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Articles by John J. Finer in JoVE
JoVE General
Robotica e Image Analysis dinamica per gli Studi di espressione genica nei tessuti vegetali
1Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University, 2Department of Plant Pathology, North Carolina State University
Riportiamo un metodo per l'introduzione, il monitoraggio e l'analisi quantitativa di espressione GFP nelle cellule vegetali. Questo metodo utilizza un sistema progettato su misura per la robotica semi-continua raccolta di immagini da un gran numero di campioni, nel corso del tempo. Abbiamo anche dimostrare l'uso di ImageJ e ImageReady per l'analisi delle serie di immagini.
Other articles by John J. Finer on PubMed
Espressione Ectopica Di Un Fitasi Di Soia Nello Sviluppo Di Semi Di Glycine Max Per Migliorare La Disponibilità Di Fosforo
Un approccio transgenico è stato utilizzato per modificare il contenuto di soia semi fitato esprimendo un gene di fitasi di soia (GmPhy) durante lo sviluppo del seme a degradare ad accumula l'acido fitico (IP6). Un vettore di espressione contenente il cDNA di fitasi soia controllato dal promotore seme specifico beta-conglycinin (alfa '-subunità) è stato utilizzato per trasformare le culture embryogenic soia. Piante da quattro linee transgeniche indipendenti sono stati analizzati per l'integrazione del transgene e livelli IP6 seme. La riduzione dei livelli di IP6 in semi transgenici rispetto al controllo 'Jack' soia variava da 12,6 a 24,8 come determinato mediante HPLC. Una copia basso transformant fu propagata per la generazione di T4 ed esaminati più in dettaglio per fitasi espressione ed attività enzimatica durante lo sviluppo del seme. L'espressione di fitasi mRNA e fitasi attività aumenta durante lo sviluppo di semi, coerenza con l'uso di un promotore specifico dell'embrione. Espressione ectopica fitasi durante lo sviluppo del seme offre un potenziale come una strategia efficace per ridurre il contenuto di fitato nel seme di soia.
Analisi Comparativa Dei Promotori 35S E Lectina Nel Tessuto Soia Transgenica Utilizzando Un Sistema Di Acquisizione Automatica Di Immagini E Di Analisi Di Immagine
Espressione del gene della proteina fluorescente verde (gfp), sotto il controllo regolamentare del promotore 35S costitutiva o il promotore di lectin inerente allo sviluppo regolato è stato monitorato e quantificati utilizzando un recente sviluppo automatizzato sistema di tracciamento. Il sistema automatizzato è costituito da una tabella di robotica bidimensionale computerizzato e un sistema di acquisizione immagine programmabile, che è stato usato per monitorare semi-continuously gfp espressione genica durante lo sviluppo di embrioni somatici soia transgenica [Glycine max (L.) Merrill]. Analisi quantitativa di espressione di GFP ha dimostrato che, durante l'embrione somatico proliferazione e sviluppo precoce, espressione di lectin-GFP non è stato rilevato. Durante lo sviluppo embrionale tardiva, espressione di lectin-GFP aumenta gradualmente fino a che i livelli erano simili a quelli di 35S-GFP. L'uso di un sistema di raccolta automatica di immagini e analisi delle immagini ha facilitato il frequente monitoraggio e la quantificazione dell'espressione del gene gfp su un gran numero di campioni per un periodo prolungato di tempo.
Isolamento Dei Due Promotori Altamente Attiva Di Soia (Glycine Max (L.) Merr.) E Loro Caratterizzazione Mediante Un Nuovo Sistema Di Raccolta E Analisi Di Immagine Automatizzato
Un romanzo automatizzato insieme immagine e sistema di analisi è stato utilizzato per confrontare due nuovi promotori di soia (Glycine max (L.) Merr.) con il cavolfiore mosaic virus 35S promotore (CaMV35S), che è stato usato come un'espressione standard. Per i confronti di espressione, varie permutazioni di un promotore di polyubiquitin (Gmubi) di soia, una soia calore promotore di shock protein 90-come (GmHSP90L) e il promotore CaMV35S furono posti a monte del gene della proteina fluorescente verde (gfp). Costrutti di DNA sono stati introdotti tramite bombardamento di particelle in escisse cotiledoni di germinazione dei semi di fagiolo di lima (Phaseolus lunatus L.), che sono stati organizzati in piastre di Petri per la cattura automatica di immagini e analisi delle immagini. Il sistema automatizzato ha permesso il monitoraggio e la quantificazione dell'espressione del gene gfp nello stesso pezzo di tessuto nel corso del tempo. Il promotore di Gmubi, con la sua regione intronic intatto, ha mostrato la massima espressione che era oltre cinque volte più resistente del promotore CaMV35S. Quando una regione intronic è stato rimosso dal promotore Gmubi, espressione di GFP è stato ridotto, ma era ancora più di due volte maggiore con il promotore CaMV35S. Il promotore di GmHSP90L soia integrale era quattro volte più resistente del promotore CaMV35S. Troncamento del promotore GmHSP90L provocato diminuzioni stepwise in forza del promotore, che sembrano corrispondere alla rimozione degli elementi normativi. Acquisizione immagine automatizzato e l'analisi ha permesso la valutazione rapida ed efficace di questi nuovi promotori.
