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Articles by Jonathan S. Marchant in JoVE
JoVE General
Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia
Department of Pharmacology and The Stem Cell Institute, University of Minnesota Medical School
Un modelo atractivo para el estudio de la diferenciación de células madre en un animal vivo es el gusano planaria. La regeneración se estudia por medio de experimentos sencillos que la amputación se realiza fácilmente en un laboratorio básico y son susceptibles de (farmacológicos y genéticos
Other articles by Jonathan S. Marchant on PubMed
Las Relaciones Estructurales Y Funcionales Entre Ca2 + Puffs Y Las Mitocondrias En Ovocitos De Xenopus
La captación de Ca2 + y la liberación de retículo endoplásmico (RE) y mitocondriales tiendas de Ca2 + desempeñan importantes funciones fisiológicas y patológicas, y estos procesos son moldeadas por las interacciones que dependen de la intimidad estructural entre estos orgánulos. Este sentido, investigar las relaciones morfológicas y funcionales entre ER mitocondrias, y los sitios de Ca2 + intracelular liberación en ovocitos de Xenopus laevis mediante la combinación de imagen confocal del local de Ca2 + eventos de liberación ("Ca2 + bocanadas") con la localización mitocondrial visualizar utilizando colorantes vitales y subcellularly blanco fluorescente proteínas. Las mitocondrias y ER se localizan en las bandas corticales aproximadamente 6-8 micras de ancho, con las mitocondrias como arreglada densamente poblado "islas" conectadas entre sí por líneas discretas. La sala de emergencia se concentra más superficial que las mitocondrias, y la separación media entre los sitios de Ca2 + y soplo las mitocondrias es de aproximadamente 2,3 micras. Sin embargo, una subpoblación de Ca2 + sitios de hojaldre está íntimamente asociada a las mitocondrias (aproximadamente el 28% dentro de <600 nm), un número mayor de lo esperado si Ca2 + sitios de hojaldre fueron distribuidos al azar. Ca2 + sitios de liberación cerca de Ca2 + exhibición de las mitocondrias menor soplo de la actividad de Ca2 + en los sitios de hojaldre las regiones con menor densidad mitocondrial. Por otra parte, Ca2 + sitios de hojaldre en estrecha asociación con las mitocondrias no suelen servir como sitios para la iniciación de onda de Ca2 +. Llegamos a la conclusión de que las mitocondrias juegan un papel importante en la regulación local de la excitabilidad de ER, Ca2 + de iniciación de las olas, y, por tanto, los patrones espaciales de los mundiales de las señales de Ca2 +.
El Tráfico Intracelular Y Los Mecanismos De Focalización De Membrana De La Humana Transportador De Folato Reducido En Las Células Epiteliales De Mamíferos
La principal vía para la captación celular del ácido soluble en agua vitamina fólico en células de mamíferos es a través de una proteína de membrana de plasma conocido como el transportador de folato reducido (RFC). Los determinantes moleculares que dictan la expresión de la membrana plasmática de RFC, así como los mecanismos celulares que entregan RFC a la superficie celular permanecen mal definidos. Por lo tanto, hemos diseñado una serie de proteínas de fusión del ser humano RFC (HRFC) con la proteína fluorescente verde a la imagen de la dinámica de selección de beneficiarios y el tráfico de HRFC de vida las células epiteliales. Se demuestra que, en contraste con muchos otros transportadores de nutrientes, los determinantes moleculares que dictan expresión HRFC membrana plasmática residir dentro de la espina dorsal hidrófoba del polipéptido y no dentro de la citoplásmica NH (2) -. O COOH-terminal de dominios de la proteína Además, la integridad de la columna vertebral HRFC es crítico para la exportación del polipéptido desde el retículo endoplásmico a la superficie celular. Este tráfico es críticamente dependiente de microtúbulos intactos debido a la interrupción de los microtúbulos inhibe la motilidad de los HRFC vesículas que contienen así como la expresión final de HRFC en la membrana plasmática. Por primera vez, estos datos definir los mecanismos que controlan el tráfico intracelular y la localización de la superficie celular de los epitelios de mamíferos dentro de HRFC.
Biología Celular De La Tiamina Transportador Humano-1 (hTHTR1). El Tráfico Intracelular Y Los Mecanismos De Focalización De Membrana
La tiamina hTHTR1 transportador humano está implicado en la acumulación celular de tiamina (vitamina B1) en muchos tejidos. Los trastornos de deficiencia de tiamina, como la tiamina que responde a la anemia megaloblástica (TRMA), que se asocia con mutaciones específicas dentro de hTHTR1, altera las probabilidades de la funcionalidad y / o orientación intracelular de hTHTR1. Por desgracia, no se sabe nada acerca de los mecanismos que controlan el tráfico intracelular o membrana focalización de hTHTR1. Para identificar los determinantes moleculares implicados en hTHTR1 objetivo, hemos generado una serie de hTHTR1 truncamientos fusionados con la proteína verde fluorescente y la imagen de la dinámica de focalización y el tráfico de cada construcción en la que viven las células del epitelio duodenal. Considerando que la proteína de fusión de longitud completa se expresó funcionalmente en la membrana plasmática, el análisis de los mutantes truncados demostrado un papel esencial para ambos NH (2)-terminal de la secuencia y la integridad del esqueleto polipeptídico para la expresión de la superficie celular. En particular, el truncamiento de hTHTR1 dentro de una región donde varios truncamientos TRMA se agrupan como resultado la retención intracelular de la proteína mutante. Por último, la imagen confocal de la dinámica de las vesículas intracelulares hTHTR1 reveló un papel fundamental para los microtúbulos, microfilamentos, pero no, en hTHTR1 trata de personas. En conjunto, estos resultados se correlacionan hTHTR1 estructura con perfil de expresión celular y revelan una dependencia crítica de la integridad y la espina dorsal hTHTR1 microtúbulos basados en los procesos de trata de personas para la expresión funcional de hTHTR1.
