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Articles by John J. Finer in JoVE
JoVE General
ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究のための動的画像解析
1Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University, 2Department of Plant Pathology, North Carolina State University
我々は、導入、トラッキングおよび植物細胞におけるGFP発現の定量分析法を報告する。このメソッドは、時間の経過とともに、大量のサンプルから半連続画像コレクションのためにカスタム設計されたロボットのシステムを利用しています。我々はまた、画像系列の分析のためのImageJのとImageReadyの使用方法を示しています。
Other articles by John J. Finer on PubMed
リン可用性を向上させるためにダイズの種子の開発大豆のフィターゼの異所性発現
トランスジェニックアプローチは、フィチン酸（IP6）を蓄積して分解する種子の開発中に大豆のフィターゼ遺伝子（GmPhy）を発現させることにより、大豆種子のフィチン酸含有量を変更するために使用されていました。種子特異的β-コングリシニンのプロモーター（alpha'サブユニット）によって制御されるcDNAの大豆フィターゼを含む発現ベクターは、胚大豆培養物を変換するために使用されていました。 4独立したトランスジェニックラインからの植物が遺伝子の統合と種子IP6のレベルについて分析した。 HPLCによって決定されたコントロール·ジャック "の大豆に比べて遺伝子組み換え種子のIP6レベルの低下は12.6から24.8の範囲であった。低コピーの形質転換体は、T4世代に伝播され、種子の開発中にフィターゼの発現と酵素活性のために詳細に検討した。フィターゼmRNAおよびフィターゼ活性の発現は胚特異的プロモーターの使用と一致し、種子の開発中に増加した。種子の開発時に異所性フィターゼの発現は、大豆種子のフィチン酸含有量を低減するための効果的な戦略としての可能性を提供しています。
自動化された画像取得システムと画像解析を用いたトランスジェニックダイズ組織における35Sとレクチンプロモーターの比較解析
緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子の発現は、構成的プロモーターまたは発達レギュレクチンプロモーターのいずれかの調節制御下に監視し、新開発の自動追跡システムを用いて定量した。自動化されたシステムは、コンピュータ制御された二次元のロボットテーブルとトランスジェニック大豆の開発[ダイズ（L.）メリルリンチ]体細胞胚の間に半連続的にモニターのGFP遺伝子の発現に使用されたプログラム可能な画像取得システム、から成っていた。 GFP発現の定量分析は、不定胚の増殖および初期開発中に、レクチン-GFPの発現が検出されなかったことを示した。レベルは35S-GFPのものと類似していた深夜まで胚の開発中に、レクチン-GFPの発現は徐々に増加した。自動画像収集システムと画像解析の使用は、長期間にわたって多数のサンプルで頻繁に監視およびGFP遺伝子発現の定量化を容易にした。
新しい自動画像収集と解析システムを用いた二高活性ダイズ（Glycine Max（L.）MERR。）プロモーターとそのキャラクタリゼーションの分離
小説自動画像収集と分析システムは、表現の標準として使用された二つの新しいダイズ（Glycine max（L.）MERR）カリフラワーモザイクウイルス35S（CaMV35Sプロモーター）プロモーターとプロモーターを、比較するために使用されていました。式の比較、大豆ポリユビキチン（Gmubi）プロモーターのさまざまな組み合わせについては、大豆の熱ショックタンパク質90のような（GmHSP90L）プロモーターとCaMV35Sプロモーターは、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子の上流に配置された。 DNA構築物は、自動化された画像の取り込みと画像解析のためのペトリ皿に配置したリママメ（インゲンマメlunatus L.）種子の発芽子葉を切り出しに粒子衝突を介して導入されました。自動化されたシステムは、時間の経過とともに組織の同じ部分にGFP遺伝子発現のモニタリングと定量化を可能にした。そのイントロン領域はそのままでGmubiプロモーターは、CaMV35Sプロモーターよりも5倍以上強かった最も高い発現を示した。イントロン領域がGmubiプロモーターから削除されたときに、GFPの発現が低下しますが、それでも、CaMV35Sプロモーターよりも上の2つの倍以上だった。フルレングスの大豆GmHSP90Lプロモーターは、CaMV35Sプロモーターよりも4倍強かった。 GmHSP90Lプロモーターの切り捨ては、規制元素の除去に対応するように見えるプロモーター強度を段階的に減少し、もたらした。自動化された画像のキャプチャと分析は、これらの新しいプロモーターの迅速かつ効率的な評価を可能にした。
