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Articles by Jerome Harms in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Antígeno Específico de la En Vivo Matar ensayo utilizando CFSE células diana marcadas
1Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin-Madison, 2Pathobiological Sciences, University of Wisconsin-Madison
Muchas infecciones provocan una respuesta CTL fuerte, pero de vez en cuando, la cantidad de células de respuesta no se correlaciona con el control del patógeno
Other articles by Jerome Harms on PubMed
Inducción De Th1-tipo De Respuesta Inmune Pero No Protección Inmunidad Por Vacunación Intramuscular De ADN Con Gen De Brucella Abortus GroEL Shock Térmico
La inmunogenicidad y eficacia protectora de una vacuna de ADN el gen de shock térmico de GroEL de Brucella abortus de codificación fue probada en ratones BALB/c vacunados por inyección intramuscular (i.m.) de la aguja o pistola gene epidermally. El gen GroEL Brucella fue amplificado por PCR y clonado en dos diferentes mamíferos expresión vectores pCMV-link y pCMV-tPA. La línea celular de D17 fue transfectada con ambas construcciones y transcripciones de GroEL fueron detectadas por Northern blot. Para determinar el nivel de proteína sintetizada, lisados celulares transfected fueron sometidos luego a Western blot. La forma no segregada de la recombinante GroEL producida por la construcción de pCMV-link fue detectada en mucho mayor cantidad que la forma secretada de la proteína producida por la construcción de pCMV-tPA. Después de la inmunización, una respuesta de IgG anti-GroEL fuerte fue detectada en ratones vacunados por inyección i.m. o gene arma sólo cuando el pCMV-link / GroEL plásmido fue utilizado. En relación con el patrón de respuesta inmune inducida, inyección i.m. de la aguja levantó una predominante respuesta Th1 con sobre todo IgG2a específicos anti-GroEL y altos niveles de IFN-gamma producida por células de T esplénicas. Inmunización de pistola génica inducida por un tipo de ThO de respuesta inmune en ratones, caracterizado por una alta proporción de IgG1/IgG2a y IL-4 e interferón (IFN)-producción gamma. A pesar de que un patrón distinto de respuesta inmune se generó dependiendo de la ruta de inmunización utilizada, ni método engendró un significativo nivel de protección con la vacuna de ADN de GroEL.
Los Virus Mengo Encefalomiocarditis Y Productivamente Infect Murinos De Linfocitos T Líneas Celulares Ex Vivo, Pero No Frescas Procedentes Linfocitos T
Encefalomiocarditis virus (EMCV) y el virus Mengo son cardiovirus murinos altamente virulentas que se encuentran en cantidades abundantes en el bazo y los ganglios linfáticos después de la infección. Los linfocitos T son mediadores fundamentales de la inmunidad humoral y celular contra el desafío cardioviral, y son muy sospechosas candidatos de EMCV y la infección por el virus de Mengo. Hemos encontrado linfocitos T, como las líneas de células CTLL-2, EL-4, LY1 2/9, y LBRM33 fueron susceptibles a la infección viral productiva y exhibió citopatología después de la infección con el virus virulento EMCV-R o cepas atenuadas de virus Mengo vMC0 y vMC24. El análisis de citometría de flujo demostró acumulación progresiva intracelular de las proteínas virales, tales como la replicación dependiente de la polimerasa viral 3D, en células EL-4 durante la infección. Por el contrario, recién aislados y mitógeno estimula-CD4 + y CD8 + células T eran resistentes a la infección productiva con estos virus, no presente los efectos inducidos por virus citopáticos o la presencia intracelular de las proteínas virales. Estos datos indican que, aunque los linfocitos T-como líneas de células tumorales son altamente susceptibles a la infección viral y efectos citopáticos, primario / recién aisladas células T son resistentes a la infección por EMCV-R o virus Mengo.