Expresión Polarizada De Los Miembros De La Familia De Genes Transportadores De Solutos SLC19A De Los Transportadores De Multivitamínicos Solubles En Agua: Implicaciones Para La Función Fisiológica
Los seres humanos carecen de vías bioquímicas para la síntesis de la tiamina micronutrientes y ácido fólico. Las necesidades celulares se cumplen a través de la actividad de transporte de membrana, que está mediada por proteínas de la familia de genes SLC19A. Mediante el uso de células vivas, los métodos de visualización de imagen confocal para resolver la localización de todos los miembros de la familia SLC19A, nos muestran que los dos transportadores humanos de tiamina son diferencialmente dirigida en células polarizadas, el establecimiento de un sistema de transporte vectorial. Esta polarización se reduce la redundancia funcional entre las isoformas del transportador y permite la regulación independiente de la importación de tiamina y de vías de exportación en las células.
Expresión Y Contribución Funcional De HTHTR-2 En La Absorción De Tiamina En El Intestino Humano
El objetivo de este estudio fue investigar la expresión y la contribución relativa de transportador humano tiamina (hTHTR) -2 hacia la captación total de tiamina portadora mediada por las células epiteliales intestinales. El análisis de transferencia Northern mostró que el mensaje de la hTHTR-2 se expresa a lo largo del tracto gastrointestinal humano nativo con expresión máxima de estar en la parte proximal del intestino delgado. hTHTR-2 de proteínas fue encontrado, por análisis de Western blot, que se expresa en la membrana del borde en cepillo (BBM), pero no en la membrana basolateral de los enterocitos humanos nativos. Este patrón de expresión fue confirmada en los estudios que utilizan una proteína de fusión de hTHTR-2 con el aumento de la proteína verde fluorescente (EGFP-hTHTR2) se expresa en que viven las células Caco-2 cultivadas en el filtro. Pretratamiento de células Caco-2 (que también expresan la hTHTR-2 en el ARN y proteínas) con hTHTR-2 genes específicos de pequeños ARN de interferencia (siRNA) condujo a una disminución significativa (P <0,01) y la inhibición específica (48%) en el portador mediada por la absorción de tiamina. Del mismo modo, el pretratamiento de células Caco-2 con siRNA que apuntan específicamente a hTHTR-1 (que se expresa en células Caco-2) también de forma significativa (P <0,01) y específicamente inhibido (en un 56%) portadora mediada por la absorción de tiamina. Cuando las células Caco-2 fueron tratados previamente con siRNAs contra tanto hTHTR-2 y hTHTR-1 genes, una inhibición casi total en el portador mediada se observó absorción de tiamina. Estos resultados muestran que el mensaje de hTHTR-2 se expresa a lo largo del tracto gastrointestinal humano y que la expresión de la proteína en el epitelio intestinal se localiza principalmente en el dominio BBM apical. Además, los resultados muestran que este transportador juega un papel importante en la captación de portadora mediada tiamina en el intestino humano.
Una Región C-terminal Dicta La Membrana Plasmática Apical Focalización Del Programa De Las De Sodio Dependiente De La Vitamina C Transportador-1 En El Epitelio Polarizado
El dependiente de sodio humano vitamina C transportador (hSVCT1) media de absorción de sodio-dependiente celular de la micronutrientes esenciales ácido L-ascórbico (vitamina C). Sin embargo, los determinantes moleculares que controlan la expresión de la superficie celular, distribución subcelular y la dinámica de hSVCT1 permanecen indefinidos. Para identificar los determinantes moleculares que intervienen en la orientación hSVCT1 en el epitelio polarizado, se utilizó en vivo de imágenes de células enfoques para resolver la dinámica de selección de beneficiarios y el tráfico de hSVCT1 mutantes de truncamiento en las células renales e intestinales. Imagen confocal demostraron que hSVCT1 se expresó en la superficie celular apical y las medidas de vídeo tasa reveló hSVCT1 también residía en una población heterogénea de las organelas intracelulares con discretas propiedades dinámicas. Por truncamiento progresiva de la citoplasmática C-terminal de la cola de hSVCT1, hemos delimitado un papel esencial para un incrustados diez PICPVFKGFS secuencia de aminoácidos (aminoácidos 563-572) en la definición de la orientación fisiológica de hSVCT1. Curiosamente, esta secuencia tiene una homología significativa con los motivos identificados recientemente apicales dirigidas en otros dos que dependen de los transportadores de sodio, y le sugerimos esta medida de conservación se refleja topológicamente a través de la adopción de una confirmación de la beta-a su vez en el citoplasma de C-cola de cada transportista. Nuestros resultados proporcionan la primera resolución directa de la expresión funcional de hSVCT1 en la superficie celular apical de los epitelios polarizados y definir una señal apical de la orientación de relevancia a los transportistas de especificidad por el sustrato diverso.
