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Articles by Joanna B. Goldberg in JoVE
JoVE Immunology and Infection
La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción
Department of Microbiology, Immunology, & Cancer Biology, University of Virginia Health System
Se describe una modificación acuosa caliente-fenol método de extracción para la purificación de lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram-negativas. Una vez extraído, el LPS puede ser seguidamente analizadas por SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción directa o inmunotransferencia Western.
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Construcción Y Caracterización De Un Mutante De La Canceladura De AroA Viva, Atenuada De Pseudomonas Aeruginosa Como Una Vacuna Intranasal De Candidato
Anticuerpos contra el antígeno lipopolisacárido O de Pseudomonas aeruginosa mediar inmunidad de alto nivel, pero epítopes protectores han demostrado para ser poco inmunogénica, mientras que nonprotective o mínimamente protectoras O antígeno epitopos provocan a menudo la mejor respuesta inmune. Con el objetivo de desarrollar una vacuna ampliamente protectora p. aeruginosa, utilizamos un sistema de reemplazo de gene basado en la Recombinasa Flp para construir a un mutante de la canceladura de aroA sin marcar del p. aeruginosa serogrupo O2/O5 cepa PAO1. Los mutantes de deleción aroA resultante de PAO1 se señalan aroA PAO1 Delta. La supresión de aroA fue confirmada por PCR y fracaso del mutante para crecer en medios mínimos que carecen de aminoácidos aromáticos. Cuando se evaluó para la seguridad y la inmunogenicidad en ratones, Delta PAO1 aroA podría ser aplicado vía intranasal o por vía intraperitoneal en dosis 10 (9 hasta 5 x) UFC por ratón sin efectos adversos. No difusión de aroA PAO1 Delta a sangre, hígado o bazo fue detectado después de la aplicación intranasal, y evidencia histológica de neumonía era mínima. Intranasal inmunización de ratones y conejos sacados altos títulos de células enteras bacterianas y antígenos bacterianos estables al calor de las siete p. aeruginosa un serogrupo O2/O5 cepas la inmunoglobulina G. Los antisueros de ratón mediada por asesinato fagocítica potente de la mayoría de las cepas de O2/O5 serogrupo hospedante, mientras que los antisueros de conejo mediada por asesinato fagocítica de varias cepas heterólogas-serogrupo además de matar a todas las cepas de O2/O5. Esta vivo, atenuado cepa de p. aeruginosa PAO1 Delta aroA parece ser seguro para su uso potencial como una vacuna intranasal y provoca altos títulos de anticuerpos opsonizante contra múltiples cepas de la p. aeruginosa serogrupo O2/O5.
Protección Contra Fatal Neumonía De Pseudomonas Aeruginosa En Ratones Después De La Inmunización Nasal Con Un Mutante De La Canceladura De AroA Viva, Atenuada
Estudios de inmunidad frente a Pseudomonas aeruginosa han indicado que una variedad de posibles inmunógenos puede obtener protección en modelos animales, utilizando ambos efectores inmune mediada por anticuerpos y células de protección. Para tratar de optimizar la entrega de múltiples antígenos protectores y provocar una amplia gama de efectores inmunes, produjimos a un mutante de la canceladura de aroA del serogrupo de p. aeruginosa cepa de O2/O5 PAO1, señalada PAO1deltaaroA. Previamente, informó que esta cepa produce altos niveles de opsonizante anticuerpo dirigido contra muchas cepas de serogrupo O2/O5 después nasal inmunización de ratones y conejos. Aquí, se evaluó la eficacia protectora de la inmunización con PAO1deltaaroA contra neumonía fatal aguda en ratones. Después de la inmunización activa, se lograron altos niveles de protección contra una variante citotóxica ExoU-expresión de la cepa parental PAO1 en dosis hasta IDENTIFICACION mayores que la dosis letal de 50%. Protección significativa contra PAO1 y dos de cuatro otras cepas de serogrupo O2/O5 también fue encontrada, pero no había ninguna protección contra las cepas del serogrupo-heterólogas. Las serogrupo O2/O5 cepas no protegidas contra fueron asesinadas en opsonofagocítico ensayos tan eficientemente como las cepas con que fue visto protección, lo que indica una falta de correlación de protección y matanza opsonizante dentro el serogrupo. En experimentos de inmunización pasiva con desafío salvaje-tipo PAO1 u otros miembros fotoefecto del serogrupo O2/O5, no hubo ninguna protección a pesar de la presencia de altos niveles de opsonizante anticuerpos en el suero de ratón. Sin embargo, la inmunización pasiva previno la mortalidad por neumonía debido a la variante PAO1 citotóxica en dosis baja-desafío. Estos datos sugieren que se requiere para la protección contra infecciones pulmonares de p. aeruginosa, que tal inmunidad puede ser sacado por utilizando mutantes de deleción de aroA, y que una vacuna polivalente de p. aeruginosa compuesta por aroA mutantes de deleción de varios serogrupos prometedor significativa una combinación de la inmunidad humoral y celular.