Mayor Eficacia De Las Vacunas De ADN Contra Un Patógeno Bacteriano Intracelular Por Adyuvantes Genéticos
Después de 200 años de práctica, vacunología ha demostrado para ser muy eficaz en la prevención de enfermedades infecciosas. Sin embargo, varios patógenos humanos y animales existen para que las vacunas necesitan mejorarse o simplemente no han sido descubiertos. La era molecular genética ha dado un nuevo aliento para el desarrollo de una vacuna con el logro de la "tercera generación de vacunas": la vacuna de ADN. En este artículo, revisamos estrategias que han utilizado para mejorar y modulan la respuesta inmune inducida por las vacunas de ADN, utilizando como modelo el patógeno bacteriano intracelular Brucella abortus. En primer lugar, describimos diferentes enfoques utilizados para aislar y para identificar los genes que codifican posibles inmunógenos. En segundo lugar, nos informó el uso de genes de citocinas y adyuvantes genéticos que podrían mejorar la inmunogenicidad de genes diana. Y por último, hablamos de la "estrategia de la biblioteca Immunization"-(ELI) de expresión y los recientes resultados obtienen contra la infección por Brucella abortus.
Tegumento Herpesvirus Bovino VP22 Proteínas Aumenta La Timidina Quinasa / Ganciclovir Terapia Génica Suicida De Neuroblastomas En Comparación Con Los Virus Del Herpes Simple VP22
Proteína de tegumento VP22 virus del herpes puede aumentar el efecto de las proteínas terapéuticas en terapia génica, como la timidina kinasa (TK) y p53, sin embargo, el mecanismo no está claro o controversiales. En este estudio, los vectores de expresión de mamíferos que llevan el herpesvirus bovino tipo 1 (BHV-1) VP22 (BVP22) o virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) VP22 (HVP22) y el tipo de herpesvirus equino 4 (EHV-4) tk (ETK) fueron construida con el fin de evaluar y comparar las potencialidades terapéuticas de BVP22 y HVP22 para mejorar etk / ganciclovir (ETK / GCV) la terapia génica suicida de neuroblastomas por GCV ensayos de citotoxicidad y de imagen no invasiva bioluminiscente in vitro e in vivo. BVP22 mejorada etk / GCV citotoxicidad frente a que con HVP22 tanto in vitro como in vivo. Sin embargo, los ensayos que utilizan una mezcla de células transfectadas establemente parentales y se indica que la mejora sólo se detectó en células transfectadas. Así, el potencial terapéutico de BVP22 y HVP22 en etk / GCV terapia génica suicida en este sistema de tumor no es debido a VP22 entrega de etk en las células circundantes, sino más bien se debe probablemente a un efecto intracelular mejorada.
Comparación De Los Virus De La Leucemia Bovina (BLV) Y CMV Promotor Impulsado Por La Expresión Del Gen En Las Células BLV-infectados Y No Infectados-
Antecedentes: promotores virales se utilizan en vectores de expresión de mamíferos, ya que generalmente tienen una fuerte actividad en una amplia variedad de células de los tejidos y especies diferentes. Métodos: La utilidad de la LTR VLB / promotor (BLVp) para uso en vectores de expresión de mamíferos se investigó mediante la comparación directa con el promotor de CMV (CMVp). Promotor de la actividad se midió utilizando ensayos de luciferasa de líneas celulares de diferentes tejidos y especies de forma estable o transducidas con BLVp CMVP impulsadas por vectores luciferasa como D17, FLK, BL3.1 y primaria de las células B de la especie bovina. Las células también fueron modificados mediante la adición de vectores de expresión BLV impuestos y / o infección BLV, así como el tratamiento con tricostatina A. (TSA) Resultados: Los resultados indican el promotor VLB, mientras que tiene actividad basal baja en comparación con el promotor de CMV, pueden ser inducidas a altos niveles de actividad similares al promotor de CMV en todas las células de la prueba. Impuesto o infección BLV BLVp específicamente aumento de la actividad, sin efecto sobre la actividad CMVp. En contraste, el activador no específico, TSA, mejorado tanto BLVp y actividad CMVp. CONCLUSIÓN: En base a estos datos, llegamos a la conclusión del promotor BLV puede ser muy útil para la expresión del transgen en vectores de expresión de mamíferos.
