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Articles by Jerome Harms in JoVE
JoVE Immunology and Infection
抗原特異的インビボでのキリングアッセイ
1Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin-Madison, 2Pathobiological Sciences, University of Wisconsin-Madison
多くの感染症は、強力なCTL応答を誘発するが、時折、応答する細胞の量は、病原体の制御に相関しない
Other articles by Jerome Harms on PubMed
Th1 型免疫応答が筋肉内の DNA 予防接種ブルセラ早産 GroEL 熱ショック遺伝子がによってない防御免疫の誘導
免疫原性と GroEL 熱ショック遺伝子ブルセラから DNA ワクチンの防御効果は筋肉内 （イオ ミン） 針の注入によってまたは epidermally 遺伝子銃によって予防接種 balb/c マウスでテストしました。ブルセラ GroEL 遺伝子 PCR によって増幅され、2 つの異なる哺乳類式ベクトル pCMV リンクと pCMV tPA にクローンを作成します。D17 セルラインが両方のコンストラクトを導入だったし、GroEL の成績証明書によって北のしみが検出されました。合成タンパク質のレベルを決定するには、transfected セル lysates は、西部のしみに提出されました。非分泌フォーム GroEL pCMV リンク構築による生産遺伝子組換え pCMV tPA コンストラクトによって生成されるタンパク質の分泌のフォームより大きい量で検出されました。予防接種後強い反 GroEL IgG 応答によって注射接種マウスで検出されたまたは遺伝子銃のときにのみ pCMV リンク/GroEL プラスミッドが使用されました。免疫応答のパターンに関する誘導、イオ ミン針の注入の発生は主に th1 細胞応答主 IgG2a 固有アンチ GroEL と高レベルの IFN-γ 生産による脾 T 細胞。遺伝子銃予防接種カントー タイプ、高 IgG1/IgG2a 比と IL-4 とインターフェロン (IFN) 特徴マウスの免疫応答の誘導-ガンマ生産。免疫応答の明確なパターンが使用される予防接種ルート要に応じて生成されたにもかかわらず、どちらのメソッドも GroEL DNA ワクチンと保護の重要なレベルを発生させた。
脳心筋炎とMengoウイルスは、生産性のマウスTリンパ球細胞株が、Tリンパ球由来の新鮮でないex Vivoでの感染
脳心筋炎ウイルス（EMCV）とメンゴウイルスは、感染後の脾臓やリンパ節に豊富な量で検出された高病原性マウスcardiovirusesです。 Tリンパ球はcardioviralチャレンジに対する体液性および細胞性免疫の重要なメディエーターであり、非常にEMCVとメンゴウイルス感染の候補を疑うされています。我々は、Tリンパ球様細胞株CTLL-2、EL-4は、LY1 +2 / 9、LBRM33生産性ウイルス感染に感受性であったと毒性EMCV-Rまたは弱毒化Mengoウイルス株vMC0とvMC24感染後細胞病理学展示しています。フローサイトメトリー分析は、感染時のEL-4細胞では、このような複製に依存した3Dウイルスポリメラーゼのようなウイルス蛋白質の漸進的な細胞内蓄積を示した。逆に、新たに単離され、マイトジェン刺激CD4 +およびCD8 + T細胞は、ウイルスによって誘発される細胞変性効果やウイルスタンパク質の細胞内の存在を示さない、これらのウイルスの増殖性感染に耐性であった。これらのデータは、T-リンパ球様の腫瘍細胞株は非常にウイルス感染に対する感受性および細胞変性効果、プライマリ/であるが新たに単離したT細胞は、EMCV-RまたはMengoウイルスによる感染に耐性であることを示している。
