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Articles by Jessica C. Kwok in JoVE
JoVE General
Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi
Cambridge Centre for Brain Repair, Department of Clinical Neurosciences, University of Cambridge
Questo articolo si propone di descrivere in modo graduale comunemente usato
Other articles by Jessica C. Kwok on PubMed
Chondroitinase ABC Ha Un Effetto Duraturo Sul Contenuto Di Condroitina Solfato Glicosaminoglicano Nel Cervello Del Ratto Feriti
Condroitina proteoglicani dei solfato (CSPG) sono assone crescita inibitorio molecole presenti nella cicatrice gliale che svolgono un ruolo nel fallimento rigenerazione dopo danni al sistema nervoso centrale e che limitino la plasticità di CNS. Rimozione delle catene di condroitina solfato glicosaminoglicano (GAG) con chondroitinase-ABC (chABC) in modelli di lesioni CNS promuove la rigenerazione di assoni e la plasticità. Noi abbiamo analizzato gli effetti immediati e a lungo termine di una singola iniezione di chABC CSPG, gag e rigenerazione di assoni. Abbiamo fatto le lesioni unilaterali Sonografia in ratti adulti, accompagnati da un'infusione di chABC o di un enzima di controllo derivato batterico (penicillinasi) adiacente. Entro 24 h di trattamento chABC c'era la digestione di gag, tra cui acido ialuronico e una riduzione in neurocan in un'area che si estende 1,5 mm attorno al sito di iniezione. Circa il 50% delle GAG è inaccessibile alla digestione chABC, anche in tessuto digerito in vitro, che probabilmente rappresenta depositi intracellulari. Negli animali di controllo penicillinasi trattati, gag totale recuperato dal cervello elettivamente erano up-regolato da 4 volte 7 giorni dopo l'infortunio e gradualmente diminuito a normale al post-lesion di 28 giorni. Negli animali trattati con chondroitinase, il totale GAG è rimasto a basso livello per tutto il periodo sperimentale di 28 giorni. Questo suggerisce la persistenza di chABC attivo per almeno 10 giorni dopo l'iniezione che è in grado di digerire CSPG rilasciato dalle cellule durante questo tempo. Ciò è stato confermato dalla rilevazione immunologica dell'enzima per 10 giorni e di recupero dell'enzima attivo dal cervello a 10 giorni dopo l'iniezione. I nostri risultati suggeriscono che una singola iniezione di chABC è in grado di produrre un ambiente favorevole alla riparazione di CNS per oltre 10 giorni.
Distribuzione E La Sintesi Dei Proteoglicani Della Matrice Extracellulare, Acido Ialuronico, Proteine Di Collegamento E Tenascina-R Del Midollo Spinale Di Topo
Reti perineuronale (PNNs) sono strutture densa matrice extracellulare (ECM) che si formano intorno a molti corpi cellulari neuronali e dendriti ritardo nello sviluppo. Contengono diversi condroitina proteoglicani dei solfato (CSPG), acido ialuronico, proteine di collegamento e tenascina-R. Loro tempo di aspetto correla con la fine del periodo critico per la plasticità, ed essi sono stati implicati in questo processo. La distribuzione di PNNs nel midollo spinale è stata esaminata usando lectina di Wisteria floribunda agglutinina e colorazione per gli stub di condroitina solfato dopo digestione chondroitinase. Doppia etichettatura con il marker neuronale, NeuN, ha mostrato che PNNs erano presenti circostante circa il 30% dei motoneuroni nel corno ventrale, 50% di grande interneurons nel grigio intermedio e il 20% dei neuroni del corno dorsale. Questi PNNs formata nella seconda settimana di sviluppo postnatale. Colorazione immunoistochimica ha dimostrato che la PNNs contengono una miscela di CSPG, acido ialuronico, proteine di collegamento e tenascina-R. Di CSPG, aggrecan era presente in tutti i PNNs mentre erano presenti in alcuni ma non tutti PNNs neurocan, versicano e phosphacan/RPTPbeta. Ibridazione in situ ha mostrato che aggrecan e cartilagine link proteina (CRTL) e cervello link protein-2 (2 BRAL) sono prodotte dai neuroni. PNN-cuscinetto neuroni express synthase hyaluronan e questo enzima e phosphacan/RPTPbeta possono allegare PNNs alla superficie delle cellule. Durante lo sviluppo postnatale dell'espressione della proteina di collegamento e aggrecan mRNA è up-regolato al momento della formazione PNN, e queste molecole possono quindi innescare la loro formazione.
