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Articles by Jason Ballweg in JoVE
JoVE Neuroscience
Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen
Department of Anatomy, University of Wisconsin-Madison
Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zu zerlegen, zu transfizieren via Elektroporation und Kultur Maus Hippocampus und kortikalen Neuronen. Kurzfristige Kulturen können für die Untersuchung der Axon Auswuchs und Beratung verwendet werden, während die langfristigen Kulturen für ein Studium der Synaptogenese und dendritischen Dorn Analyse verwendet werden können.
Other articles by Jason Ballweg on PubMed
Positionierung Und Führung Von Neuronen Auf Gold Oberflächen Von Gerichtete Versammlung Von Proteinen Mit Atomic Force Microscopy
Wir zeigen, dass Atomic Force Microscopy Nanolithographie verwendet werden kann, um effektiv zu steuern, die Adhäsion, Wachstum und Interkonnektivität kortikale Neuronen auf Au-Oberflächen. Wir demonstrieren Immobilisierung von Neuronen in klar definierten Standorten auf Au-Oberflächen, die mit zwei verschiedene Arten von gemusterten Proteine: 1) Poly-d-Lysin (PDL), ein positiv geladenes Polypeptid extensiv in Gewebekultur und 2) Laminin, eine Komponente der extrazellulären Matrix. Unsere Ergebnisse zeigen, dass PDL und Laminin Muster neuronale Zellen beschränken und Steuerung ihres Wachstums und Interkonnektivität auf Au Oberflächen, ein wesentlicher Baustein für das Engineering von künstlichen neuronalen Assemblys mit kontrollierten Neuron Position und Anschlüsse verwendet werden können.
Distanz-Abhängigkeit Der Neuronale Wachstum Auf Nanopatterned Gold-Oberflächen
Netzentwicklung im Gehirn zu verstehen ist enorme grundlegend, aber es ist ungemein schwierig aufgrund der Komplexität von seiner Architektur und Funktion. Die Mechanismen der axonalen Navigation zu Zielregionen und die spezifischen Wechselwirkungen mit Anleitung Faktoren wie membrangebundener Proteine, chemischen Gradienten, mechanische Anleitung Hinweise usw., sind weitgehend unbekannt. Eine Strombegrenzung zur Erforschung der neuronalen Netzwerkbildung ist die Fähigkeit, genau die Anbindung von kleinen Gruppen von Nervenzellen zu steuern. Ein erster Schritt bei der Gestaltung solcher Netzwerke ist zu verstehen, dass die "Regeln" zentrales Nervensystem (ZNS) Neuronen funktionale Verbindungen miteinander verwenden. Hier beginnen wir neuartige Regeln für Wachstum und Konnektivität der kleinen Anzahl von Neuronen, die ein Muster auf Au Substrate in vereinfachten Geometrien abzugrenzen. Diese Studien liefern neue Erkenntnisse über die Mechanismen, die Bestimmung der Organisationsfunktionen in intakten Systeme vorhanden. Wir verwenden eine bereits berichtet Rasterkraft Mikroskopie (AFM) Nanolithographie Methode, um genau die Lage und das Wachstum von Neuronen auf diesen Flächen steuern. Durch eine Reihe von Systemen mit verschiedenen geometrischen Parameter untersuchen, quantitativ und systematisch analysieren wir wie neuronale Wachstum hängt diese Parameter.
Halbleiter Nanomembrane Röhren: Dreidimensionale Beengtheit Für Kontrollierte Neurit Auswuchs
In vielen Studien neuronale Kultur Neurit Migration auf eine flache, reflektiert die offene Oberfläche nicht die dreidimensionale (3D) Mikromilieu in-vivo. In diesem Sinne wir Arrays von Halbleiter-Rohren mit angespannt Silizium (Si) und Germanium (Ge) Nanomembranen fabriziert und sie als eine Zell-Kultur-Substrat für primäre kortikale Neuronen angestellt. Unsere Experimente zeigen, dass das SiGe-Substrat und die Rohr-Fertigung für Neuron Zellen biologisch lebensfähig sind. Wir beobachten auch, dass Neuronen von der Rohr-Topographie, auch in Abwesenheit von Adhäsion Faktoren, angezogen sind und geleitet werden können, um die Rohre während Auswuchs durchlaufen. Verbunden mit selektiven Aussaat von einzelnen Neuronen in der Nähe der Röhre öffnen, begrenzt Wachstum innerhalb einer Röhre auf ein einzelnes Axon. Darüber hinaus die Rohr-Funktion ähnelt der natürlichen Myelin, physikalisch und elektrisch, und es ist möglich, der Rohrdurchmesser in der Nähe von einem Axon, die einen engen 3D Kontakt mit der Axon-Membran und potenziell Isolier-und es aus der extrazellulären Lösung zu sein zu steuern.
