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Articles by Jerome Harms in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta
1Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin-Madison, 2Pathobiological Sciences, University of Wisconsin-Madison
Molte infezioni provocano una forte risposta CTL, ma a volte, la quantità di cellule rispondono non è correlata al controllo del patogeno
Other articles by Jerome Harms on PubMed
Induzione Di Th1-type Della Risposta Immunitaria Ma Non Protettivo Immunità Da Intramuscolare Vaccinazione Del DNA Con Il Gene Di Brucella Abortus GroEL Calore-shock
L'immunogenicità e l'efficacia protettiva di un vaccino di DNA che codifica il gene di scossa di calore GroEL da Brucella abortus è stato testato in topi BALB/c vaccinati da iniezione ago intramuscolare (i.m.) o epidermally da pistola del gene. Il gene Brucella GroEL è stato amplificato mediante PCR e clonato in due vettori di espressione diversi mammiferi pCMV-link e pCMV-tPA. La linea cellulare D17 è stato transfected con entrambi costrutti e GroEL trascrizioni sono state rilevate da Northern blot. Per determinare il livello di proteine sintetizzate, celle transfected lisati sono stati poi sottoposti a Western blot. La forma non-secreto di ricombinante GroEL prodotto dal costrutto pCMV-link è stata rilevata in quantità molto maggiore che la forma secreta della proteina prodotta dal costrutto pCMV-tPA. Dopo la vaccinazione, una risposta di IgG anti-GroEL forte è stata rilevata nei topi vaccinati per iniezione i.m. o gene gun solo quando il link pCMV GroEL plasmide è stato utilizzato. Per quanto riguarda il modello di risposta immunitaria indotta, iniezione ago i.m. ha generato una risposta Th1 con principalmente IgG2a specifici anti-GroEL e alti livelli di IFN-gamma prodotta da cellule T spleniche. Immunizzazione pistola genica indotta da un tipo di ThO della risposta immunitaria nei topi caratterizzati da un elevato rapporto IgG1/IgG2a e IL-4 e interferone (IFN)-produzione di gamma. Anche se un distinto pattern di risposta immunitaria è stato generato dipendendo l'immunizzazione itinerario utilizzato, né Metodo generò un notevole livello di protezione con il vaccino di GroEL DNA.
Virus Dell'encefalomiocardite E Mengo Infettare Produttivamente Murini Linee Di Cellule Di T-linfociti, Ma Non Fresco Ex Vivo Derivato Linfociti T
Mengo virus e virus dell'encefalomiocardite (EMCV) sono altamente virulenti murino cardioviruses che si trovano in quantità abbondanti nella milza e linfonodi dopo l'infezione. I linfociti T sono pivotal mediatori dell'immunità cellulare e umorale contro cardioviral sfida e sono candidati altamente sospetti di infezione da virus EMCV e Mengo. Abbiamo trovato delle cellule dei linfociti T-come linee CTLL-2, EL-4 + 2/9, LY1 e LBRM33 sono stati sensibili a produttivo infezione virale ed esposto citopatologia dopo l'infezione con virulento EMCV-R o attenuato vMC24 e Mengo virus ceppi vMC0. Analisi citofluorimetriche dimostrato progressivo accumulo intracellulare di proteine virali, come ad esempio la polimerasi virale 3D di replica-dipendente, in EL-4 cellule durante l'infezione. Al contrario, appena isolate e mitogene-stimolato le cellule CD4 + e CD8 + T erano resistenti all'infezione produttiva con questi virus, non esibendo effetti citopatici virale indotta o presenza intracellulare di proteine virali. Questi dati indicano che anche se T-linfocita-come linee di cellule tumorali sono altamente suscettibili di infezione virale e gli effetti citopatici, primaria/appena isolato cellule T sono resistenti all'infezione da virus EMCV-R o Mengo.