Proteoglicani Nel Sistema Nervoso Centrale: Plasticità, La Rigenerazione E La Loro Stimolazione Con Chondroitinase ABC
Dopo l'infortunio di mammifero sistema nervoso centrale (CNS), i neuroni non sono in grado di rigenerare i loro assoni e recupero è limitato dalla limitata plasticità. Rigenerazione di assoni è inibita dalla presenza delle molecole inibitorie vari, tra cui proteoglicani Condroitin solfato (CSPG) che sono sovraregolati intorno al sito di lesione. Dopo la fine dei periodi critici è limitata dai cambiamenti della matrice extracellulare, soprattutto la formazione di reti perineuronale CSPG contenenti plasticità. Rimozione enzimatica delle catene di Condroitin solfato (CS) con chondroitinase ABC promuove la rigenerazione di assoni e riattiva la plasticità. Questa recensione nei dettagli le strutture e le proprietà del CSPG differenti nel SNC normale e danneggiato, l'uso dell'enzima chondroitinase ABC per promuovere la rigenerazione neurale e la plasticità e vengono descritti i meccanismi di azione e terapeutici possibili utilizzi di questo enzima.
Migrazione Delle Cellule Di Schwann è Integrina-dipendente E Inibito Da Aggrecan Astrocita-prodotto
Trapianto di cellule di Schwann ha promessa considerevole nei traumi del midollo spinale per colmare il sito della ferita e per remyelination in condizioni demielinizzante. Essi sostengono la rigenerazione assonale e germinazione secernenti fattori di crescita e fornendo una superficie permissiva e molecole di matrice mentre schermatura assoni dall'ambiente inibitorio del sistema nervoso centrale. Tuttavia, trapianto seguente visualizza le cellule di Schwann limitate capacità migratorie e sono incapaci di si intrecciano con gli astrociti host. Questo a sua volta porta alla formazione di un confine netto e una brusca transizione tra l'innesto della cellula di Schwann e l'astrociti tessuto ospite, quindi prevenire assoni rigeneranti da uscire l'innesto. L'obiettivo di questo studio era di identificare gli elementi di inibitori su astrociti coinvolti nel limitare la migrazione delle cellule di Schwann. Mediante saggi in vitro della migrazione cellulare, mostriamo che aggrecan prodotto da astrociti è coinvolto nell'inibizione della cellula di Schwann motilità su monostrati astrocitari. Atterramento di questo proteoglicano negli astrociti mediante RNAi o digestione delle catene glycosaminglycan su aggrecan migliora la migrazione delle cellule di Schwann. Mostriamo ulteriormente aggrecan da intermediario il suo effetto di alterazione della funzione dell'integrina nelle cellule di Schwann, e che gli effetti inibitori di aggrecan possono superare mediante l'attivazione della cellula di Schwann integrine.