De Calcio Dependientes De La Media La Desfosforilación De La Hiperosmótico Y ácido Lisofosfatídico Dependiente De La Inhibición De Péptido Natriurético B-ciclasa Receptor-B/guanylyl
Natriurético de tipo C de unión a receptor de péptido natriurético B-péptido (NPR-B) estimula la síntesis de GMPc, que regula vasorrelajación, la proliferación celular, y el crecimiento óseo. En este caso, se determinó la base mecánica de hiperosmótico y ácido lisofosfatídico dependiente de la inhibición de la NPR-B. Mediciones de células enteras cGMP y ensayos guanililciclasa indicó que hiperosmolaridad aguda disminución NPR-B en una actividad reversible, la concentración y tiempo dependiente de la forma, mientras que la exposición crónica no tuvo ningún efecto. Hiperosmolaridad aguda elevados de calcio intracelular en una forma dependiente de la concentración que se asemejaba NPR-B desensibilización. Un quelante de calcio, pero no es un inhibidor de la proteína quinasa C, bloquearon los dos elevaciones de calcio y la desensibilización. Medio hiperosmótico estimulada NPR-B desfosforilación, y el receptor fue rápidamente rephosphorylated y resensitized cuando los medios hipertónicas se eliminó. Lisofosfatídico ácido también inhibe la NPR-B en una de calcio y la fosforilación dependiente de proceso, de conformidad con el calcio es un regulador universal de la NPR-B. El requisito absoluto de desfosforilación en este proceso se demostró mostrando que un receptor con glutamatos sustituidos en todos los sitios de fosforilación conocidos B-NPR no responde a estímulos hiperosmóticos. Este es el primer estudio para medir el estado de fosforilación de una guanilato ciclasa endógeno y para vincular las elevaciones de calcio intracelular con su desfosforilación.
La Mejora De "óptica" Highlighter Sondas Derivadas De La Proteína Fluorescente Roja Discosoma
El tetramérica proteína fluorescente roja, DsRed, se somete a un rojo rápida a los cambios de color verde que evoca corta longitud de onda (lambda <760 nm), la irradiación de femtosegundos - un fenómeno que se basa la aplicación de DsRed como un "marcador óptica" de la sonda para el seguimiento de las células vivas, orgánulos, y proteínas de fusión. Este cambio de color selectiva los resultados de blanqueamiento de los "maduros" de color rojo que emiten especies de DsRed y un incremento de la emisión de los "inmaduros" las especies verdes, probablemente causado por dequenching de la transferencia de energía de resonancia fluorescente que ocurre dentro del tetrámero de proteína. Aquí, hemos examinado el papel de los residuos que se sabe que influyen en la velocidad y la integridad de la maduración de cromóforo en las propiedades celulares y biofísicos de los mutantes DsRed. Sorprendentemente, una mutación de un solo aminoácido (N42Q) con un aumento de las emisiones basal de color verde sin embargo, la maduración rápida cromóforo muestra un cambio de color multifotónica-evocó que era más brillante, más consistente, más vivo y más fácil de evocar a DsRed, a pesar de la mayor proporción de cromóforos verdes . Rápidamente mutantes de maduración con más madurez cromóforo completa, mostraron poco cambio de color y el aumento de la resistencia a la decoloración multifotónica. Se presenta mejores propiedades ópticas y biológicas de células de dos DsRed derivados de las variantes que exhiben en photolabeling estudios, y hablar de estos datos en términos de implicaciones para la resonancia de fluorescencia de energía basados en la transferencia de las sondas.
Actividad Del Receptor De IP3 Es Diferencialmente Regulada En El Retículo Endoplásmico Subdominios Durante La Maduración De Ovocitos
Los resultados de fertilización de competencia de la hormona inducida por la remodelación de los ovocitos en los huevos. Las vías de señalización que efecto de este cambio ejemplifican biestabilidad, donde la exposición hormonal breve cambia irrevocablemente el destino celular. En Xenopus, los cambios en Ca (2 +) de señalización como el epítome de la remodelación: El reversible de Ca (2 +) de señalización fenotipo de los ovocitos se adapta rápidamente para soportar la difusión irreversible de la fertilización de Ca (2 +) de las olas. En este sentido, al mismo tiempo resolver IP (3) del receptor (PI (3) I) la actividad con el retículo endoplásmico (RE) para diseccionar la estructura óptica de la arquitectura funcional de la Ca (2 +) aparato de liberación que sustenta esta reorganización. Se demuestra que los cambios en la Ca (2 +) se correlacionan con la señalización IP (3) la redistribución de la R especializados ER subestructuras llamadas laminillas annulate (AL), donde Ca (2 +) la actividad de esta publicación es atenuada, en el período de investigación (3) R-repletas de parches en la sala de emergencias cortical de los huevos que apoyan la fertilización Ca (2 +) de las olas. Estos datos muestran: en primer lugar, que la propiedad intelectual (3) sensibilidad de R se regula con la agudeza espacial alta incluso entre regiones contiguas a urgencias, y en segundo lugar, que la reorganización drástica de Ca (2 +) la dinámica de señalización puede ser impulsado por la redistribución subcelular en la ausencia de cambios en el número de canal o molecular o familiar de Ca (2 +) la diversidad de canales. Por último, estos resultados definen un nuevo papel para la Liga Americana en Ca (2 +) de señalización. Porque al son frecuentes en otros escenarios de rápida división celular, los estudios posteriores de su impacto en la Ca (2 +) de señalización están garantizados.
Celular De Señalización: Estimular La Entrada De Calcio
La identidad molecular de la señal de acoplamiento intracelular de Ca (2 +) agotamiento tienda a la activación de Ca (2 +) de entrada se ha resistido la exposición. Dos estudios recientes de forma independiente implicar a la familia de proteínas STIM como componentes esenciales en este acoplamiento. Estos datos proporcionan un nuevo impulso para resolver cómo almacén de Ca (2 +) el contenido se detecta y se comunicarán a almacenar funcionan con Ca (2 +) canales en la superficie celular.