DNA は細胞内細菌の病原体による遺伝的アジュバント ワクチンの強化の効果
練習の 200 年後、ワクチン学感染症を防ぐために非常に効果が証明しています。ただし、いくつかの人間と動物の病原体をワクチンが改善されるか、単にまだ発見されていないする必要があります存在。遺伝分子の時代に新しい息吹「ワクチンの第三世代」の達成と、ワクチン開発のために与えている： DNA ワクチン。この記事では、細胞内細菌の病原体ブルセラもモデルとして用いたを改善し、DNA ワクチンにより誘導される免疫応答の調節に使用されている戦略を見直し。まず、分離と潜在的なとり込みエンコード遺伝子を識別するために使用されるさまざまなアプローチについて説明します。第二に、サイトカイン遺伝子と標的遺伝子の免疫原性を向上させることができる遺伝的アジュバントの使用を報告しました。そして最後に、我々 は、"式ライブラリ Immunization"-(ELI) 戦略と最近の成果ブルセラ早産感染に対する取得議論
ウシヘルペスウイルス外郭タンパク質VP22は、チミジンキナーゼ/単純ヘルペスウイルスVP22に比べて神経芽細胞腫のためのガンシクロビル自殺遺伝子療法を強化
ヘルペスウイルス外郭タンパク質VP22は、チミジンキナーゼ（TK）およびp53の遺伝子治療の治療用タンパク質の効果を高めることができますが、メカニズムは不明または物議を醸している。本研究では、ウシヘルペスウイルス1（BHV-1）VP22（BVP22）またはヘルペスを持っ哺乳類発現ベクターは、ウイルス1型（HSV-1）VP22（HVP22）とウマヘルペスウイルス4型（EHV-4）TK（ETK）にした単純ETK /ガンシクロビル（ETK / GCV）GCVの細胞毒性アッセイおよびin vitroおよびin vivoで非侵襲的な生物発光イメージングによる神経芽細胞腫の自殺遺伝子治療を強化するためにBVP22とHVP22の治療の可能性を評価し、比較するために構築した。 BVP22強化されたETK / GCV細胞毒性は、in vitroおよびin vivoの両方でHVP22に比べて。しかし、親と安定にトランスフェクト細胞の混合物を利用したアッセイは、強化のみトランスフェクトした細胞で検出されたことが示された。したがって、この腫瘍システムのETK / GCV自殺遺伝子治療のBVP22とHVP22の治療の可能性は、周囲の細胞へのETKのVP22の配信によるものではなく、むしろ可能性が強化された細胞内効果によるものである。
ウシ白血病ウイルス（BLV）とBLV感染および非感染細胞におけるCMVプロモーター駆動型レポーター遺伝子発現の比較
背景：彼らは一般的に異なる組織や種の多様な細胞に強い活性を持っているので、ウイルスプロモーターは、哺乳動物発現ベクターに使用されています。方法：哺乳動物発現ベクターで使用するためにBLVのLTRプロモーター/（BLVp）のユーティリティは、CMVプロモーター（CMVP）への直接の比較を通して検討した。プロモーター活性を安定的にD17を含むBLVpまたはCMVP駆動型ルシフェラーゼベクター、FLK、BL3.1、プライマリウシB細胞を形質導入し、異なる組織や種からの細胞株のルシフェラーゼアッセイを用いて測定した。細胞はまた、BLV税発現ベクターの付加および/またはBLV感染だけでなく、トリコスタチンA（TSA）による治療を介して変更されました。結果：結果はBLVプロモーターを示し、CMVプロモーターに比べて低い基底活性を有する一方で、テストしたすべてのセル内のCMVプロモーターと同様の活性の高レベルに誘導することができる。 CMVPの活動に影響はありません税やBLV感染、特に強化されたBLVp活動。対照的に、非特異的活性化、TSAは、BLVpとCMVP活性の両方を強化しました。結論：これらのデータに基づいて、我々はBLVのプロモーターは、哺乳動物発現ベクター中の導入遺伝子の発現のために非常に有用であると結論する。