BDNF-induzierte Zunahme Der PSD-95 Dendritische Dornen Erfordert Dynamischen Microtubule Invasionen
Mikrotubuli (MTs) können dendritische Dornen in Reife Neuronen durch dynamische Polymerisation eingeben. Obwohl diese MT-Invasionen direkt sind im Zusammenhang mit neuronalen Aktivität, ihre Funktion ist unbekannt. Hier zeigen wir in Maus-Neuronen, dass MT Einträge in Stacheln die Zunahme postsynaptisches Dichte-95 (PSD-95) Protein nach Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) Behandlung zu Regeln. Verwenden multiwavelength interne Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie, zeigen wir, dass BDNF die durchschnittliche Verweilzeit der MT in Dornen verlängert und dieser Effekt TrkB-Rezeptor-Aktivierung abhängig war. Weitere Prüfung ergab, dass die Gipfel des MT-Polymerisation in Dornen raschen Anstieg der PSD-95 zu der Wirbelsäule-Kopf entsprach. Im Laufe der Zeit Stacheln von MTs nach BDNF Anwendung ausgerichtet, aber nicht vor, zeigten eine robuste Zunahme PSD-95. Umgekehrt zeigte Stacheln völlig frei von MT Invasionen keine signifikante Veränderung des Niveaus der PSD-95. Pharmakologische Hemmung der MT Dynamik schaffte die BDNF-induzierte Zunahme der PSD-95. Diese Ergebnisse unterstützen gemeinsam die Hypothese, dass die bekannte Zunahme der PSD-95 innerhalb Stacheln nach BDNF Behandlung MT Invasionen dendritische Dornen abhängig ist. So unsere Studie stellt eine direkte Verbindung zwischen dynamischen MTs und der postsynaptisches Struktur, und bietet eine funktionale Rolle für MT Invasion dendritische Dornen.
Dynamische Mikrotubuli Fördern Synaptische NMDA-Rezeptor-abhängige Wirbelsäule-Erweiterung
Die meisten erregenden synaptischen Terminals im Gehirn beeinflussen auf dendritische Dornen. Wir und andere haben vor kurzem gezeigt, dynamische Mikrotubuli (MTs) Stacheln von der dendritischen Welle eingeben. Jedoch eine direkte Rolle für MTs in dauerhafte Wirbelsäule Plastizität muss noch bewiesen werden, und es bleibt unklar, ob MT-Spine Invasionen von synaptischen Aktivität direkt beeinflusst werden. Bleibende Veränderungen in der Wirbelsäule Morphologie und synaptische Stärke können durch Aktivierung der synaptischen NMDA-Rezeptoren (NMDARs) ausgelöst werden und lernen und Gedächtnis Prozesse zugeordnet sind. Um festzustellen, ob MTs an NMDAR-abhängige Wirbelsäule Plastizität beteiligt sind, abgebildet wir MT Dynamik und Wirbelsäule Morphologie im Leben Maus pyramidale Neuronen vor und nach der akuten Aktivierung des synaptischen NMDARs. Synaptische NMDAR Aktivierung befördert MT-Spine Invasionen und dauerhaften Anstieg der Größe der Wirbelsäule, mit überfallen Stacheln ausstellen deutlich schneller und mehr Wachstum als Stacheln nicht eingefallen. Sogar einzelne MT Invasionen ausgelöst raschen Anstieg der Wirbelsäule-Größe, die längere folgende NMDAR Aktivierung beibehalten. Hemmung von NMDARs oder dynamische MTs blockiert NMDAR-abhängige Wirbelsäule Wachstum. Zusammen diese Ergebnisse zeigen erstmals, die MT-Spine Invasionen positiv für die Signalisierung durch synaptische NMDARs geregelt sind und für langfristige strukturelle Veränderungen gezielt Stacheln beitragen.