サイレンシングの抑制の共同導入による一時的なGFPの発現の定量化と拡張
パーティクルボンバードメントを使用して、緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子を含むDNA発現ベクターを植物細胞に導入した。 GFP遺伝子の発現は一過性であった。その後24時間後の導入と急速な低下に関するピークGFPの発現をもたらす。遺伝子発現のこのよく知られている減少は、以前に導入したDNAや細胞死の損失に関与プレ統合DNAのイベントに起因している。ここでは、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）も関与していることを示しています。単独でのGFP発現ベクターの導入は、30時間後に一過性の発現が急激に減少しました。 GFPはタバコエッチポティウイルスからのRNAサイレンシングサプレッサータンパク質HCProに翻訳融合タンパク質として発現された場合は、導入遺伝子の発現は、はるかに超える100時間に延長されました。 HCProの変異体の解析は、機能HCProタンパク質が一過性発現のこの拡張に必要なことが示された。様々な欠失および翻訳融合分析は、タンパク質のC末端領域は抑制活性のために重要であったとタンパク質全体がホストサイレンシングの最適化を抑制するために必要なことを確認した。粒子衝突時の遺伝子発現の一過性の性質は、サイレンシングのサプレッサーの存在によって軽減することができますPTGSの誘導に起因すると表示されます。サプレッサータンパク質をRNAサイレンシングの使用が要因その旨遺伝子の発現を評価するための粒子砲撃介在一過性発現アッセイは、より有用なものがあります。
一時的GFP発現の画像解析を用いたサイレンの6つの異なるウイルスサプレッサの定量的評価
遺伝子サイレンシングの6つの異なる植物ウイルス抑制の効果はGFP発現の継続的な監視のために開発した自動画像収集と分析システムを用いて比較した。サプレッサは、3'-GFP翻訳の融合体として、または別のプラスミド上にGFP遺伝子との共導入のいずれかリママメ子葉組織に導入されました。それぞれの抑制の結果の一過性の発現プロファイルは、抑制が融合として導入されたか、別のプラスミド上に共同導入されたかどうかに依存していた。共同導入として、サイレンシングサプレッサーHCPro（タバコエッチウイルスから）、P19（トマトふさふさスタントウイルスから）、gammab（オオムギ斑葉モザイクウイルスから）とp21は（ビート萎黄ウイルスから）最初のGFPのほぼ二重の増加につながった急激な減少が続い発現レベル、。対照的に、HCPro、P19、およびGFPの3 '末端にgammabの融合は若干低いが、より長時間のGFPの発現をもたらした。共同導入と比較して、すべてのGFP ::サプレッサー翻訳融合は、GFP蛍光を融合パートナーとの干渉を示唆して減少し、GFP蛍光のレベルを与えた。構成にかかわらず、サイレンシングサプレッサーAL2（トマトゴールデンモザイクウイルス）および126-kDaのタンパク質（タバコモザイクウイルス）の紹介は非常に低いGFPの蛍光をもたらした。これは、直接翻訳融合と共同導入の両方を使用して、一時的な導入遺伝子の発現をサイレンシングのウイルス抑制の多数の効果を比較する最初の報告である。
ダイズ（Glycine Max）ポリユビキチンプロモーターは、トランスジェニック大豆で強力な構成的発現を与える
植物形質転換の成功は、目的の遺伝子を駆動するために使用されるプロモーターの強さと特異性に大きく依存しています。本研究では、安定に形質転換ダイズ組織におけるダイズ（Glycine max）からポリユビキチンプロモーター（Gmubi）によって媒介されるGFP遺伝子の発現を解析した。強力なGFPの発現は安定して形質転換増殖胚の組織で観察された。全体のトランスジェニック植物では、GFPの発現は成熟した植物で若い工場で同様葉脈、葉柄、花びら、花粉、ポッドと開発種子の根、メインと側根、子葉と幼芽で観察された。 GFPの発現が表皮細胞、葉肉、前形成層と血管組織に主に局在していた。 Gmubiプロモーター（Gmupri）のイントロンレス版の導入は、低い強度ではあるがほぼ同じGFPの発現パターンを表示されます。 Gmubiプロモーターは構成的な発現の高いレベルを示し、大豆の遺伝子発現を駆動するためのウイルスのプロモーターに代わるものを表しています。