Orientación Y El Tráfico De La Tiamina Transportador Humano-2 En Células Epiteliales
Los seres humanos carecen de vías bioquímicas para la síntesis de tiamina, por lo que los requisitos se cumplen a través de celulares específicas de las vías de captación mediada por portador. Dos proteínas de la familia del gen portador soluto SLC19A han sido identificados como transportadores de tiamina humanos (hTHTRs), los SLC19A1 (hTHTR1) y SLC19A2 (hTHTR2). Ambos de estos transportadores son co-expresados diferencialmente, pero dirigida en tipos de células polarizadas que intervienen en el transporte de tiamina vectorial (por ejemplo, el epitelio renal e intestinal). Es importante entender la estructura de dominios de estas proteínas, a saber, que las regiones dentro de la secuencia del polipéptido son importantes para la entrega fisiológica a la superficie celular, con el fin de comprender el impacto de las mutaciones clínicamente relevantes sobre el transporte de tiamina. Aquí hemos caracterizado los mecanismos que regulan hTHTR2 de distribución mediante métodos de imagen en vivo de células que se resuelven la dinámica de selección de beneficiarios y el tráfico de larga duración hTHTR2, una serie de mutantes de truncamiento hTHTR2, así como quimeras que componen el hTHTR1 y la secuencia de hTHTR2. Nos mostró los siguientes: (i) que el citoplasma COOH-cola de hTHTR2 no es esencial para la focalización apical en células polarizadas, (ii) que la entrega de hTHTR2 a la superficie celular es críticamente dependiente de la integridad de la columna vertebral de transmembrana del polipéptido de modo que truncamientos mínimos abrogar superficie celular expresión de hTHTR2, y (iii) las imágenes de vídeo de velocidad de hTHTR2 contiene vesículas intracelulares mostrados rápidos bidireccionales eventos de tráfico hacia y desde la superficie de la célula afectada por los microtúbulos interrumpir pero no microfilamentos agentes alteradores así como por la sobreexpresión de la subunidad dinactina dynamitin (p50). Finalmente, se comparó el comportamiento de hTHTR2 con la de hTHTR1 y la compañía humana folato reducido (SLC19A1) para destacar puntos comunes en la superficie de la célula mecanismos de focalización de la familia de genes toda SLC19A.
La Biotina Que Responden a Los Ganglios Basales Enfermedad Ligada Al Cromosoma-Las Mutaciones Inhibir El Transporte De Tiamina Via HTHTR2: La Biotina No Es Un Sustrato Para La HTHTR2
La tiamina soluble en agua de micronutrientes es necesario para el crecimiento del tejido y el desarrollo normal en los seres humanos. La tiamina se acumula en las células a través de la actividad de dos transportadores de tiamina de la superficie celular (hTHTR1 y hTHTR2), que están dirigidos diferencialmente en los tejidos polarizados. Disfunción mutacional de hTHTR1 se asocia con la condición clínica de tiamina-sensible anemia megaloblástica: los síntomas de la que se alivian por la suplementación de tiamina. Recientemente, dos hTHTR2 mutantes (G23V, T422A) se han descubierto en los linajes clínicos que se manifiestan biotina-responde la enfermedad de los ganglios basales (BBGD): los síntomas de lo que se ven atenuados por la administración de biotina. ¿Por qué entonces la mutación de una isoforma de tiamina transportador específico precipitar un trastorno corregible por la biotina exógena? Para investigar la sugerencia de que hTHTR2 fisiológicamente puede funcionar como un transportador de biotina, hemos examinado 1) la base de la célula biológica de hTHTR2 disfunción asociada con el G23V y mutaciones T422A y 2) la especificidad de sustrato de hTHTR2 y estos mutantes clínicamente relevantes. Se demuestra que el G23V y mutantes T422A tanto la actividad de transporte derogar tiamina en lugar de la orientación de hTHTR2 a la superficie celular. Además, la biotina acumulación no era detectable en células que sobreexpresan ya sea la hTHTR2 de longitud completa o los mutantes hTHTR2 clínicamente relevantes, sin embargo, era demostrable en el mismo ensayo utilizando células que sobreexpresan la humana dependiente del sodio transportador multivitamínico, un transportador de biotina conocida. Estos resultados ponen en duda la explicación más parsimoniosa para el fenotipo BBGD, a saber, que hTHTR2 es un transportador de biotina fisiológica.
Influjo De Calcio: Más Allá De 'actual' Biología
Una novela, en la superficie celular de proteínas esenciales para el Ca (2 +) de liberación activados por Ca (2 +) (CRAC) la función del canal ha sido identificado a través de independientes en todo el genoma pantallas. Este gran avance permitirá disección molecular del complejo canal CRAC, moviendo el campo más allá de la firma Icrac a la estructura.
Orientación Y El Tráfico Intracelular De Metástasis Clínicamente Importantes HTHTR1 Mutaciones En Líneas Celulares Humanas
La tiamina micronutrientes se requiere para el crecimiento y desarrollo normal de los tejidos humanos, y se acumula en las células a través de la actividad de los transportadores de membrana de plasma de tiamina, por ejemplo, hTHTR1 (transportador de tiamina humana 1). Pruebas genéticas recientes han relacionado mutaciones en hTHTR1 con la manifestación de TRMA (tiamina responde anemia megaloblástica), una enfermedad también se asocia con la diabetes mellitus, sordera neurosensorial y trastornos de la retina. Para examinar cómo las mutaciones en hTHTR1 poner en peligro la acumulación de tiamina, se ha estudiado la orientación y las propiedades funcionales de varios diferentes hTHTR1 mutantes en líneas celulares humanas derivadas de epitelio correspondiente a la tiamina o la absorción de los tejidos implicados en TRMA patología. Estas construcciones que abarca dos recién identificadas las mutaciones puntuales (P51L y T158R) y dos de truncamientos idénticos a los encontrados en TRMA linajes (W358X y Delta383fs) hTHTR1. Nuestros resultados muestran un espectro de fenotipos mutantes, subrayando que TRMA pueden resultar de disminución de la actividad de transporte de tiamina apuntalado por los cambios en hTHTR1 niveles de expresión, segmentación celular y / o actividad de transporte de proteínas.
