20％の株に供した。 VCAM-1、MCP-1、GM-CSFおよびOPNの発現は、次に定量RT-PCRを用いて測定した。ないひずみが適用されなかった場合OPNを除いて、すべての遺伝子が大幅にアップレギュレートした。ひずみの大きさが発現レベルに影響を及ぼさなかったものの、MCP-1の発現は、株の存在下で有意に低かった。 VCAM-1およびGM-CSFは正常な生理的条件を表し、15％の株を、最低の発現レベルを持っていた。これらの知見は、共焦点顕微鏡を用いて確認した。さらに、pSMAD 2月3日とIkappaBalpha発現は遺伝子発現の潜在的なメカニズムを解明するために撮像した。データは15％の株がpSMAD 2月3日の発現を増加させ、IkappaBalphaのリン酸化を防止することが明らかになった。結論としては、環状の株は、in vitroでの組織工学心臓弁のプレコンディショニングのために有益であるかもしれない炎症誘発性遺伝子の発現を、減らすことができます。
血管エージェントは、時間依存的に大動脈心臓弁尖の力学的特性を変化させる
血管作用薬、アンジオテンシンII（Ang IIの）と5 - ヒドロキシトリプタミン（5-HT）は、大動脈心臓弁疾患に関与しているが、これらの化合物が弁尖組織の生体力学的特性を変更する方法は不明である。研究の目的は、これらの化合物と共にインキュベートした組織の弾性率の時間的変化を特徴づけることを目指した。
ウイルスベクターへの導入
ウイルスベクターは、特定の細胞型または組織を変更するには、遺伝子導入の最も効果的な手段であり、治療用遺伝子を発現するように操作することができます。いくつかのウイルスの種類は、現在どちらの一時的または永続的な導入遺伝子の発現を提供するために、細胞に遺伝子を提供するために使用するために検討されている。これらは、アデノウイルス（ADS）、レトロウイルス（γ-レトロウイルスおよびレンチウイルス）、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれています。ルーチンの臨床使用のためのウイルスの選択は導入遺伝子の発現、生産の容易さ、安全性、毒性、および安定性の効率に依存します。この章では、一般的な遺伝子導入と遺伝子治療用彼らの長所と短所で使用されるウイルスベクターの一般的な特性の概要について説明します。
機械的ストレス下で大動脈弁尖のEN顔画像を送る
そのような腱、皮膚、動脈、または肺などの柔らかい組織は、生体内での機械的なストレスに常にあります。せん断応力、環状圧力、歪み、屈曲を含む軍の配列を経験大動脈心臓弁以上のようになし。異方性軸の環状のストレッチは、バルブの恒常性を維持しますが、異常な力が疾患の進行に関与している。生理学的なレベルからの逸脱への弁内皮細胞の応答は完全に特徴付けされていません。ここでは、同時に共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を介してライブエン顔内皮細胞イメージングを可能にしながら、実行可能な心臓弁組織に二軸延伸を適用することができる新規なストレッチ装置の設計と検証を示しています。非常に特徴機械的な条件を受けていると、ネイティブの細胞外マトリックスを維持しながら、組織のリアルタイムイメージングが可能です。したがって、従来の細胞培養上またはin vivo動物モデルでの重要な利点を提供しています。同時生細胞イメージングとストレッチ平面二軸組織は、任意の軟組織のメカノを研究する上で役立つ可能性があります。
炎症性遺伝子ネットワークの変調方式：高圧条件下での大動脈弁間質細胞の遺伝子プロファイリング
大動脈弁間質細胞（VICS）の上昇環状圧力によって刺激される機械受容経路や遺伝子ネットワークを識別し、有害な組織の再構築および/または病因につながるかを検討した。ブタ大動脈弁尖は、それぞれ、正常と高血圧の条件で拡張transvalvular圧力に対応する80または120 mmHgの周期的な圧力にさらされた。マイクロアレイに続いて全RNAのリニア、2サイクルの増幅は、トランスクリプトーム解析（定量RT-PCRの検証を含む）を行った。システム生物学モデリングとパスウェイ解析の組み合わせにより、新規遺伝子と高い圧力にVICの生物学的反応の根底にある分子機構を同定した。炎症反応のメカニズムに関連する56遺伝子の転写産物は差を発現させた。 TNF-α、IL-1αおよびIL-1βは、遺伝子ネットワークモデルから特定のキーサイトカインであった。ペントラキシン3（PTX3）は大幅（41倍の変化）を高圧条件下でアップレギュレートされたという発見はまた、関心のあった。結論としては、高圧にさらされるのVICで異なって発現し、炎症性遺伝子とそれらの相互作用を示す遺伝子ネットワークモデルが開発されました。このシステムの概要では、高血圧患者における大動脈弁狭窄症の薬物療法の対象とすることができる重要な分子を検出しました。