In Vitroおよびin Vivoでのウシ流産菌感染症の病原性のインテグラーゼ/リコンビナーゼXerDと官能生合成ペプチドグリカントランスグリコシラーゼ遺伝子の役割
4Hマクロファージ感染が早期に宿主 - 病原体相互作用に関与する可能性遺伝子に関する洞察を提供した後、ウシ流産菌のクローンは、以前は緑色蛍光タンパク質レポーターシステムを用いて同定した。同定された遺伝子の中で細胞分裂に関与するインテグラーゼ/リコンビナーゼ（xerD）遺伝子、およびペプチドグリカン膜合成の最終段階を触媒する単官能性合成ペプチドグリカントランスグリコシラーゼ（mtgA）遺伝子であった。ここでは、in vitroおよびin B.流産xerDとmtgAた挿入変異体のin vivoでの生存率の評価。親株、S2308と比較した場合B.流産xerD ::館とB流産mtgA ::館では、ブロス培養で有意な成長の欠陥を示さなかった。また、どちらの遺伝子は、RAW 264.7マクロファージにおけるB.流産S2308レプリケーションのために必要であった。しかし、インターフェロン調節因子1ノックアウトマウスを用いた実験的証拠は、毒性のブルセラ菌に対して高い感受性マウス株は、B.流産xerD ::館またはB流産mtgA ::館に感染したマウスは、S2308に感染したマウスよりも長く生存したことを明らかにした。 S2308と比較すると、さらに、免疫したBALB / cマウスでは、B.流産xerD ::館は、細菌の生存率の有意に低いレベルを持っていた。一緒に、これらの結果は、B.流産xerDとmtgA遺伝子がマウスの感染の最初の段階で役割を果たすことを示唆している。
ウシヘルペスウイルスVP22は、Bcl-2 Baxの発現比率をアップレギュレートすることによって神経芽細胞腫細胞のアポトーシスを誘導
ヘルペスウイルス外郭タンパク質VP22は、腫瘍の遺伝子治療におけるバイオ医薬品の可能性を有することが示されている。いくつかの研究では、VP22、人身売買しながらより多くの細胞にそれらを提供することによって、治療用タンパク質の転写効率を高めることができることを示しています。我々の以前の研究では、未知の細胞内作用によって、その牛ヘルペスウイルスVP22（BVP22）強化されたウマヘルペスウイルスチミジン（ETK-GCV）キナーゼガンシクロビル自殺遺伝子治療を示した。本研究では、BVP22とホストの腫瘍細胞間の相互作用は、神経芽細胞腫NXS2細胞で検討した。細胞周期解析はBVP22は、治療用遺伝子の細胞がより敏感になるため、細胞周期を変更することにより、バイオ医薬品の可能性を持っているかどうかを判断するために行われた。その結果、細胞周期は、NXS2細胞へBVP22のトランスフェクションの影響を受けませんでした。しかし、BVP22によって誘導される細胞毒性は、一過性トランスフェクション後、2番目と3番目の日にNXS2細胞で観察された。さらに、カスパーゼ-3活性とアポトーシスの分析はBVP22は、Bcl-2 Baxの発現率をアップレギュレートすることにより、ホストの腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが示唆された。
ブルセラ：機能ゲノミクスと宿主 - 病原体相互作用
ブルセラ症はブルセラ菌種の数によって引き起こされる人獣共通感染症であり、慢性的マクロファージの感染によって特徴付けられる。しかし、ブルセラ種の生存を細胞内に貢献するかもしれない遺伝子はよく研究されていません。このレビュープレゼント、ブルセラ菌感染と生存戦略を確立するのに役立つかもしれない様々なブルセラ菌種に存在するまたは存在しない、最初にゲノムの島々。第二に、ブルセラ菌によるマクロファージの転写の変化は、この敵対的な細胞内環境での長期生存を許可します。マクロファージの遺伝子の転写産物の多くはブルセラ菌は宿主細胞のサイレント侵略者でないことを示すブルセラ感染後に変更されます。