El Inositol 1,4,5-trifosfato Receptor (Itpr) Familia De Genes De Xenopus: Identificación De Tipo 2 Y Tipo 3 Inositol 1,4,5-trifosfato Subtipos De Receptores
Los estudios realizados en el sistema modelo Xenopus han proporcionado información para el papel en el desarrollo del Ca2 + intracelular señales producidas por la activación de IP3Rs (inositol 1,4,5-trifosfato receptores). Sin embargo, a diferencia de los sistemas de mamíferos en tres subtipos IP3R han sido bien caracterizadas, nuestra comprensión molecular de los IP3Rs que sustentan Ca2 + de señalización durante la embriogénesis Xenopus se refieren únicamente a la caracterización original de clonado y purificado a partir de ovocitos de Xenopus laevis la 'Xenopus IP3R' hace varios años. En el presente estudio, hemos identificado el tipo de Xenopus 2 y 3 IP3Rs tipo e informar sobre la secuencia de larga duración, la arquitectura genómica y el perfil de expresión del desarrollo de estos subtipos IP3R adicionales. A la luz de los recursos genómicos y oportunidades emergentes para la manipulación genética en el diploide rana Xenopus tropicalis, estos datos facilitará la manipulación para resolver la contribución de la diversidad en IP3R Ca2 + señalización de eventos observados durante el desarrollo de vertebrados.
Vitamina B1 (tiamina) La Adopción Por El Pigmento De La Retina Epiteliales Humanas (ARPE-19) Las Células: Mecanismo Y El Reglamento
Retina anormal y alteraciones visuales se producen en la tiamina que responde a la anemia megaloblástica (TRMA), un trastorno autosómico recesivo causado por mutaciones en el transportador humano tiamina-1 (hTHTR-1). Las células del epitelio pigmentario de la retina juegan un papel fundamental en el suministro de tiamina en la retina metabólicamente muy activas, pero nada se sabe acerca de los procesos de mecanismo de regulación o biológicas implicadas en el transporte de tiamina en estas células. Para abordar estas cuestiones, hemos utilizado de origen humano epiteliales del pigmento retiniano células ARPE-19 para caracterizar el proceso de absorción de tiamina. La absorción de tiamina es la energía y depende de la temperatura, sensible al pH, Na +-independiente, saturable, tanto en el nanomolar (Km aparente, 30 + / - 5 nm) y el micromolar (Km aparente, 1,72 + / - 0,3 microM) los rangos de concentración , específico para tiamina y sensible a la inhibición grupo sulfhidrilo. La amilorida diurético causó una inhibición dependiente de la concentración en la absorción de tiamina, mientras que el fármaco anti-tripanosomas, el melarsoprol, no afectan el proceso de absorción. Tanto hTHTR-1 y 2-hTHTR se expresan en células ARPE-19, así como en el tejido humano nativo retina con la expresión de la primera es significativamente mayor que el de este último. La absorción de la tiamina se reguló de forma adaptativa por el nivel de sustrato extracelular a través de los mecanismos de transcripción mediada por las que participen tanto hTHTR-1 y hTHTR 2-, sino que estaba regulada también por un Ca2 + intracelular, calmodulina mediada por la vía. Imagen confocal de vivir células ARPE-19 que expresan TRMA asociados hTHTR-1 mutantes (D93H, S143F y G172D) mostró varios fenotipos de expresión. Estos resultados demuestran por primera vez la existencia de un proceso de absorción especializado y regulado por la tiamina en un modelo celular de epitelio pigmentoso de la retina humana que implica hTHTR-1 y 2-hTHTR. Además, las mutaciones clínicamente relevantes en hTHTR-1 conducen a la expresión alterada de la superficie celular o la función del transportador en la retina epiteliales 19 ARPE-células.
Caracterización Molecular De Una Novela Intracelular ADP-ribosyl Ciclasa
ADP-ribosil ciclasas son enzimas capaces de catalizar notables reacciones múltiples, incluyendo la síntesis de los mensajeros calcio nuevos y potentes intracelulares movilizadores, cíclico ADP-ribosa y NAADP. No todos los ciclasas ribosilo ADP-Sin embargo, se han caracterizado a nivel molecular. Además, aquellos que tienen se encuentran predominantemente en la superficie celular exterior y por lo tanto lejos de sus sustratos citosólicas.
Metas De La Unión Estrecha Y El Tráfico Intracelular De Occludin En Células Epiteliales Polarizadas
Occludin, uno transmembrana (TM)-que abarca la proteína, es un componente integral de los estrechos de unión (TJ) complejos que regulan la integridad epitelial y la función de barrera paracelular. Sin embargo, los determinantes moleculares que determinan la orientación occludin y entrega a los TJs siguen sin estar claros. En este caso, el uso de imágenes de células vivas de fragmentos amarillos fluorescentes occludin proteína marcada-, se resolvió el tráfico intracelular de proteínas de fusión occludin en polarizado de Madin-Darby de riñón canino y las células Caco-2 para delimitar las regiones dentro de la occludin polipéptido que son importantes para occludin dirigida a los TJs. En vivo confocal de imágenes de células mostró que el truncamiento total o parcial de la cola COOH-terminal de la occludin polipéptido no impidió occludin focalización a los TJs en líneas de células epiteliales. Truncamientos progresiva en la cola COOH-terminal de disminución de la eficacia de la expresión occludin; después de la eliminación de las regiones proximales al cuarto dominio transmembrana (TM4), la eficiencia de incremento en la expresión. Sin embargo, las supresiones adicionales en el TM4 abolido focalización TJ, lo que resultó en construcciones que fueron retenidas intracelularmente en el retículo endoplásmico. El occludin polipéptido de longitud completa de trata a la superficie de la célula dentro de una población heterogénea de vesículas intracelulares que occludin entregados a la membrana plasmática en los microtúbulos y la temperatura de forma dependiente. En contraste, la localización de estado estacionario de occludin en la superficie celular era dependiente de microfilamentos intactas pero no microtúbulos.
