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Articles by Jason Ballweg in JoVE
JoVE Neuroscience
Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養
Department of Anatomy, University of Wisconsin-Madison
このプロトコルは、エレクトロポレーションと文化のマウス海馬および皮質のニューロンを経由してトランスフェクション、解剖するために必要な手順を説明します。長期培養がシナプスと樹状突起棘の解析の研究に使用することができますが、短期的な文化は、軸索伸長やガイダンスの研究に使用されることがあります。
Other articles by Jason Ballweg on PubMed
原子間力顕微鏡を用いたタンパク質の監督総会による金表面上におけるニューロンの位置とガイダンス
我々は原子間力顕微鏡のナノリソグラフィーを効果的に金表面上の皮質神経細胞の接着、成長、および相互接続性を制御するために使用できることを示している。我々は、パターン化されたタンパク質の2つの異なるタイプを使用して金表面上の明確に定義された場所で神経細胞の固定化を示し、1）ポリ-D-リジン（PDL）、組織培養とで広く使用され、正に荷電ポリペプチド2）ラミニンのコンポーネント細胞外マトリックス。我々の結果は、PDLおよびラミニンのパターンの両方が、よく制御されたニューロンの位置と接続を持つ人工神経アセンブリのエンジニアリングに向けた重要な一歩を神経細胞を閉じ込めるとAu表面上の彼らの成長と相互接続性を制御するために使用することができることを示している。
ナノパターン金表面上の神経成長の距離依存性
脳内ネットワークの開発を理解することは途方もない基本的に重要であるが、それは、そのアーキテクチャと機能の両方の複雑さを非常に困難である。ターゲット領域とそのような膜結合タンパク質、化学勾配、機械的な指導の手がかり等として、ガイダンス因子との特異的相互作用への軸索ナビゲーションのメカニズムは不明な点が多い。神経ネットワーク形成の研究のための電流制限を正確にニューロンの小グループの接続を制御する機能です。このようなネットワークを設計する最初のステップは、中枢神経系（CNS）のニューロンが互いに機能的な接続を形成するために使用する "ルール"を理解することです。ここでは簡略化ジオメトリのAu基板上にパターン化され、ニューロンの数が少ないの成長との接続のための新たなルールを記述するために開始します。これらの研究は、そのままシステムに存在する組織の機能を決定するメカニズムに新たな洞察を得ることができます。我々は、これらの表面上に正確に位置とニューロンの成長を制御するために、以前に報告された原子間力顕微鏡（AFM）ナノリソグラフィーメソッドを使用します。異なる幾何学的パラメータを持つ一連のシステムを調べることによって、我々は定量的かつ体系的に神経細胞の成長は、これらのパラメータに依存するかを分析。
半導体Nanomembraneチューブ：制御神経突起の伸長のための3次元閉じ込め
多くの神経培養の研究では、平らな、開いた表面上の突起の移行は、生体内で3次元（3D）微小環境を反映していません。このことを念頭に置いて、我々は、歪みシリコン（Si）とゲルマニウム（Ge）ナノ薄膜を用いた半導体チューブの配列を作製し、一次皮質ニューロンの細胞培養の基質としてそれらを採用しています。我々の実験は、SiGe基板と真空管の製造プロセスは、ニューロン細胞の生物学的に実行可能であることを示している。我々はまた、ニューロンがあっても接着因子の不在下で、チューブ形状に惹かれ、伸長時にチューブを通過する案内することができることを確認します。チューブの開口部に近い個々のニューロンの選択的播種と相まって、チューブ内の成長は、単一の軸索に限定することができます。さらに、チューブの機能は、両方の物理的および電気的、自然のミエリンに似ている、それが軸索の膜で閉じ込められた3次元の接触を提供し、潜在的に細胞外液から、それを絶縁、軸索のそれに近くなるように管径を制御することが可能です。 。
樹状突起棘のPSD-95のBDNF誘発性の増加は、動的な微小管の侵入が必要です
微小管（MTS）は、動的重合により成熟した海馬ニューロンの樹状突起棘を入力することが可能である。これらのMTの侵入が直接神経活動に関連付けられているが、その機能は不明である。ここでは、棘にMTのエントリは、シナプス後密度-95脳由来神経栄養因子（BDNF）治療後（PSD-95）タンパク質の増加を調節することがマウス海馬神経細胞で示しています。多波長全内部反射蛍光顕微鏡を用いて、我々はBDNFが平均的なMTは棘で、この効果はTrkBの受容体の活性化に依存していたその滞留時間を延長することを示している。さらに検査は棘にMT重合のピークが脊椎の頭の中で急速にPSD-95の増加に対応したことを明らかにした。時間が経つにつれて、BDNFの適用後ではなく、前に、MTSの標的に棘は、PSD-95の堅牢な増加を示した。逆に、MTの侵入を完全に欠いている棘はPSD-95のレベルには有意な変化は認められなかった。 MTダイナミクスの薬理学的阻害は、PSD-95のBDNF誘発性の増加を廃止した。一緒に、これらの結果は、BDNF処理後の棘内でPSD-95のよく知られている増加は樹状突起棘のMTの侵入に依存しているという仮説を支持している。したがって、我々の研究では、動的なMTSおよびシナプス後構造の間に直接リンクを提供し、樹状突起棘のMT侵攻のための機能的役割を提供します。
動的な微小管はシナプスNMDA受容体依存性の脊椎の拡大を推進
脳の中で最も興奮性シナプス端末は樹状突起棘に当たる。我々や他の最近の動的微小管（MTS）は、樹状突起軸から棘を入力することが示されている。しかし、長期的な脊椎の可塑性におけるMTSの直接的な役割が実証されてまだ持っていて、MT-脊椎の侵入が直接シナプス活性によって影響されているかどうかは依然として不明である。スパイン形態とシナプス強度の持続的な変化は、シナプスのNMDA受容体の活性化（NMDARs）によってトリガすることができ、学習と記憶のプロセスに関連付けられています。 MTSがNMDAR依存背骨の可塑性に関与しているかどうかを判断するために、我々は、シナプスのNMDARの急性活性化の前と後のライブマウス海馬錐体ニューロンではMTのダイナミクスとスパイン形態をイメージした。シナプスのNMDARの活性化は、非侵略棘よりもかなり速く、より成長を示す侵略棘で、MT-脊椎侵略と背骨の大きさの持続的な増加を促進した。さらには個々のMTの侵入が長く、次のNMDARの活性化を持続脊椎サイズの急激な増加を引き起こした。 NMDARsまたは動的MTのいずれかの阻害はNMDA受容体依存性の脊椎の成長をブロックされています。一緒にこれらの結果は、MT-背骨の侵略を積極的にシナプスNMDARsを介したシグナル伝達によって調節されることを初めて実証し、ターゲットを絞った棘の長期的な構造変化に貢献しています。