Integrina Attivazione O Alfa 9 Espressione Permette Di Adesione Di Cellule Epiteliali Pigmentate Della Retina Sulla Membrana Di Bruch in Bagnato Degenerazione Maculare Legata All'età
Malfunzionamento delle cellule epiteliali del pigmento retinico è una caratteristica causa della degenerazione maculare legata all'età, e il trapianto di nuove cellule epiteliali pigmentato retinico è una strategia interessante per impedire ulteriore progressione e perdita visiva. Tuttavia, trapianti hanno mostrato efficacia limitata, soprattutto perché cellule trapiantate non riescono ad aderire e la migrazione sulla membrana di Bruch patologico. Adesione alla membrana di Bruch è integrina-mediata. Invecchiamento della membrana di Bruch conduce ad un declino dell'integrina ligandi e, aggiunto a questo, bagnato degenerazione macular relativa all'età conduce alla sovraregolazione di antiadesivo molecole come la tenascina-C. Abbiamo quindi studiato se manipolazione della funzione integrina nelle cellule epiteliali del pigmento retinico può ripristinare la loro adesione e migrazione sulla membrana bagnato età-correlate maculare degenerazione danneggiato di Bruch. Utilizzando spontaneamente immortalata nelle cellule epiteliali umane pigmento retinico (epitelio pigmentato retinico adulto-19), mostriamo che adesione e migrazione su componenti della membrana di Bruch è integrina-dipendente e rafforzata dagli agenti dell'integrina-attivazione manganese e TS2/16. Questi permise alle cellule di aderire e migrare su basse concentrazioni di ligando, come sarebbe trovato nella membrana di Bruch invecchiato. Abbiamo quindi sviluppato un metodo per stripping cellule dalla membrana di Bruch che dosaggi di adesione e la migrazione possono essere eseguite sulla sua superficie. Attivazione dell'integrina aveva un moderato effetto sul miglioramento della retina cellule epiteliali pigmentate adesione e migrazione su umani normali e membrana di Bruch ratto. Tuttavia, sulla membrana di Bruch preparato da bagnato età-correlate maculari degenerazione colpite occhi umani, adesione era più bassa e integrina attivazione ha avuto un effetto molto maggiore. Una molecola di candidato per prevenire retinico pigmentato membrana di Bruch epiteliali interazione con età-correlate maculare degenerazione colpita è tenascina-C che confermiamo è presente ad alti livelli nella membrana umida di degenerazione maculare legata all'età. Mostriamo che la tenascina-C è antiadesivo per cellule epiteliali pigmentate della retina, ma dopo l'attivazione dell'integrina, possono aderire e migrare su di esso utilizzando alphaVbeta3 integrin. In alternativa, troviamo che trasduzione della retina cellule epiteliali pigmentate con Alpha9 nel integrina, un'integrina tenascina-C-associazione, ha portato a un forte aumento della alpha9beta1-mediata adesione e migrazione su tenascina-C. Entrambi espressione dell'integrina Alpha9 nel e attivazione di integrina notevolmente migliorato la capacità delle cellule epiteliali del pigmento retinico di aderire alle membrane tenascina-rich bagnato età-correlate maculare colpite dalla degenerazione di Bruch. I nostri risultati suggeriscono che la manipolazione delle integrine cellula epiteliale pigmentato retinico attraverso integrina attivando strategie, o espressione di integrine nuove come Alpha9 nel, potrebbe essere efficace nel migliorare l'efficacia del trapianto di cellule epiteliali pigmentato retinico in bagnato età-correlate maculari degenerazione colpite occhi.
Astrocita-prodotto Ephrins Inibire La Migrazione Delle Cellule Di Schwann Via VAV2 Segnalazione
Le cellule di Schwann sono un candidato promettente per colmare le lesioni del midollo spinale e remyelinating assoni. Tuttavia, innestate le cellule di Schwann mostrano poco mescolanza con gli astrociti host e quindi limitata migrazione da siti di trapianto. Questo porta alla formazione di un confine netto tra gli astrociti host e le cellule di Schwann, che si traduce in assoni stallo all'interfaccia protesi-host e non riuscendo a uscire l'innesto. Abbiamo studiato la possibilità che interazioni EF/efrina sono coinvolti nella segregazione delle cellule di Schwann e astrociti e nel limitare la migrazione delle cellule di Schwann. Tramite trascrizione inversa-PCR, noi abbiamo caratterizzato l'efrina e profilo EF in colture le cellule di Schwann e astrociti, mostrando che gli astrociti producono tutti i ephrinAs e le cellule di Schwann producono i recettori EphA2, EphA4 ed EphA7. Diversi ephrinAs inibire la migrazione delle cellule di Schwann su laminina, con ephrinA5 essere il più efficace. Bloccando i recettori EphA con EphA4-Fc in eccesso aumenta la migrazione delle cellule di Schwann su astrociti e migliora la mescolanza di Schwann-astrociti. Ci mostra che l'azione del ephrinA5 su cellule di Schwann è mediata tramite VAV2. Entrambi in cluster ephrinA5 e contatto Astrocita aumenta la fosforilazione di VAV2 in cellule di Schwann. Atterramento di VAV2 abroga l'effetto inibitorio di cluster ephrinA5 su migrazione e aumenta la capacità delle cellule di Schwann di migrare su astrociti. Inoltre, abbiamo trovato un ruolo per ephrinA5 in cellula di Schwann inibendo integrina di segnalazione e la funzione. In generale, suggeriamo che le interazioni EF/efrina inibiscono la migrazione delle cellule di Schwann e mescolanza con gli astrociti via VAV che interessano integrina funzione di segnalazione.