Membrana Apical De Focalización Y El Tráfico Humano De La Proton-junto Transporter En Epitelio Polarizado
El humano protón acoplado transportador de folato (hPCFT) es un transportador descubierto recientemente implicado en la absorción intestinal de folato en el epitelio (y posiblemente otras células). Poco se sabe actualmente acerca de la relación estructura-función de los diferentes dominios de este transportador, en particular, las regiones que son importantes para el transporte del sustrato, así como los ataques contra el transportador a la superficie celular apical de las células polarizadas. Aquí hemos investigado el papel del dominio COOH-terminal y una secuencia de transmembrana bien conservado de separación (TM) de los dominios TM2 y TM3 (DXXGRR; aminoácidos 109-114) especulado por los demás a ser importante para la función de transporte. Uso de imágenes en vivo enfoques celulares, nos muestran que 1) una construcción hPCFT amarillo proteína fluorescente se expresan funcionalmente en la membrana apical de dominio y se localiza diferente a la humana transportador de folato reducido, 2) la predicción de citoplasma COOH-terminal de la región no se hPCFT esencial para la orientación apical o la funcionalidad del transportador, y 3) las mutaciones que la ablación de un consenso de beta-a su vez separar la secuencia prevista TM2 y TM3 abolida apical [H (3)] la absorción de ácido fólico como consecuencia de la retención de retículo endoplásmico de mutantes mal plegadas, probablemente, los transportistas; celular y 4) la entrega superficie de hPCFT se ve interrumpida por la despolimerización de los microtúbulos, o por la sobreexpresión de la dynamitin dinactina complejo (p50). Por primera vez, nuestros datos presentan información con respecto a la estructura-función y la membrana de la focalización hPCFT polipéptido, así como los mecanismos que controlan su estado estacionario la expresión en células polarizadas.
Aumento De Fugas De Ca2 + Ca2 + ER Tiendas Inducida Por La Hepatitis C La Proteína NS5A
La hepatitis C no estructural 5A proteína (NS5A) es una Zn (2 +)-unión fosfoproteína esencial para la replicación viral. Expresión de NS5A perturba intracelulares de Ca (2 +) los niveles de un mecanismo no definido, la activación de factores de transcripción implicados en la patogénesis de las infecciones de hepatitis crónica. En este sentido, demuestran que la expresión regulada de NS5A aumenta la pérdida pasiva de Ca (2 +) a partir de un subconjunto del retículo endoplásmico (RE) de Ca (2 +) las tiendas. Esta acción no se replican mediante la expresión del NH anfipático (2)-membrana dominio de anclaje de NS5A solo, a pesar de la orientación a las membranas intracelulares. El agotamiento de la Ca-NS5A dirigida ER (2 +) tienda estaba impedido en condiciones de un amplio suministro de ATP sugiere compensatoria Ca (2 +) actividad de la ATPasa, pero observó en condiciones de insuficiencia y de ATP en las células intactas que expresan NS5A.
Poro Nuclear Desmontaje De Las Membranas Del Retículo Endoplásmico Promueve La Competencia De Señalización De Ca2 +
La funcionalidad del retículo endoplásmico (RE) como Ca (2 +) de almacenamiento de orgánulos con el apoyo de las familias de Ca (2 +), tampones bombas y canales que regulan la Ca (2 +) los flujos entre la luz del RE y el citosol. Aunque muchos estudios han identificado las heterogeneidades en Ca (2 +) los flujos de toda la sala de emergencia, la cuestión de cómo la funcionalidad diferencial de Ca (2 +) canales está regulado dentro de las regiones proximales del mismo orgánulo está sin resolver. En este sentido, se ha estudiado la dinámica en vivo de un subdominio ER conocido como láminas annulate (AL), una citoplasmática nucleoporin que contiene orgánulos ampliamente utilizado in vitro para estudiar los mecanismos de distribución envoltura nuclear. Se demuestra que los complejos de poros nucleares (NPC) dentro de Al suprimir local de Ca (2 +) la actividad de señalización, una influencia inhibidora aliviado por la disociación heterogéneo de nucleoporinas para producir desnudas NPC-dominios ER competentes en Ca (2 +) de señalización. En consecuencia, proponemos un nuevo papel generalizada para AL - Atenuación reversible de la actividad de la proteína residente - regulado de tal manera que AL (des) montaje a través de un ciclo de quinasa / fosfatasa permite a las células para apoyar a la ganancia rápida / transiciones de la pérdida de función en la fisiología celular.