Quantificazione Ed Estensione Dell'espressione Di GFP Transitoria Dalla Co-introduction Di Un Soppressore Del Silenzio
Tramite il bombardamento di particelle, un vettore di espressione di DNA contenente il gene reporter proteina fluorescente verde (GFP) è stato introdotto nelle cellule vegetali. Espressione del gene GFP è stato transitorio; con conseguente picco GFP Expression circa 24 h post introduzione e un rapido declino in seguito. Questo declino ben noto nell'espressione del gene è stato attribuito in precedenza a pre-integrative eventi di DNA che ha coinvolto la perdita introdotta DNA o cellule morte. Qui, ci mostra che genico che silenziamento (Trascrizionale) è anche coinvolto. Introduzione di un vettore di espressione di GFP da solo ha portato a un rapido declino nell'espressione transitoria dopo 30 h. Tuttavia, se la GFP è stato espresso come una fusione traslazionale per la proteina soppressore silenziamento RNA HCPro da tabacco etch potyvirus, espressione del transgene è stata estesa a oltre 100 analisi di mutanti h. di HCPro ha dimostrato che una proteina funzionale di HCPro è stato richiesta di questa estensione di espressione transitoria. Vari soppressione e fusione traslazionale analisi ha confermato che la regione C-terminale della proteina è stata importante per l'attività di soppressore e l'intera proteina era necessaria per soppressione ottimale dell'host silenziamento. La natura transitoria dell'espressione genica durante il bombardamento di particelle sembra derivare da induzione di Trascrizionale, che può essere mitigata dalla presenza di un soppressore del silenzio. L'uso di RNA silencing proteine del soppressore può rendere dosaggi espressione transitoria mediata dal bombardamento delle particelle più utili per valutare i fattori che espressione di gene di effetto.
Valutazione Quantitativa Di Sei Differenti Virale Soppressori Di Silenziamento Mediante Analisi Di Immagine Di Espressione Transitoria Di GFP
Gli effetti di sei soppressori virali differenti della pianta di silenziamento genico sono stati confrontati con un sistema di raccolta e analisi di immagine automatizzato sviluppato per il monitoraggio continuo dell'espressione di GFP. Soppressori sono stati introdotti nei tessuti Cotiledonaria fagiolo di lima o come 3'-fusioni traslazionale GFP o come co-introductions con il gene GFP su un plasmide separato. I profili di espressione transitoria risultante per ogni soppressore dipendevano se il soppressore è stato introdotto come una fusione o co-introduced su plasmidi separati. Come co-introductions, i silenziamento soppressori HCPro (da Tobacco etch virus), p19 (da virus bushy stunt di pomodoro), gammab (da Barley stripe mosaic virus) e p21 (da barbabietola gialli virus) portò ad un incremento quasi duplice nei livelli di espressione di GFP iniziali, seguita da un rapido declino. In contrasto, fusioni di HCPro, p19 e gammab per il 3'-fine della GFP ha portato nell'espressione di GFP leggermente inferiore ma più prolungata. Confrontato con il co-introductions, tutti GFP::Suppressor traslazionale fusioni ha dato a ridotti livelli di fluorescenza GFP, suggerendo l'interferenza del partner fusion con fluorescenza GFP. Indipendentemente dalla configurazione, introduzioni del silenziamento soppressori AL2 (da Tomato golden mosaic virus) e 126-kDa proteina (da virus del mosaico del tabacco) ha portato molto bassa fluorescenza della GFP. Questa è la prima relazione che confronta direttamente gli effetti di un gran numero di soppressori virale del silenzio sull'espressione del transgene transitoria utilizzando sia traslazionale fusioni e co-introductions.
Un Promotore Di Polyubiquitin Di Soia (Glycine Max) Dà Forte Espressione Costitutiva Nella Soia Transgenica
Il successo della trasformazione genetica vegetale si basa fortemente sulla forza e la specificità dei promotori utilizzato per geni di auto di interesse. In questo studio, abbiamo analizzato l'espressione di gene gfp mediata da un promotore di polyubiquitin (Gmubi) da soia (Glycine max) nei tessuti di soia stabilmente trasformato. Espressione forte GFP è stato osservato nei tessuti embryogenic proliferativi stabilmente trasformati. In piante transgeniche intero, espressione di GFP è stato osservato nei consigli di radice, radice principale e laterale, cotiledoni e plumules nelle piante giovani, così come nelle vene della foglia, piccioli, petali di fiori, polline, baccelli e semi in via di sviluppo in piante mature. Espressione di GFP è stato localizzato principalmente nelle cellule epidermiche, mesofillo della foglia, procambium e tessuti vascolari. Introduzione di una versione meno introne del promotore del Gmubi (Gmupri) visualizzato quasi lo stesso schema di espressione GFP seppur a bassa intensità. Il promotore di Gmubi ha mostrato elevati livelli di espressione costitutiva e rappresenta un'alternativa ai promotori virali per la guida di espressione genica in soia.