Una Maggiore Efficacia Dei Vaccini DNA Contro Un Patogeno Intracellulare Batterico Da Genetici Coadiuvanti
Dopo 200 anni di pratica, vaccinologia ha dimostrato di essere molto efficace nella prevenzione delle malattie infettive. Tuttavia, diversi agenti patogeni umani e animali esistono per cui i vaccini devono essere migliorato o semplicemente non hanno ancora stato scoperto. L'epoca di molecolare genetica ha dato un nuovo respiro per lo sviluppo del vaccino con la realizzazione della "Terza generazione di vaccini": il vaccino a DNA. In questo articolo, abbiamo recensito strategie che sono state utilizzate per migliorare e modulano la risposta immunitaria indotta da vaccini a DNA, utilizzando come modello l'agente patogeno batterico intracellulare Brucella abortus. In primo luogo, abbiamo descritto diversi approcci utilizzati per isolare e identificare i geni che codificano immunogeni potenziali. In secondo luogo, abbiamo segnalato l'uso di geni di citochine e genetici coadiuvanti che potrebbero migliorare l'immunogenicità dei geni bersaglio. E infine, abbiamo discusso la "strategia espressione libreria Immunization"-(ELI) e i recenti risultati ottenuti contro l'infezione da Brucella abortus.
Proteine Del Tegumento Herpesvirus Bovino VP22 Migliora La Terapia Genica Di Timidina Chinasi/ganciclovir Suicidio Per Neuroblastomi Rispetto Al Virus Dell'herpes Simplex VP22
Proteina di tegumento herpesvirus VP22 può migliorare l'effetto delle proteine terapeutiche in terapia genica, come ad esempio la timidina chinasi (tk) e p53; Tuttavia, il meccanismo è poco chiaro o controverso. In questo studio, espressione dei mammiferi di vettori che trasportano bovine herpesvirus 1 (BHV-1) VP22 (BVP22) o il virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) VP22 (HVP22) e herpesvirus equino tipo 4 (EHV-4) tk (Etk) sono stati costruiti al fine di valutare e confrontare le potenzialità terapeutiche del BVP22 e HVP22 per migliorare la terapia genica Etk/ganciclovir (Etk/GCV) suicidio neuroblastomi GCV citotossicità dosaggi e non invasiva bioluminescenti imaging in vitro e in vivo. BVP22 enhanced citotossicità Etk/GCV rispetto a quello con HVP22 in vitro e in vivo. Tuttavia, utilizzando una miscela di cellule parentali e stabile transfected le analisi indicato che il miglioramento è stato rilevato solo nelle celle transfected. Così, il potenziale terapeutico di BVP22 e HVP22 nella terapia genica di Etk/GCV suicidio in questo sistema di tumore non è dovuta a VP22 consegna di Etk nelle cellule circostanti, ma piuttosto è probabilmente a causa di un maggiore effetto intracellulare.
Confronto Del Virus Della Leucemia Bovina (BLV) Ed Espressione Del Gene Reporter Guidata Da Promotore CMV Nelle Cellule BLV-infetti E Non Infetti
SFONDO: Promotori virali sono utilizzati nei vettori di espressione dei mammiferi, perché in genere hanno forte attività in un'ampia varietà di cellule di diversi tessuti e specie. Metodi: L'utilità del BLV LTR/promotore (BLVp) per uso in vettori di espressione dei mammiferi è stato studiato tramite confronto diretto al promotore CMV (CMVp). Attività di promotore è stata misurata utilizzando dosaggi luciferase di linee cellulari da diversi tessuti e specie transduced stabile con BLVp o CMVp basato su vettori luciferase D17, FLK, BL3.1 e le cellule B bovina primarie. Le cellule inoltre sono state modificate tramite l'aggiunta di vettori di espressione BLV fiscale e/o infezione BLV così come il trattamento con trichostatin A (TSA). RISULTATI: I risultati indicano che il promotore BLV, pur avendo bassa attività basale rispetto al promotore CMV, può essere indotta da alti livelli di attività simili al promotore CMV in tutte le cellule testate. Fiscale o BLV infezione avanzata specificamente BLVp attività con nessun effetto sull'attività CMVp. Al contrario, l'attivatore non specifici, TSA, rafforzata attività BLVp e di CMVp. CONCLUSIONE: Sulla base di questi dati, concludiamo che il promotore BLV potrebbe essere molto utile per l'espressione del transgene nei vettori di espressione dei mammiferi.