N-glicosilación Se Requiere Para Na +-dependiente De La Funcionalidad De Transportador Vitamina C
El sodio-dependientes humano transportadores de vitamina C (hSVCT1 y hSVCT2) mediar la captación celular de ácido ascórbico. Ambos estos transportadores contienen sitios potenciales de N-glicosilación en sus dominios extracelulares (Asn-138, Asn-144 [hSVCT1]; Asn-188, Asn-196 [hSVCT2]), sin embargo la función de N-glicosilación en función del transportador ha sido explorado . Sobre la base del resultado que tunicamicina disminuyó C (14)-ascórbico la absorción de ácidos en las células HepG2, sistemáticamente ablated todas consenso de N-glicosilación en sitios hSVCT1 y hSVCT2 para resolver cualquier efecto sobre la absorción de ácido ascórbico, la expresión del transportador y la focalización. Se demuestra que la eliminación de individuales de N-glicosilación sitios deteriora significativamente la expresión de proteínas y, por consiguiente absorción de ácido ascórbico para hSVCT1 mutantes (N138Q es retenido intracelularmente) y para hSVCT2 mutantes (todos los cuales llegan a la superficie celular). N-glicosilación tanto, es esencial para la funcionalidad de la vitamina C transportador.
El Tiempo En El Celular De Ca2 + De Señalización
El calcio (Ca2 +) señales son generadas a través de una amplia variedad de intervalos. Consideraciones de impacto cinético cómo se procesa la información para codificar y decodificar señales de Ca2 +, la coreografía de las respuestas que aseguren la señalización específica y eficiente y la ampliación temporal de tal manera que en general efímeras señales de Ca2 + tiene valor fisiológico duradero. La importancia recíproca de los plazos para la señalización de Ca2 +, y Ca2 + de señalización para el momento se ejemplifica en los perfiles de alteración de la cinética de las señales de Ca2 + en ciertas enfermedades y el papel de la probabilidad basal de Ca2 + en las fluctuaciones de la percepción del tiempo.
Caracterización Molecular De Una Nueva Superficie De La Célula ADP-ribosyl Ciclasa Del Erizo De Mar
El erizo de mar es un sistema modelo ampliamente utilizado para el estudio de la señalización del calcio por el mensajero moléculas NAADP y cíclica de ADP-ribosa. Ambos son sintetizados por ADP-ribosyl ciclasas pero nuestra comprensión molecular de estas enzimas en el erizo de mar es limitada. Recientemente hemos informado de la clonación de una familia de erizos de mar ADP-ribosyl ciclasas y han demostrado que una de estas enzimas (SpARC1) está activo dentro del lumen del retículo endoplasmático. Estos estudios sugieren que la producción de mensajeros está compartimentado. Aquí caracterizar las propiedades de SpARC2. SpARC2 catalizada tanto NAADP y la producción cíclica de ADP-ribosa. Excepcionalmente, el sustituto de NAD, NGD era un mal sustrato. En contraste con SpARC1, heterologously expresó SpARC2 localizado en la membrana plasmática a través de un glicosilfosfatidilinositol (GPI) de anclaje. Las transcripciones de SpARC2 eran fácilmente detectables en los huevos de erizo de mar y la mayoría de la actividad unida a la membrana endógena fue encontrado para ser anclada a GPI. Nuestros datos revelan notables diferencias en las propiedades de los erizos de mar ADP-ribosyl ciclasas y proporcionan evidencia adicional de que la producción de mensajero puede ocurrir fuera del citosol.
Membrana De Orientación Y El Tráfico Intracelular Del Transportador De Multivitamin Humanos Dependiente De Sodio En Células Epiteliales Polarizadas
El ser humano de sodio dependientes de multivitamínicos transportista (hSMVT) es un mediador de sodio dependiente de la absorción de la biotina en el epitelio renal e intestinal. Hasta la fecha, sin embargo, no hay nada sabe acerca de la relación estructura-función o secuencias de direccionamiento en el hSMVT polipéptido que el control de su expresión polarizada dentro de los epitelios. Aquí, nos centramos en el papel de la cola COOH-terminal de hSMVT en la focalización y la funcionalidad de este transportador. Una de cuerpo entero hSMVT proteína verde fluorescente (GFP) proteína de fusión era funcional y expresado en la membrana apical de las líneas de células renales e intestinales. Los agentes que perturban microtúbulos interrumpido el tráfico de la movilidad de las vesículas y la prestación de deterioro de la superficie celular de hSMVT, lo que fue impedido también en las células tratadas con dynamitin (p50), brefeldin o monensina. Truncamiento progresivo de la cola COOH-terminal afectada la funcionalidad y la focalización de los transportistas. En primer lugar, biotina transporte disminuido en aproximadamente 20-30% en la eliminación de hasta 15 terminales COOH-aminoácidos de hSMVT, una disminución imitado únicamente por la eliminación del motivo terminal de PDZ (TSL). En segundo lugar, las supresiones en la cola COOH-terminal (entre los residuos 584-612, que contiene una región de gran superficie prevista la accesibilidad) dio lugar a una nueva caída en hSMVT transporte (aproximadamente el 40% de los de tipo salvaje). En tercer lugar la orientación, apical se perdió sobre la supresión de una región helicoidal con tendencia entre los aminoácidos 570-584. Llegamos a la conclusión de que la cola COOH de hSMVT contiene varios determinantes importantes para la orientación polarizada y biotina transporte.
Una Nueva Actividad Biológica De Praziquantel Que Requieren Voltaje Que Funciona Con Ca2 + Subunidades Beta Del Canal: Subversión De La Lombriz De Polaridad Regenerativa
Aproximadamente 200 millones de personas en todo el mundo las infecciones parasitarias puerto flatworm que causan la esquistosomiasis. Una sola droga praziquantel (PZQ)-ha servido como pilar para el tratamiento farmacológico de las infecciones por esquistosomas desde la década de 1980. Sin embargo, el objetivo relevante en vivo (s) de prazicuantel permanecen indefinidos.