Mancano Link Proteine Animali Hanno Attenuato Le Reti Perineuronale E Plasticità Persistente
Condroitina proteoglicani dei solfato della matrice extracellulare limitano la plasticità del sistema nervoso centrale adulto e loro digestione con chondroitinase riattiva la plasticità. Tuttavia le strutture nella matrice extracellulare che limitano la plasticità sono sconosciute. Ci sono molti cambiamenti nella matrice extracellulare come periodi critici per plasticità nelle vicinanze, compresi i cambiamenti nei livelli di proteine di nucleo di proteoglycan di solfato di condroitina, cambia in glicosaminoglicano solfatazione e l'aspetto del solfato di condroitina denso contenente proteoglycan perineuronale reti intorno molti neuroni. Mostriamo che formazione di reti perineuronale è innescato da neuronale produzione di cartilagine link proteina Crtl1 (Hapln1), che è up-regolato nella corteccia visiva come forma di reti perineuronale durante lo sviluppo e dopo allevamento scuro. Topi privi di Crtl1 hanno attenuato le reti perineuronali, ma i livelli complessivi di condroitina solfato dei proteoglicani e il loro modello di solfatazione glycan restano invariati. Crtl1 animali knockout mantengono livelli giovanili della plasticità di dominanza oculare e loro acuità visiva rimane sensibile alla deprivazione visiva. Nel percorso sensoriale, assoni in knockout germogliare gli animali ma non i controlli nel partito denervato nucleo cuneate. L'organizzazione del Condroitin solfato proteoglycan in reti perineuronale è quindi l'evento chiave nel controllo della plasticità del sistema nervoso centrale di matrice extracellulare.
In Vitro Di Modellazione Di Reti Perineuronale: Hyaluronan Sintasi E Collegamento Della Proteina Sono Necessarie Per La Loro Formazione E Integrità
Abbiamo precedentemente dimostrato che tutte le reti perineuronale (PNNs) recanti i neuroni esprimono una sintasi acido ialuronico (ha), una proteina di collegamento (solitamente cartilagine link proteina-1; Crtl1) e un proteoglicano Condroitin solfato (solitamente aggrecan). Animale privo di Crtl1 le mancanze di CNS normale PNNs. PNNs sono implicati nel controllo della plasticità neuronale, e interventi di modulare formazione PNN sarà utili per la manipolazione di plasticità. Abbiamo sviluppato un modello in vitro che dimostra come i componenti strutturali di PNNs innescano la loro formazione, utilizzando cellule renali embrionali umane, che normalmente non producono una matrice pericellulari. Espressione di HAS3 conduce alla produzione di una matrice diffusa. Esso è stato convertito in una struttura compatta PNN-come quando le cellule espresse anche Crtl1 e aggrecan. Questa matrice è stata macchiata da floribunda glicine, contenuti Crtl1 e aggrecan e come PNNs, poteva solo essere solubilizzata in 6 M urea. In assenza di acido ialuronico prodotto da HAS3, aggrecan e Crtl1 dissipata nel mezzo, ma quando erano transfected le cellule a produrre una matrice di acido ialuronico, Crtl1 e aggrecan sono stati incorporati in esso. Cellule manca uno qualsiasi di queste molecole hanno mostrato compromessa l'integrità delle cellule PNNs. esprimendo HAS3 e Crtl1 sono stati in grado di incorporare aggrecan esogeni nella loro matrice pericellulari.