Il Ruolo Dell'integrasi/ricombinasi XerD E Monofunzionali Biosintesi Peptidoglicano Transglycosylase Geni Nella Patogenesi Dell'infezione Da Brucella Abortus in Vitro E in Vivo
Cloni abortus Brucella identificati in precedenza utilizzando un sistema di fluorescenza verde proteina reporter dopo infezione macrofago h 4 fornito intuizione per quanto riguarda possibili geni coinvolti nell'interazione ospite-patogeno precoce. Tra individuati geni sono stati coinvolti nella divisione cellulare e un gene monofunzionali di transglycosylase (mtgA) peptidoglicano di biosintesi che catalizza la seguente le fasi finali della sintesi della membrana del peptidoglicano un gene integrasi/ricombinasi (xerD). Qui, valutiamo la sopravvivenza in vitro e in vivo di b. abortus xerD e mtgA inserzionale mutanti. XerD::kan b. abortus e b. abortus mtgA::kan non dimostrato difetti di crescita significativa nel brodo di coltura rispetto al ceppo parentale, S2308. Inoltre, né gene era necessaria per b. abortus S2308 replica in macrofagi RAW 264.7. Tuttavia, prove sperimentali utilizzando topi knockout di interferone fattore regolatore 1, un ceppo di topo altamente suscettibile di Brucella virulento, ha rivelato che topi infettati con b. abortus xerD::kan o mtgA::kan di b. abortus sopravvissero più a lungo rispetto ai topi infettati con S2308. Inoltre, in topi BALB/c immunitarie, b. abortus xerD::kan avevano un livello significativamente inferiore di sopravvivenza batterica rispetto al S2308. Insieme, questi risultati suggeriscono che b. abortus xerD e mtgA geni svolgono un ruolo durante la fase iniziale dell'infezione nei topi.
Herpesvirus Bovino VP22 Induce Apoptosi Nelle Cellule Di Neuroblastoma Upregulating Il Rapporto Tra Espressione Di Bax, Bcl-2
Proteina di tegumento herpesvirus VP22 ha dimostrata di avere bioterapeutici potenziale nella terapia genica del tumore. Alcuni studi indicano che VP22 può migliorare l'efficienza di trasferimento delle proteine terapeutiche consegnando a più celle mentre si tratta. Il nostro precedente studio ha mostrato che l'herpesvirus bovino VP22 (BVP22) enhanced terapia genica herpesvirus equino timidina chinasi-ganciclovir (Etk-GCV) suicidio da un effetto sconosciuto intracellulare. In questo studio, è stata studiata l'interazione tra host e BVP22 le cellule tumorali in cellule di neuroblastoma NXS2. Analisi del ciclo cellulare è stata eseguita per determinare se BVP22 possiede potenziale bioterapeutici alterando il ciclo cellulare, rendendo le cellule più sensibili alla terapeutica geni. Di conseguenza, il ciclo cellulare non è stato influenzato dalla transfezione di BVP22 nelle cellule NXS2. Tuttavia, citotossicità indotta da BVP22 è stata osservata nelle cellule NXS2 del secondo e del terzi giorni dopo la trasfezione transiente. Inoltre, analisi di attività di caspase-3 e l'apoptosi suggerito che BVP22 induce apoptosi nelle cellule tumorali host da upregulating il rapporto tra espressione di Bax, Bcl-2.
Brucella: Genomica Funzionale E Delle Interazioni Ospite-patogeno
Brucellosi sono una malattia zoonotica causata da un certo numero di specie di Brucella ed sono caratterizzata da un'infezione cronica dei macrofagi. Tuttavia, geni che possono contribuire alla sopravvivenza intracellulare della Brucella specie non sono ben studiati. Questa rassegna presenta, isole genomiche, prime che siano presentano o assenti in varie specie di Brucella che possono aiutare a stabilire strategie di infezione e di sopravvivenza di Brucella. In secondo luogo, l'alterazione nella trascrizione dei macrofagi da Brucella per consentire la sopravvivenza a lungo termine all'interno di questo ambiente ostile intracellulare. Un gran numero di trascrizioni di macrofago gene è alterato dopo infezione da Brucella che indica che la Brucella non è un invasore silenzioso delle cellule ospiti. Livelli di trascrizione dei macrofagi associati con l'infiammazione, apoptosi, trasduzione del segnale e traffico vescicolare intracellulare sono alterati durante l'infezione da Brucella e probabilmente contribuiscono alla sopravvivenza intracellulare di Brucella. Infine, gli eventi di interazione di ospite-patogeno associati a infezione da Brucella in topi vivi visualizzati in tempo reale utilizzando biophotonic imaging. Topi sono spesso utilizzati per valutare infezioni da Brucella; Tuttavia, patogenesi e la diffusione di Brucella è scarsamente compreso nei topi. Biophotonic imaging delle infezioni da Brucella rivelato siti di localizzazione batterica simile a infezioni umane e diversi modelli di infezione da Brucella attenuato o virulento.