炎症、アポトーシス、シグナル伝達と細胞内輸送小胞に関連付けられたマクロファージの転写レベルは、ブルセラ菌感染時に変更し、おそらくブルセラの生存率を細胞内にも貢献しています。最後に、生きたマウスではブルセラ感染に伴う宿主 - 病原体相互作用イベントは、バイオフォトニックイメージングを使用してリアルタイムで可視化した。マウスはしばしばブルセラ感染症を評価するために使用されていますが、ブルセラ普及と病因はあまりマウスで理解されています。ブルセラ感染症のバイオフォトニックイメージングは、弱毒化もしくは悪性のブルセラ菌によるヒト感染症や感染症の別のパターンに類似した細菌の局在部位を明らかにした。
TBK1は、in Vitro類鼻疽菌の成長の制御に役割を果たしていない
類鼻疽菌、類鼻疽の病原体は、熱帯地域における重要な細胞内の病原体である。 TANK結合キナーゼ（TBK1）、I型インターフェロン遺伝子の転写を誘導する経路の一部は、細胞内の細菌感染症の制御に重要な役割を果たすことが実証されています。類鼻疽菌から守るにTBK1の役割を調べるために我々は、HeLaおよびRAW 264.7細胞におけるTBK1遺伝子の一時的なノックダウンのためにshRNAを使用してTBK1欠損細胞株を開発しました。 TBK1欠損RAW細胞では、侵襲的および非侵襲性大腸菌の複製が大幅に野生型細胞と比較して感染後48時間で増加した。結果は野生型細胞に比べて、感染後6から48時間で> 1.5から2.0ログ高い細菌数を示しTBK1欠損HeLa細胞でブルセラmelitensisを確認した。対照的に、どちらかの典型的な（A2）、または非定型（G207）リポ多糖を発現している類鼻疽菌の成長は、TBK1欠損とコントロール細胞の間に有意差はなかった。これらの結果は、TBK1遺伝子及びその活性化は、侵襲的な大腸菌、非侵襲性大腸菌とBのmelitensis成長を制御することではなく、類鼻疽菌の感染を制御することができない場合ができるかもしれないことを示唆している。炎症性サイトカインの誘導と細菌の細胞内感染におけるTBK1遺伝子の役割は、様々な細胞内細菌のライフサイクル間のメカニズムの違いを識別するために、さらなる調査が必要である。
Toll様受容体アダプター蛋白質のTIRAPのブルセラTIRドメイン含有タンパク質ミミックのプロパティ
Toll様受容体（TLR）が微生物感染に対する自然免疫応答の活性化に重要な役割を果たしている。 TLRおよび下流のアダプター分子が保存された細胞質のTIRドメインを含む。 TIRAPは、TLRのサブセットにシグナル伝達アダプターMyD88を募集してTIRドメイン含有アダプタータンパク質である。多くの病原微生物が生存と持続性の利益のために宿主の免疫応答を抑制するためにTLRシグナル伝達経路を破壊する。ブルセラ菌は、TLR2とTLR4媒介NF-κBの活性化を阻害するTIRドメイン含有タンパク質（TcpB）をエンコードします。配列分析は、TcpBとTLRのアダプター分子TIRAP間の類似性の中等度のレベルを示した。我々はTcpBが効率的にTIRAPによって誘発されるNF-κBの活性化をブロックすることがわかった。その後の研究では、TIRAPの類推によって、TcpBは、そのN末端ドメインを介してホスホイノシチドと相互作用し、細胞膜と細胞骨格の成分と共局在することを明らかにした。我々の調査結果はTcpBは、TLRシグナル伝達を破壊するTIRAP仲介経路を標的とことを示唆している。 in vivoでのマウスの研究では、TcpB欠損ブルセラ感染の初期段階で全身の普及に欠陥があることが示された。
耳障りなブルセラMelitensis抗原はin Vivoでの同族CD8 + T細胞を収穫