El Papel De La Integrasa XerD / Recombinasa Y La Biosíntesis De Los Genes Monofuncionales Transglicosilasa Peptidoglicano En La Patogenicidad De La Infección Por Brucella Abortus in Vitro E in Vivo
Brucella abortus clones identificados previamente mediante un sistema de fluorescencia verde, reportero de la proteína después de la infección de macrófagos 4h proporcionado información sobre posibles genes implicados a principios de la interacción huésped-patógeno. Entre los genes identificados fueron una integrasa / recombinasa (xerD) gen implicado en la división celular, y la biosíntesis de peptidoglicano transglicosilasa monofuncional (MTGA) de genes que cataliza la etapa final de la síntesis de la membrana de peptidoglicano. En este caso, se evalúa la in vitro e in vivo en la supervivencia de B. abortus xerD y mutantes MTGA de inserción. B. abortus xerD :: kan y B. abortus MTGA :: kan no mostró defectos de crecimiento significativas en caldo de cultivo en comparación con la cepa parental, S2308. Además, ni los genes se requiere para la replicación de B. abortus S2308 en los macrófagos RAW 264.7. Sin embargo, la evidencia experimental que utiliza interferón reguladoras de factor 1 ratones knock-out, una cepa de ratones altamente susceptibles a la Brucella virulenta, reveló que los ratones infectados con B. abortus xerD :: kan o B. abortus MTGA :: kan sobrevivieron más tiempo que los ratones infectados con el S2308. Además, en inmunocompetentes ratones Balb / c, B. abortus xerD :: kan tenían un nivel significativamente menor de la supervivencia bacteriana en comparación con los S2308. En conjunto, estos resultados sugieren que B. abortus xerD y los genes juegan un papel MTGA durante la fase inicial de la infección en ratones.
Herpesvirus Bovino VP22 Induce Apoptosis En Células De Neuroblastoma Upregulating La Relación De Expresión De Bax a Bcl-2
Tegumento Herpesvirus VP22 proteína se ha demostrado que tiene potencial bioterapéutico en terapia génica del tumor. Algunos estudios indican que VP22 puede mejorar la eficiencia de la transferencia de proteínas terapéuticas mediante la entrega a más células, mientras que el tráfico. Nuestro estudio anterior mostró que el herpesvirus bovino VP22 (BVP22) mejorada herpesvirus equino terapia génica suicida timidina quinasa ganciclovir (ETK-GCV) por un efecto intracelular desconocido. En este estudio, la interacción entre células huésped y BVP22 tumorales se estudió en el neuroblastoma NXS2 células. Análisis del ciclo celular se realizó para determinar si posee un potencial BVP22 bioterapéutico alterando el ciclo celular, haciendo que las células más sensibles a los genes terapéuticos. Como resultado, el ciclo celular no se vio afectada por la transfección de células BVP22 en NXS2. Sin embargo, la citotoxicidad inducida por BVP22 se observó en NXS2 células en los segundo y tercer días después de la transfección transitoria. Además, los análisis de actividad caspasa-3 y la apoptosis sugiere que BVP22 induce la apoptosis en células tumorales de acogida por la regulación al alza de la proporción de expresión de Bax a Bcl-2.
Brucella: Genómica Funcional E Interacciones Huésped-patógeno
La brucelosis es una enfermedad zoonótica causada por una serie de especies de Brucella, y se caracteriza por la infección crónica de macrófagos. Sin embargo, los genes que pueden contribuir a intracelular de supervivencia de las especies de Brucella, no se han estudiado bien. Esto se presenta de revisión, en primer lugar, las islas genómicas que están presentes o ausentes en las especies de Brucella diferentes que pueden ayudar a establecer la infección de Brucella y estrategias de supervivencia. En segundo lugar, la alteración en la transcripción de los macrófagos por Brucella para permitir su supervivencia a largo plazo dentro de este ambiente hostil intracelular. Un gran número de transcripciones de genes macrófagos se alteran después de la infección de Brucella que indica que la Brucella no es un invasor silencioso de las células huésped. Los niveles de transcripción de macrófagos asociados con la inflamación, la apoptosis, la transducción de señales y el tráfico intracelular vesicular se alteran durante la infección por Brucella, y probablemente contribuyen a la supervivencia intracelular de Brucella. Por último, los eventos de interacción huésped-patógeno asociados con la infección por Brucella en ratones vivos visualizar en tiempo real usando imágenes de biofotónica. Los ratones que se utilizan a menudo para evaluar las infecciones por Brucella, sin embargo, la difusión y la patogénesis de Brucella es poco conocido en los ratones. Imágenes de las infecciones por Brucella Biofotonico reveló los sitios de localización de bacterias similares a las infecciones humanas y pautas diferentes de la infección por Brucella atenuado o virulento.