TBK1 Non Gioca Un Ruolo Nel Controllo in Vitro Crescita Di Burkholderia Pseudomallei
Burkholderia pseudomallei, l'agente eziologico della melioidosi, è un patogeno intracellulare importante nelle regioni tropicali. SERBATOIO-associazione chinasi (TBK1), parte del percorso che induce la trascrizione dei geni di interferone di tipo I, ha dimostrato di giocare un ruolo importante nel controllare le infezioni batteriche intracellulari. Per indagare il ruolo di tbk1 nella protezione contro B. pseudomallei abbiamo sviluppato tbk1-carenti cell lines tramite shRNA per atterramento transitoria del gene in cellule HeLa e RAW 264.7 tbk1. In cellule RAW tbk1-carenti, la replica di Escherichia coli invasiva e non invasiva è stata aumentata significativamente a 48 h dopo l'infezione confrontato con selvaggio-tipo celle. Il risultato è stato confermato tramite Brucella melitensis in cellule HeLa tbk1-carenti, che ha dimostrato un > 1.5-2.0 registro superiore conta batterica a 6-48 ore dopo l'infezione rispetto alle cellule wild-type. Al contrario, la crescita di Burkholderia pseudomallei esprimendo tipico (A2) o atipica (G207) lipopolisaccaride non era significativamente diversa tra le cellule tbk1-carenti e controllo. Questi risultati suggeriscono che il gene tbk1 e la sua attivazione può essere in grado di controllare invasiva e. coli, non invasivi E. coli e b. melitensis crescita ma potrebbe non essere in grado di controllare l'infezione da b. pseudomallei. Il ruolo del gene tbk1 in proinflammatory cytokine induzione batterica intracellulare infezione e necessita di ulteriori indagini per identificare differenze meccanicistiche tra i cicli di vita di vari batteri intracellulari.
Valutazione Di Ricombinanti Invasive, Non Patogeni Eschericia Coli Come Un Vettore Di Vaccino Contro I Patogeni Intracellulari, Brucella
ABSTRACT:
Brucella TIR Dominio Contenenti Proteine Imita Le Proprietà Della Proteina Adattatore Recettore Toll-like TIRAP
Recettori toll-like (TLR) svolgono un ruolo essenziale nell'attivazione della risposta immunitaria innata contro infezioni microbiche. TLR e adattatore a valle molecole contenga un dominio citoplasmatico conservato di TIR. TIRAP è una TIR dominio contenenti proteina dell'adattatore che recluta la segnalazione adattatore MyD88 a un sottoinsieme di TLR. Molti microrganismi patogeni sovvertono TLR vie di segnalazione per sopprimere la risposta immunitaria ospite a beneficio loro sopravvivenza e persistenza. Brucella codifica una TIR dominio contenenti proteine (TcpB) che inibisce l'attivazione di NF-kappaB TLR2 e TLR4-mediata. Analisi di sequenza ha indicato un moderato livello di somiglianza tra TcpB e la molecola dell'adattatore TLR TIRAP. Abbiamo trovato che TcpB efficiente potrebbe bloccare attivazione di NF-kappaB indotta TIRAP. Studi successivi ha rivelato che per analogia a TIRAP, TcpB interagisce con phosphoinositides attraverso il suo dominio N-terminale e colocalizza con i componenti del citoscheletro e membrana plasmatica. I nostri risultati suggeriscono che TcpB obiettivi il pathway mediato TIRAP per sovvertire la segnalazione di TLR. Studi in vivo del mouse indicarono che TcpB-carenti Brucella è difettoso nella diffusione sistemica nelle fasi iniziali dell'infezione.