Rilascio Controllato Di Chondroitinase ABC Dal Gel Di Fibrina Riduce Il Livello Delle Catene Glicosaminoglicano Inibitorio Elettivamente Del Midollo Spinale
Chondroitinase ABC (ChABC) è un enzima batterico che può migliorare la plasticità dopo lesione al sistema nervoso centrale (SNC) degradando le catene laterali di glicosaminoglicano (GAG) di proteoglicani. Lesioni del CNS trattate con ChABC spesso Visualizza enhanced assonale che spuntano e migliorato il recupero funzionale e non c'è quindi molto interessano il potenziale uso di ChABC come un trattamento clinico in esseri umani. Quando gel di fibrina altamente concentrata che contiene ChABC è stato impiantato adiacente a una lesione del midollo spinale, ChABC bioattivi era rilevabile nel midollo spinale per almeno tre settimane. Quasi sei volte più ChABC bioactive è stato rilevato nel midollo spinale 3 settimane dopo la ferita quando è stato utilizzato il sistema di consegna di fibrina vs iniezione intraspinale di ChABC (61 + /-30 mU vs 11 + /-4 mU). Inoltre, 3 settimane dopo l'infortunio il livello inibitorio gag trovato nella ferita del midollo spinale trattato con il sistema di consegna era 37% inferiore al livello di GAG nel midollo spinale trattato con un'iniezione di ChABC. Quando si utilizza il sistema di consegna, 24,4% della dose iniziale ChABC potrebbe ancora essere rilevato nella lesione dopo 3 settimane, rispetto ad appena 4,4% quando si utilizza un'iniezione intraspinale di ChABC.
Integrina Attivazione Promuove La Crescita Axon Su Inibitorio Chondroitin Sulfate Proteoglycans Potenziando La Segnalazione Dell'integrina
Proteoglicani Condroitin solfato (CSPG) sono sovraregolati dopo lesioni del CNS, dove inibiscono la rigenerazione di assoni. In ordine per axon crescita e rigenerazione a verificarsi, recettori di superficie integrina devono interagire con circostanti molecole della matrice extracellulare. Abbiamo esplorato l'ipotesi che CSPG inibire la rigenerazione inattivando le integrine e che costringe le integrine in uno stato attivo potrebbe superare questa inibizione. Usando i neuroni sensoriali ratto colta, mostriamo che la aggrecan CSPG inibisce la crescita di assone laminina-mediata da compromettere integrina segnalazione via diminuendo fosforilata FAK (pFAK) e livelli di pSrc, senza intaccare la superficie dell'integrina livelli. Costringendo integrina attivazione e segnalazione di manganese o un anticorpo attivazione TS2/16 invertito l'effetto inibitorio di aggrecan sulle superfici di aggrecan/laminina miste e rafforzata assone crescita da neuroni sensoriali di ratto coltivate (manganese) e umane embrionali staminali cellule derivate motoneuroni (TS2/16). L'effetto inibitorio di Nogo-A può essere invertito anche tramite l'attivazione dell'integrina. Questi risultati suggeriscono che l'inibizione da CSPG può agire tramite inattivazione delle integrine, e tale attivazione delle integrine è un metodo potenziale per migliorare la rigenerazione di assoni dopo l'infortunio.