La Proteina Dito Di Zinco Dal Tandem Di Arabidopsis AtTZF1 Traffici Tra Il Nucleo E Foci Citoplasmatici E Si Lega Il DNA E Il RNA
Sono organi di elaborazione (PBs) foci citoplasmatici specializzati dove fatturato mRNA e repressione traslazionale può avvenire. Stress granuli sono correlati foci citoplasmatiche. Le proteine di dito di zinco CCCH tandem (TZFs) svolgono un ruolo cruciale nell'espressione genica, specifica di destino delle cellule e vari processi di sviluppo. TZF umano associa elementi AU-rich presso la regione 3' non tradotte e reclute decapsulatura, deadenylation ed exonucleolytic enzimi per PBs per fatturato di RNA. Recenti studi genetici indicano che pianta che tzfs sono coinvolti nella regolazione genica e risposte ambientali ormone-mediata. Non è noto se la pianta TZFs può legare RNA ed essere localizzato in granuli di PBs o di stress. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) AtTZF1/AtCTH/AtC3H23 è stato identificato come un gene sensibile lo zucchero in un precedente studio di microarray. È caratterizzata da un motivo a TZF distinto dal TZF umana. Piante superiori come ogni Arabidopsis e riso (Oryza sativa) sono una famiglia di geni che contengono questo unico motivo TZF. Qui, ci mostra che AtTZF1 può traffico tra il nucleo e foci citoplasmatiche. AtTZF1 colocalizza con marcatori di PBs e la morfologia di questi foci citoplasmatiche assomiglia a quello di mammiferi PBs e stress granuli. AtTZF1-associated citoplasmatiche foci sono dinamici e tessuto specifico. Essi può essere indotta da buio e sottolinea ferita e sono preferenzialmente presente in crescita attivamente i tessuti e le cellule precursore stomatica. Poiché AtTZF1 può legare sia DNA che RNA in vitro, che solleva la possibilità che AtTZF1 potrebbe essere coinvolto nella regolazione del DNA o RNA.
Alto Livello Espressione Transgenico Di Soia (Glycine Max) GmERF Gmubi Gene Promotori E Isolato Da Una Pipeline Di Analisi Del Romanzo Promotore
Sebbene numerosi fattori possono influenzare l'espressione di gene, promotori sono forse la componente più importante del processo di controllo regolamentare. Regioni promoter sono spesso definiti come una regione a monte dell'inizio trascrizionale. Essi contengono elementi normativi che interagiscono con proteine regolatrici di modulare l'espressione genica. La maggior parte dei geni possiedono il proprio promotore unico e un gran numero di promotori è quindi disponibile per lo studio. Purtroppo, relativamente pochi promotori sono stati isolati e caratterizzati; particolare di soia (Glycine max).
Fattori Di Trascrizione WRKY: Principali Componenti in Acido Abscissico Segnalazione
Fattori di trascrizione WRKY (TFs) sono regolatori chiave di molti processi di vegetali, tra cui le risposte a stress biotici e abiotici, senescenza, la dormienza del seme e la germinazione dei semi. Da oltre 15 anni, limitate evidenze sono stata disponibile suggerendo che WRKY TFs può giocare ruoli nella regolazione della pianta sono risposte a phytohormone acido abscissico (ABA), in particolare alcuni TFs WRKY ABA-inducible repressori della germinazione dei semi. Tuttavia, i ruoli di WRKY TFs in altri aspetti della ABA segnalamento e i meccanismi coinvolti, sono rimasti poco chiari. Recenti progressi significativi nella ricerca di ABA ha ora disposto specifiche WRKY TFs saldamente nelle vie di segnalazione ABA-reattivo, dove agiscono a più livelli. In Arabidopsis, TFs WRKY sembrano agire a valle di almeno due recettori ABA: citoplasmatico PYR/PYL/RCAR-proteina fosfatasi 2 C-ABA complesso e il cloroplasto si trova busta ABAR-ABA complesso. Gli studi di promotore-associazione in vivo e in vitro dimostrano che i geni bersaglio per TFs WRKY che sono coinvolti nella ABA segnalazione includono noti geni ABA-reattivo come ABF2, ABF4, ABI4, ABI5, MYB2, DREB1a, DREB2a e RAB18. Altri geni dello stress-inducible ben caratterizzati come RD29A e COR47 si trovano anche nella segnalazione percorsi a valle di WRKY TFs. Queste nuove intuizioni rivelano anche che alcuni WRKY TFs sono positivi regolatori di chiusura stomatica ABA-mediata e quindi le risposte alla siccità. Al contrario, molti WRKY TFs sono regolatori negativi della germinazione dei semi, e controllando la germinazione dei semi appare una funzione comune di un sottoinsieme di WRKY TFs in piante fiorite. Presi insieme, questi nuovi dati dimostrano che WRKY TFs sono nodi chiavi nelle reti di segnalazione ABA-sensibli a reagire.