シロイヌナズナタンデムジンクフィンガータンパク質は、核と細胞質病巣間AtTZF1トラフィックは、DNAおよびRNAの両方に結合する
処理機関（PBS）は、mRNAの代謝回転と翻訳抑制を行うことができる特殊な細胞の病巣である。ストレス顆粒は細胞質病巣を関連しています。 CCCHタンデム亜鉛フィンガータンパク質（TZFs）は、遺伝子発現、細胞運命の仕様、および様々な発生過程において重要な役割を果たしています。人間のTZFは、3 '非翻訳領域におけるAU-リッチな要素を結合し、開栓、アデニル、およびRNAの代謝回転のためにPBSにエキソヌクレアーゼ酵素を募集しています。最近の遺伝学的研究は、植物のTZFsは、遺伝子調節およびホルモンを介した環境応答に関与していることを示しています。植物TZFsは、RNAに結合し、PBSまたはストレス顆粒に局在することができますかどうかは不明である。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）AtTZF1/AtCTH/AtC3H23は、以前のマイクロアレイ研究における糖感受性遺伝子として同定された。それは人間のTZFとは異なるTZFモチーフによって特徴付けられる。そのようなシロイヌナズナとイネ（Oryza sativa）のような高等植物は、それぞれ、このユニークなTZFモチーフを含む遺伝子ファミリーを持っています。ここでは、AtTZF1は核と細胞質の病巣間のトラフィックをできることを示している。 AtTZF1は、PBSのマーカーと共局在し、これらの細胞巣の形態は、哺乳動物のPBSおよびストレス顆粒のそれと似ています。 AtTZF1関連細胞質の病巣では、動的および組織特異的である。彼らは暗いと傷ストレスによって誘導され、積極的に成長して組織や気孔の前駆細胞で優先的に存在することができます。 AtTZF1 in vitroでDNAとRNAの両方を結合することができるので、AtTZF1は、DNAおよび/またはRNAの調節に関与している可能性が発生します。
ダイズ（Glycine Max）GmERFと新規プロモーター解析パイプラインによって分離されたGmubi遺伝子プロモーターの高レベルのトランスジェニック発現
多数の要因が遺伝子発現に影響を与えることができますが、プロモーターは、おそらく規制制御プロセスの中で最も重要なコンポーネントです。プロモーター領域は、多くの場合、転写開始点の上流領域として定義されています。彼らは、遺伝子発現を調節する調節タンパク質と相互作用の調節エレメントが含まれています。ほとんどの遺伝子は、独自のプロモーターを有しており、プロモーターの多数したがって、研究のために用意されています。残念なことに、比較的少数のプロモーターを単離し、そして特徴付けられている。特にダイズ（Glycine max）から。
WRKY転写因子：キーコンポーネントのアブシジン酸シグナリングの
WRKY転写因子（TF）は、生物と非生物的ストレス、老化、種子の休眠と発芽への応答を含む多くの植物のプロセスの重要な調節因子である。 15年以上にわたり、限られた証拠はWRKY TFSは、植物ホルモンのアブシジン酸（ABA）に植物の応答を調節する役割を果たしている可能性が示唆された利用できるようになりました、特にいくつかのWRKY TFは、種子発芽のABA誘導性リプレッサーである。しかし、ABAシグナル伝達の他の側面におけるWRKY TFの役割、関与する機序は不明で残っています。 ABA研究における最近の著しい進歩はしっかりと彼らは複数のレベルで行動するABA応答シグナル伝達経路で特定のWRKY TFSを置いている。細胞質PYR / PYL / RCAR蛋白質ホスファターゼ2C-ABA複雑で葉緑体エンベロープに配置Abarの可-ABA複合体：シロイヌナズナでは、WRKY TFは、少なくとも2つのABA受容体の下流で作用すると思われる。 in vivoおよびin vitroプロモーター結合の研究ではABAシグナル伝達に関与しているWRKY TFのための標的遺伝子などABF2としてよく知られているABA応答性遺伝子、ABF4、ABI4、ABI5、MYB2、DREB1A、DREB2AとRAB18が含まれていることを示しています。そのようなRD29AとCOR47などの追加よく特徴付けられたストレス誘導性遺伝子はまた、WRKY TFの下流のシグナル伝達経路に記載されています。これらの新しい洞察力はまた、いくつかのWRKY TFSは、ABA-仲介気孔閉鎖、したがって、干ばつ応答の正の調節因子であることを明らかにした。逆に、多くのWRKY TFは、種子発芽の負の調節因子であり、種子の発芽を制御すること開花植物のWRKY TFのサブセットの共通機能が表示されます。まとめると、これらの新しいデータはWRKY TFSはABA応答シグナル伝達ネットワークの重要なノードであることを示している。