Chondroitini 6-solfatiche Hanno Un Influsso Positivo Sulla Rigenerazione Assonale
Condroitina solfato dei proteoglicani (CSPG) sovraregolati nella cicatrice glia inibire la rigenerazione di assoni tramite loro Solfatati glicosaminoglicani (gag). Condroitina 6-sulphotransferase-1 (C6ST-1) è sovraregolati dopo l'infortunio che porta ad un aumento di 6-solfatate GAG. In questo studio, chiediamo se questo aumento di 6-solfatate GAG è responsabile per l'inibizione maggiore all'interno della cicatrice gliale, o se rappresenta un parziale ritorno allo stato embrionale permissivo dominato da 6-Solfatati glicosaminoglicani (gag). Utilizzando C6ST-1 topi knockout (KO), abbiamo studiato i cambiamenti post-infortunio di condroitina sulphotransferase (CSST) espressione e l'effetto di condroitina 6-solfati sul entrambi rigenerazione dell'assone centrale e periferico. Dopo l'infortunio di CNS, animali wild-type (WT) hanno mostrato un aumento di mRNA per C6ST-1 e C6ST-2 C4ST-1, ma KO fatto non potenziamento qualsiasi CSSTs. Dopo l'infortunio PNS, mentre sovraregolati WT C6ST-1, KO ha mostrato una sovraregolazione di C6ST-2. Abbiamo esaminato la rigenerazione degli assoni Sonografia, che dimostrano la rigenerazione mite assone spontaneo il WT KO ha mostrato molti meno rigenerante assoni e retrazione assonale più di WT. Tuttavia, nel PNS, riparazione dei nervi ulnari e mediano ha portato a livelli normali e simili di rigenerazione di assoni in WT e KO. Test funzionali su plasticità dopo la riparazione ha anche non mostrato alcuna prova di una maggiore plasticità del KO. I nostri risultati suggeriscono che la sovraregolazione di GAG 6-solfatata dopo lesione rende più permissivi per la rigenerazione di assoni la matrice extracellulare, e che l'equilibrio di diversi CSs nel microambiente intorno al sito di lesione è un fattore importante nel determinare l'esito di lesioni del sistema nervoso.
Vettori Lentivirali Express Chondroitinase ABC in Proiezioni Corticali E Promuovere La Germinazione Degli Assoni Corticospinale Feriti
Diverse malattie e lesioni del sistema nervoso centrale potrebbero potenzialmente essere trattate dalla consegna di un enzima, che potrebbe essere raggiunto in modo più efficace di terapia genica. In particolare, l'enzima batterico chondroitinase ABC è benefico in modelli animali di ferita del midollo spinale. Abbiamo adattato il gene chondroitinase modo che può dirigere secrezione di chondroitinase attivo dalle cellule di mammiferi e inserito vettori lentivirali. Quando iniettato nel cervello di ratto adulto, questi vettori portano alla secrezione ricca di chondroitinase, localmente e da proiezioni assone a distanza, con attività di persistenza per più di 4 settimane. Negli animali che hanno ricevuto una lesione simultanea del tratto corticospinale, il vettore ridotto assonale die-back e promosso a corto raggio e germogliatura rigenerazione degli assoni corticospinale. Gli stessi effetti benefici su assoni corticospinale danneggiate sono stati osservati in animali che hanno ricevuto il vettore lentivirale chondroitinase direttamente nelle vicinanze di una lesione del midollo spinale.
Ripristino Le Reti Di Matrice E Perineuronale Extracellulare Nel Sistema Nervoso Centrale
Un perineuronale netto (PNN) è uno strato di lattice-come matrice che avvolge la superficie dei dendriti e soma e in alcuni casi i segmenti iniziali di assone, in sottopopolazioni di neuroni nel sistema nervoso centrale (SNC). In primo luogo segnalato da Camillo Golgi più di un secolo fa, la struttura molecolare e il ruolo potenziale di questa matrice sono stati solo svelati negli ultimi decenni. PNNs sono composti principalmente da acido ialuronico, proteoglicani Condroitin solfato, proteine di collegamento e tenascina R. Le interazioni tra queste molecole permettono la formazione di una stabile pericellulari complessi circostante sinapsi sulla superficie del neurone. PNNs appaiono nel tardo oblique di sviluppo con la chiusura dei periodi critici per la plasticità. Essi svolgono un ruolo diretto nel controllo della plasticità CNS, e la loro rimozione è un modo in cui la plasticità può essere riattivata nel SNC adulto. In questa recensione, esaminiamo le componenti molecolari e formazione di PNNs, loro ruolo nella maturazione e plasticità sinaptica dopo l'infortunio di CNS e i possibili meccanismi di azione PNN.