ブルセラ属。世界で最も頻繁に人獣共通感染症を引き起こす細胞内細菌である。最近の仕事はブルセラワクチンの開発の分野を進めているが、全く安全なヒト用ワクチンが残っていない。安全かつ効果的なヒト用ワクチン、ブルセラ属菌に対する免疫応答を生成するために。より深く理解する必要があります。ブルセラ特異的CD8 + T細胞の誘導は、ホストの応答の重要な側面と考えられているが、CD8 + T細胞応答は、明確に定義されていません。ブルセラ特異的CD8 + T細胞によって認識され、マイクロアレイデータとそれらを相互に関連付ける抗原を含むエピトープを発見すると、感染時の運動連続性をカバーするワクチンの開発のための重要なタンパク質を決定する際に役立ちます。ブルセラmelitensis感染のBALB / cマウスモデルを活用するための開発ツールは、免疫の相関を明確にし、このモデルの有効性を改善するために役立ちます。 2つのH-2（d）はCD8 + T細胞エピトープが同定されていると、免疫原性タンパク質のグループは、CD8 + T細胞によるγインターフェロン産生を引き起こしています。生体内で特定の殺害を示したペプチド免疫後RYCINSASLとNGSSSMATV誘導同族CD8 + T細胞。重要なのは、我々はさらに、これらの不一致の遺伝子はB. melitensis感染症の病因に重要な役割を果たしていることを強調し、これらのエピトープをコードする遺伝子をディファレンシャルマクロファージの感染後に発現していることがマイクロアレイ解析によって検出された。
細胞内病原体ブルセラMelitensisからTIRドメインのタンパク質による微小管ダイナミクスの変調
TIR（Toll/interleukin-1受容体）ドメイン含有タンパク質は、真核生物の自然免疫において重要な役割を果たしています。ブルセラ菌は、病原性のために有益なニッチを確立するためにホスト自然免疫応答を破壊するためにTIRドメインタンパク質（TcpB）をコードする感染性の強い細胞内細菌である。 TcpBは、NF-κB（核因子κB）の活性化とTLR（Toll様受容体2）とTLR4によって媒介される炎症性サイトカインの分泌を阻害する。本研究では、TcpBが安定化因子として作用することにより、微小管ダイナミクスを調節することが実証されている。 TcpBは、パクリタキセルと同様に核生成率と同様に微小管形成の重合相を増加させた。 TcpB効率的に分解ノコダゾールまたは低温によって誘発される微小管を阻害する可能性があります。 TcpBによる微小管の安定化は、TIRドメインのBB-ループ領域と微小管の安定化などTcpBのTLR抑制の特性に影響を与える点変異に起因しています。
マルタ熱菌環状ジ-GMPホスホジエステラーゼBPDAは、鞭毛遺伝子の発現を制御
環境の成長、細胞内感染、細胞外普及を含む - - 病原性を促進する細菌のシグナル伝達の柔軟性を必要とマルタ熱菌は、そのライフサイクルの条件と様々な刺激に遭遇します。サイクリックジ-GMPは、環境の変化と細菌の数が病原性を変化させることへの適応に重要な役割を果たしている細菌の二次シグナル伝達分子である。 B. melitensisの環状ジ-GMPの役割を調べるために、全11は、環状ジ-GMP代謝タンパク質は別々に削除されたと病原性への影響を決定したと予測した。これらの環状ジ-GMP代謝蛋白質が病原性を変更することが判明した。三cgsB遺伝子の欠失がhypervirulentひずみを生み出しながら、BPDAとbpdB遺伝子の欠失は、細菌の病原性の減弱をもたらした。 CgsBは、環状ジ-GMP合成酵素の表現型を表示しながら、環状ジ-GMPのレベルの明らかな変化を監視するためのビブリオレポーターシステムでは、BPDAとBpdB両方は、環状ジ-GMP特異的ホスホジエステラーゼと一致して表現型を示した。さらなる分析は、BPDAの削除は鞭毛のプロモーター活性を劇的に減少して、べん毛変異体は感染症のマウスモデルでBPDAとbpdB変異株と同様の表現型を示したことが分かった。これらのデータは、環状ジ-GMP経由マルタ熱菌の鞭毛の調節のための潜在的な役割を示しています。