TBK1 No Juega Un Papel En El Control Del Crecimiento in Vitro Burkholderia Pseudomallei
Burkholderia pseudomallei, el agente causal de la melioidosis, es un importante patógeno intracelular en las regiones tropicales. TANQUE vinculante quinasa (TBK1), parte de la vía que induce la transcripción de los genes de interferón de tipo I, se ha demostrado que juegan un papel importante en el control de infecciones bacterianas intracelulares. Para investigar el papel de TBK1 en la protección contra B. pseudomallei hemos desarrollado TBK1 deficientes líneas celulares mediante el uso de shRNA de caída transitoria del gen TBK1 en HeLa y células RAW 264.7. En TBK1 las células deficientes en RAW, la replicación de Escherichia coli invasiva y no invasiva, fue significativamente superior a las 48 h después de la infección en comparación con células de tipo salvaje. El resultado fue confirmado con Brucella melitensis en TBK1 con deficiencia de células HeLa, lo que demuestra un recuento> 1.5-2.0 registro más alto de bacterias en el 6-48 h después de la infección en comparación con células de tipo salvaje. Por el contrario, el crecimiento de Burkholderia pseudomallei que manifieste su típica (A2) o atípicos (G207) lipopolisacárido no fue significativamente diferente entre las células deficientes en TBK1 y control. Estos resultados sugieren que el gen TBK1 y su activación puede ser capaz de controlar invasivos E. coli, no invasivas de E. coli y el crecimiento de B. melitensis pero puede no ser capaz de controlar la infección por B. pseudomallei. El papel del gen TBK1 en la inducción de citoquinas proinflamatorias y la infección bacteriana intracelular necesita más investigación para identificar las diferencias mecánicas entre los diferentes ciclos de vida de las bacterias intracelulares.
Evaluación De Los Recombinantes Invasivo Y No Patógenas De E. Coli Como Vector Vacuna Contra El Patógeno Intracelular, Brucella
RESUMEN:
Brucella TIR De Dominio Que Contienen Imita Propiedades De Las Proteínas De La TIRAP Proteína Toll-like Receptor Adaptador
Los receptores tipo Toll (TLR) juegan un papel esencial en la activación de la respuesta inmune innata contra las infecciones microbianas. TLRs y las moléculas de aguas abajo del adaptador contiene un dominio conservado TIR citoplasmática. TIRAP es una TIR de dominio que contienen proteína adaptadora que recluta el adaptador de señalización MyD88 a un subconjunto de los TLR. Muchos microorganismos patógenos subvertir las vías de señalización TLR para suprimir las respuestas inmunes del huésped en beneficio de su supervivencia y persistencia. Brucella codifica una TIR de dominio que contienen proteínas (TCPB) que inhibe la TLR2 y TLR4 mediada por la activación de NF-kappaB. El análisis de secuencia indica un nivel moderado de similitud entre TCPB y el adaptador de TLR TIRAP molécula. Se encontró que TCPB eficiente podría bloquear TIRAP inducida por la activación de NF-kappaB. Estudios posteriores revelaron que por analogía a TIRAP, TCPB interactúa con fosfoinosítidos a través de su dominio N-terminal y la co-localiza con la membrana plasmática y los componentes del citoesqueleto. Nuestros hallazgos sugieren que la vía se dirige TCPB TIRAP mediada por subvertir la señalización TLR. En estudios con ratones in vivo indican que TCPB deficiencia de Brucella es defectuoso en la diseminación sistémica en las primeras etapas de la infección.