Discordanti Antigeni Di Brucella Melitensis Producono Cellule T CD8 + Affine in Vivo
Brucella spp sono batteri intracellulari che causano le zoonosi più frequenti nel mondo. Anche se recenti lavori ha avanzato il campo di sviluppo di un vaccino Brucella, non ci rimane alcun vaccino umano sicuro. Al fine di produrre un vaccino sicuro ed efficacia di umano, la risposta immunitaria alla Brucella spp richiede una maggiore comprensione. Induzione di cellule T CD8 + specifico Brucella è considerato un aspetto importante della risposta dell'ospite; Tuttavia, la risposta di cellule CD8 + T non è chiaramente definita. Scoprendo l'epitopo contenenti gli antigeni riconosciuti da Brucella specifiche CD8 + T cellule e la loro correlazione con dati di microarray sarà di aiuto nel determinare le proteine fondamentali per lo sviluppo del vaccino che coprono un continuum cinetico durante l'infezione. Sviluppo di strumenti per sfruttare i vantaggi del modello di topo BALB/c dell'infezione da Brucella melitensis aiuterà a chiarire la correla dell'immunità e migliorare l'efficacia di questo modello. Sono stati caratterizzati due epitopi H-2(d) CD8 + cellule T, e un gruppo di proteine immunogene hanno provocato la produzione di interferone gamma da cellule T CD8 +. RYCINSASL e NGSSSMATV indotta da cellule T CD8 + affine dopo immunizzazione del peptide che ha mostrato specifiche uccidendo in vivo. Soprattutto, abbiamo trovato da analisi microarray che i geni che codificano per questi epitopi sono differenzialmente espressi in seguito a infezione di macrofagi, ulteriormente sottolineando che questi geni discordi possono giocare un ruolo importante nella patogenesi dell'infezione da b. melitensis.
Modulazione Della Dinamica Dei Microtubuli Da Una Proteina Di Dominio TIR Da Agente Patogeno Intracellulare Brucella Melitensis
Proteine contenenti dominio TIR (pedaggio/interleukin-1 receptor) giocano un ruolo cruciale nell'immunità innata negli eucarioti. Brucella è un batterio intracellulare altamente infettivo che codifica per una proteina di dominio TIR (TcpB) a sovvertire host risposta immunitaria innata per stabilire una nicchia benefica per la patogenesi. TcpB inibisce l'attivazione di NF-κB (fattore nucleare κB) e secrezione di citochine pro-infiammatorie mediate da TLR (Toll-like receptor) 2 e TLR4. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che TcpB modula dinamica dei microtubuli, agendo come un fattore di stabilizzazione. TcpB aumentato il tasso di nucleazione, nonché le fasi di polimerizzazione della formazione dei microtubuli in un modo simile a paclitaxel. TcpB potrebbe inibire efficacemente disassemblaggio dei microtubuli nocodazole o indotta dal freddo. Stabilizzazione dei microtubuli da TcpB è attribuita alla regione BB-loop del dominio TIR e una mutazione puntiforme colpite la stabilizzazione dei microtubuli, come pure le proprietà di TLR-soppressione di TcpB.
Brucella Melitensis Di-GMP Ciclico Fosfodiesterasi BpdA Controlla L'espressione Dei Geni Flagellari
Brucella melitensis incontra una varietà di condizioni e di stimoli durante il suo ciclo di vita - inclusi crescita ambientale, infezione intracellulare ed extracellulare diffusione - che necessita di flessibilità di segnalazione batterica per promuovere la virulenza. Di-GMP ciclico è una molecola di segnalazione secondaria batterica che svolge un ruolo importante nell'adattamento ad ambienti mutevoli e alterando la virulenza in un numero di batteri. Per indagare il ruolo di ciclico-di-GMP in b. melitensis, tutti 11 predetto ciclico-di-GMP-metabolizzare proteine separatamente sono state eliminate e l'effetto sulla virulenza è stata determinata. Tre di queste proteine ciclico-di-GMP-metabolizzazione sono stati trovati per alterare la virulenza. Eliminazione dei geni bpdA e bpdB portato in attenuazione della virulenza del batterio, mentre la delezione del gene cgsB prodotto un ceppo supervirulenti. In un sistema di reporter Vibrio per monitorare apparente alterazione nei livelli di ciclico-di-GMP, BpdA BpdB visualizzati sia un fenotipo coerenza con ciclico-di-GMP specifiche fosfodiesterasi, mentre CgsB visualizzato un fenotipo ciclico-di-GMP sintetasi. Un'ulteriore analisi ha scoperto che eliminazione di bpdA ha provocato un calo drammatico nelle attività di promotore flagellari e un mutante flagellari ha mostrato fenotipi simili al bpdA e bpdB in modelli murini di infezione da ceppi mutanti. Questi dati indicano un ruolo potenziale per regolamento di flagelli in Brucella melitensis via ciclico-di-GMP.