El GalU Gene De Pseudomonas Aeruginosa Es Necesaria Para La Infección Corneal Y Eficiente Diseminación Sistémica Después De Neumonía, Pero No Para Infección Confinado Al Pulmón
Neumonías agudas e infecciones corneales debido a la Pseudomonas aeruginosa son generalmente causadas por lipopolisacárido (LPS)-suavizar las tensiones. En pacientes con fibrosis quística, sin embargo, LPS-áspero cepas de p. aeruginosa, antígeno que falta O, pueden sobrevivir en el pulmón y causar una infección crónica. No está claro si un fenotipo de LPS-áspero afecta citotoxicidad relacionada con el tipo de sistema de secreción III (TTSS). Previamente nos informó interrupción del gen galU en resultados de p. aeruginosa en la producción de un áspero LPS y había truncado base de LPS. Aquí se evaluó el papel del gen galU en la patogenesia de pulmón murino e infecciones del ojo y en la citotoxicidad por el efector TTSS ExoU. Estudiamos a galU mutantes de cepa PAO1, de su variante citotóxico expresando ExoU de un plásmido y de la cepa inherentemente citotóxica PA103. Los mutantes de galU fueron suero más sensible que las cepas parentales, pero se siguió citotóxicas in vitro. En un modelo de infección corneal, los mutantes galU se atenúan significativamente. En un modelo de neumonía aguda, las dosis letal 50% de los mutantes de galU fueron superiores a los de las cepas de tipo salvaje correspondientes, sin embargo, estos mutantes podrían causa mortalidad y neumonía grave, según lo juzgado por histología, incluso con la extensión sistémica mínima. Estos resultados sugieren que el gen galU es necesario para la infección corneal y eficiente diseminación sistémica después de la infección pulmonar pero no es necesario para la infección confinada al pulmón. Defensas del huésped en el pulmón parecen ser insuficientes para controlar la infección con p. aeruginosa LPS-áspero cuando los niveles de bacterianos locales son altos.
Vacuna Intranasal Heterologously Expresado Polisacárido Protege Contra Varias Infecciones De Pseudomonas Aeruginosa
Polisacáridos bacterianos superficie expresados son a menudo inmunodominante, antígenos protectores. Sin embargo, estos antígenos son químicamente y serológico altamente heterogéneos y verbal a los portadores de la proteína es a menudo necesario para mejorar su inmunogenicidad. A continuación os mostramos la eficacia de la vacunación intranasal de ratones con atenuada Salmonella enterica serovar Typhimurium expresando la parte de antígeno O del lipopolisacárido de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa es un sistema modelo ideal porque puede causar un gran número de infecciones locales y sistémicas. En particular, esta bacteria es la principal causa de neumonía adquirida en el hospital y es responsable de infecciones después de quemaduras y lesiones en los ojos. Además, hay modelos murinos de infección que imitan las manifestaciones clínicas de las infecciones de p. aeruginosa. Ratones inmunizados fueron altamente protegidos contra la infección, con inmunidad de larga duración a neumonía aguda de p. aeruginosa, mientras que los ratones inmunizados con Salmonella que contiene sólo la clonación vector o PBS no eran. Administración profiláctica y terapéutica de sueros de animales vacunados protegidas ratones ingenuos. Vacuna intranasal también proporciona una protección completa de infecciones después de quemaduras y redujo la patología después de abrasiones corneales. Estos resultados indican que entrega intranasal de antígenos polisacáridos heterologously expresados proporciona protección en distintos sitios de la infección. Este enfoque para la expresión y la entrega de antígenos polisacáridos como inmunógenos recombinantes podría adaptarse fácilmente para desarrollar vacunas para muchos agentes infecciosos, sin la necesidad de purificación complicada y procedimientos verbal.
Muerte De La Célula Epitelial Mediada Por Pilus En Respuesta a La Infección Con Burkholderia Cenocepacia
Burkholderia cenocepacia es un patógeno oportunista que puede causar infecciones graves en la fibrosis quística (CF) patients. El linaje ET12 aparece particularmente virulento en la FQ; sin embargo, su patogenesia es mal entendida y puede estar asociada con la respuesta del huésped. Para ayudar a caracterizar esta respuesta, se examinó la capacidad de B. cenocepacia inducir citotoxicidad y apoptosis en un modelo de célula epitelial. Sobre la infección con la cepa B. cenocepacia K56-2, células epiteliales del pulmón humano A549 experimentaron la muerte celular significativa; Análisis de fragmentación de ADN y tinción de yodo de propidio sugirieron apoptosis. Iniciación de la muerte celular era independiente del sistema de secreción tipo III, formación de biopelículas y secretadas citotoxinas bacterianas. Sin embargo, la frecuencia de la muerte celular fue menor en células infectadas con un mutante no-piliated, cblA::Tp K56-2. Además, se encontraron cbl purificada pili directamente inducir citotoxicidad en células A549 y activar caspase-9, -8 y -7 -3, las Proteinasas de cisteína principales implicados en la apoptosis. Parece que B. cenocepacia cbl pili, que es un rasgo distintivo del linaje ET12, actuar como un iniciador de citotoxicidad y apoptosis. Entender el papel de pili cbl en la patogenesia de infecciones B. cenocepacia ofrece el potencial para disminuir la virulencia de estos organismos potencialmente mortal en pacientes con FQ.