Discordantes Antígenos De Brucella Melitensis Rendimiento Cognado Células T CD8 + En Vivo
Brucella spp. son bacterias intracelulares que causan la zoonosis más frecuente en el mundo. A pesar de los trabajos recientes ha avanzado en el campo de desarrollo de la vacuna Brucella, no queda ninguna vacuna segura. Con el fin de producir una vacuna humana segura y efectiva, la respuesta inmune a la Brucella spp. requiere una mayor comprensión. La inducción de la Brucella específicos de linfocitos T CD8 + se considera un aspecto importante de la respuesta del huésped, sin embargo, los CD8 + respuesta de células T no está claramente definido. Descubriendo el epitopo que contiene antígenos reconocidos por Brucella específica linfocitos T CD8 + y su correlación con los datos de microarrays ayudará en la determinación de proteínas críticas para el desarrollo de vacunas que cubren un continuo cinética durante la infección. Desarrollo de herramientas para aprovechar el modelo de ratón BALB / c de la infección por Brucella melitensis, ayudarán a clarificar los correlatos de inmunidad y mejorar la eficacia de este modelo. Dos H-2 (d) CD8 + epítopos de células T se han caracterizado, y un grupo de proteínas inmunogénicas han provocado la producción de interferón gamma por los linfocitos T CD8 +. RYCINSASL y NGSSSMATV afines CD8 + inducida por las células T después de la inmunización péptido que mostraba destrucción específica in vivo. Es importante destacar que hemos encontrado por análisis de microarrays que los genes que codifican estos epítopes son expresados diferencialmente después de la infección de macrófagos, además haciendo hincapié en que estos genes discordantes pueden jugar un papel importante en la patogénesis de la infección por B. melitensis.
La Modulación De La Dinámica De Los Microtúbulos Por Una Proteína De Dominio TIR De La Brucella Melitensis Patógeno Intracelular
TIR (Toll/interleukin-1 receptor) que contienen el dominio proteínas juegan un papel crucial en la inmunidad innata en los eucariotas. Brucella es una bacteria intracelular muy contagioso, que codifica una proteína de dominio TIR (TCPB) para subvertir acogida respuestas inmunes innatas para establecer un nicho beneficiosa para la patogénesis. TCPB inhibe NF-kB (factor nuclear kB) la activación y pro-inflamatorias mediadas por citoquinas secreciones TLR (Toll-like receptor) 2 y TLR4. En el presente estudio, hemos demostrado que TCPB modula la dinámica de microtúbulos al actuar como un factor de estabilización. TCPB incrementó la tasa de nucleación, así como las fases de polimerización de la formación de microtúbulos de una manera similar a paclitaxel. TCPB eficiente podría inhibir microtúbulos nocodazole o en frío inducida por el desmontaje. Estabilización de los microtúbulos por TCPB se atribuye a la región BB-bucle del dominio TIR, y una mutación puntual afectó a la estabilización de los microtúbulos, así como las propiedades de supresión de TLR de TCPB.
Brucella Melitensis Di-GMP Cíclico Fosfodiesterasa BpdA Controla La Expresión De Los Genes Flagelares
Brucella melitensis encuentra una variedad de condiciones y estímulos durante su ciclo de vida - incluyendo el crecimiento del medio ambiente, la infección intracelular, y la difusión extracelular - que requiere flexibilidad de señalización bacterianas para promover la virulencia. Cíclico-di-GMP es una molécula de señalización bacteriana secundaria que juega un papel importante en la adaptación a los cambios ambientales y la alteración de la virulencia en un número de bacterias. Para investigar el papel de la cíclica-di-GMP en la B. melitensis, los 11 predijo cíclica-di-GMP-metabolización de las proteínas fueron eliminadas por separado y el efecto de la virulencia se determinó. Tres de estas proteínas cíclico-di-GMP-metabolizadoras se encontraron para alterar la virulencia. Supresión de la bpdA y los genes BPDB resultó en la atenuación de la virulencia de la bacteria, mientras que la deleción del gen CGSB producido una cepa hipervirulenta. En un sistema reportero Vibrio para controlar la alteración aparente de los niveles de cíclico-di-GMP, tanto BpdA y BPDB muestra un fenotipo consistente con cíclico-di-GMP-específicos fosfodiesterasas, mientras CGSB muestra un fenotipo sintasa cíclico-di-GMP. Un análisis más detallado encontrado que la supresión de bpdA como resultado una disminución dramática en las actividades promotoras flagelares, y un mutante flagelar mostraron fenotipos similares a la bpdA y cepas mutantes BPDB en modelos de ratón de infección. Estos datos indican un papel potencial para la regulación de los flagelos de Brucella melitensis a través de cíclico-di-GMP.