IL-17 Es Un Componente Crítico De La Protección Inducida Por La Vacuna Contra La Infección Pulmonar Por Lipopolisacárido-heterólogas Cepas De Pseudomonas Aeruginosa
En un modelo murino de la pulmonía aguda fatal, anteriormente demostramos que la inmunización nasal con una deletant de aroA viva atenuada de cepa de Pseudomonas aeruginosa PAO1 sacados protección específica del serogrupo de LPS, indicando que Ab opsonizante LPS O AG era el más importante efectoras inmunes. Porque la cepa de p. aeruginosa PA14 posee factores de virulencia adicionales, presumimos que una vacuna viva atenuada basada en PA14 podría provocar una gama más amplia de efectores inmunes. Así, se construyó un aroA deletant de PA14, denota PA14DeltaaroA. Ratones inmunizados de PA14DeltaaroA fueron protegidos contra letal neumonía causada no sólo por la cepa parental sino también por variantes citotóxicas de las cepas de p. aeruginosa O Ag-heterólogo PAO1 y PAO6a, d., suero de ratones inmunizados de PA14DeltaaroA tenía niveles muy bajos de actividad opsonizante contra cepa PAO1 y no podía transferir pasivamente protección, lo que sugiere que un mecanismo independiente del anticuerpo era necesario para la protección de la Cruz-serogrupo observados. En comparación con los ratones de control, PA14DeltaaroA-inmunizados ratones tenían más rápido reclutamiento de neutrófilos a las vías respiratorias después de desafío. Linfocitos T aislados de P. aeruginosa DeltaaroA-inmunizados ratones proliferaron y producen IL-17 en grandes cantidades después de cocultivo con gentamicina-mató a p. aeruginosa. Seis horas después de desafío, los ratones inmunizados de PA14DeltaaroA tenían niveles significativamente más altos de IL-17 en lavado broncoalveolar en comparación con contagiarlas, Escherichia coli-inmunizados, o ratones inmunizados de PAO1DeltaaroA. Agotamiento mediada por anticuerpos de IL-17 ante reto o ausencia del receptor IL-17 derogó la protección de la vacuna PA14DeltaaroA contra neumonía mortal. Estos datos demuestran que la IL-17 juega un papel fundamental en la independiente del anticuerpo inducida por la vacuna protección contra LPS-heteróloga cepas de p. aeruginosa en el pulmón.
Mucosa Vacunación Con Una Vacuna Viva Atenuada Multivalente Induce Multifactorial Inmunidad Contra La Infección Por Pseudomonas Aeruginosa Pulmonar Aguda
Muchos estudios con animales investigando efectores inmunes adaptativas importantes para la protección contra Pseudomonas aeruginosa han implicado opsonizante anticuerpos a los antígenos de antigénicamente variable lipopolisacárido (LPS) O como un efector primario. Sin embargo, la vacunación activa y pasiva de los seres humanos contra estos antígenos no ha demostrado eficacia clínica. Presumimos que inmunidad óptima sería necesario inducir múltiples efectores inmunes dirigidos a múltiples antígenos bacterianos. Por lo tanto, se evaluó una estrategia de vacunación mucosa viva atenuada multivalentes en un modelo murino de neumonía aguda de p. aeruginosa para evaluar las contribuciones a la eficacia protectora de diversos antígenos bacterianos y sede de efectores inmunes. Combinación de 3 o 4 cepas atenuadas tener diferentes serogrupos de LPS de las vacunas se asociaron con la máxima eficacia protectora en comparación con las vacunas con menos componentes. Los niveles de anticuerpos opsonofagocítico, que fueron dirigidos no sólo a los antígenos LPS O sino también al núcleo de LPS y proteínas de la superficie, correlacionados con inmunidad protectora. Las vacunas multivalentes viva atenuada superaron problemas previos que involucran interferencias inmunológicas en la elaboración de respuestas de anticuerpos O-antigen-specific cuando relacionados los antígenos O se combinaron en vacunas multivalentes. Anticuerpos contra el núcleo de LPS se asociaron con matanza in vitro y in vivo protección contra cepas con antígenos O no expresadas por las cepas de la vacuna, mientras que los anticuerpos a los LPS de la base y las proteínas de la superficie aumentada la contribución de anticuerpos O-antigen-specific provocada por cepas de la vacuna que contiene un antígeno homólogo de O. Células de T de CD4 locales en el pulmón también contribuido a la protección basada en la vacuna cuando opsonofagocítico anticuerpos contra la cepa de desafío estuvieron ausente. Así, vacunas multivalentes viva atenuada provocan multifactorial inmunidad protectora a infecciones pulmonares de p. aeruginosa.