Mecanismos De Doble De SHA 14-1 En Inducir La Muerte Celular a Través De Retículo Endoplasmático Y Mitocondrias
HA 14-1 es una molécula pequeña antagonista de Bcl-2 que promueve la apoptosis en las células malignas, pero su mecanismo de acción no está bien definido. Recientemente hemos informado de que HA 14-1 tiene una vida media de tan sólo 15 minutos in vitro, lo que nos llevó a desarrollar un análogo estable de HA 14-1 (HAs 14-1). El presente estudio caracteriza su modo de acción. Debido a la función antiapoptótica de la familia de proteínas Bcl-2 en el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias, el efecto de HAs 14-1 en ambos orgánulos se evaluó. HAs 14-1 inducida por la liberación de calcio ER en células humanas de leucemia dentro de 1 min, seguido por la inducción del factor de transcripción inducible por el estrés ER ATF4. Cinética similar y una mayor intensidad de la liberación de calcio ER fueron inducidos por el retículo sarcoendoplasmic Ca (2 +)-ATPasa (SERCA) thapsigargin inhibidor, acompañado por una cinética similar y la intensidad de ATF4 inducción. HAs 14-1 directamente inhibe la actividad enzimática SERCA pero no tuvo ningún efecto sobre el receptor de trifosfato de inositol. Evaluación de la vía mitocondrial mostró que sHA 14-1 provocó una pérdida de potencial transmembrana mitocondrial (delta psi m) y la activación débil caspasa-9, mientras que thapsigargin no tuvo ningún efecto. (ABT-737), una bien establecida de molécula pequeña antagonista de Bcl-2, induce rápidamente la pérdida de delta psi m y la activación de la caspasa-9, pero no tuvo efecto en la sala de emergencias. El inhibidor de pan-caspasa N-benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometil cetona tenía algún efecto protector sobre sHA 14-1 muerte celular inducida. Estos resultados sugieren colectivos un exclusivo mecanismo de doble objetivo de SHA 14-1 sobre los mecanismos de resistencia de apoptosis de las células tumorales que incluye antiapoptóticas Bcl-2 la familia de proteínas y proteínas SERCA.
Requisito Esencial Para Dos-poro Del Canal 1 En NAADP Mediada Por La Señalización Del Calcio
Fosfato ácido nicotínico adenina dinucleótido (NAADP) es una amplia y potente la movilización de calcio mensajero que es muy inusual en la activación de los canales de calcio se encuentran en las tiendas de ácidos. Sin embargo, la identidad molecular de la proteína diana no está claro. En este estudio, mostramos que los previamente no humanos de los poros de dos canales (TPC1 y TPC2) son proteínas endolisosómica, que NAADP mediadas por señales de calcio se ven reforzadas por la sobreexpresión de TPC1 y atenuada después de la caída de la TPC1, y que la mutación de una sola gran residuos conservados dentro de una región del poro supuesta derogó la liberación de calcio por NAADP. Por lo tanto, TPC1 es fundamental para la acción NAADP y es probable que la larga búsqueda de canales de destino para NAADP.
Localización Y Socialización: Perspectivas Desde El Barómetro De Experimentación En La Arquitectura Funcional De Los Receptores IP3
El inositol 1,4,5-trifosfato (IP) (3)-evocó Ca (2 +) muestra señales de una gran maleabilidad espacio-temporal. Esta maleabilidad depende de la diversidad, tanto en la organización celular y en la funcionalidad in situ de la propiedad intelectual (3) receptores (IP (3) R) que regulan el Ca (2 +) de liberación desde el retículo endoplásmico (RE). Recientes datos experimentales implica que estas consideraciones no son independientes, de tal manera que-al igual que con otros canales de iones, la organización local de IP (3) R afecta a su funcionalidad, y recíprocamente IP (3) la actividad de I afecta a su organización dentro de las membranas nativas de ER. En este sentido, (i) revisar los datos experimentales que conducen a la comprensión de la "arquitectura funcional" de la propiedad intelectual (3) R dentro de la sala de emergencia, (ii) proponer una terminología actualizada para cubrir la jerarquía de la organización de la propiedad intelectual (3) RS observados en la células intactas, y (iii) especulan sobre el significado fisiológico de la PI (3) la socialización R en Ca (2 +) la dinámica, y por lo tanto la necesidad emergente de estudios de modelización para ir más allá de simulaciones de malla, plano y estático de la propiedad intelectual (3) R agrupar aun más cortos plazos de experimentación.
Determinantes Moleculares Dictar La Superficie Celular Expresión De Lo Humano De Sodio Dependiente De La Vitamina C Transportador-2 En Células De Hígado Humano
El humana dependiente del sodio vitamina C transportador-2 (hSVCT2) juega un papel importante en la acumulación celular de ácido ascórbico en las células hepáticas. Sin embargo, poco se sabe acerca de los determinantes moleculares que hSVCT2 directa a la superficie celular de los hepatocitos. Hemos abordado este problema con métodos de imagen en vivo de células para resolver la distribución y el tráfico de truncado o mutado hSVCT2 construcciones en un modelo celular de los hepatocitos humanos, las células HepG2. Considerando que una de cuerpo entero hSVCT2-proteína fluorescente amarilla (YFP) proteína de fusión se expresa funcionalmente en la superficie celular en las células HepG2, truncamiento de serie y el análisis de la mutación demostrado jugar un papel esencial tanto para NH (2) - y COOH terminal de la secuencia (s) para la expresión de la superficie celular y la función. Video-tasa de imagen confocal mostraron evidencia de la dinámica hSVCT2-YFP contiene vesículas intracelulares de tráfico, la movilidad de los cuales se vio afectada la interrupción siguiente de los microtúbulos con nocodazole. Sin embargo, en una línea celular HepG2 expresan establemente hSVCT2-YFP en la superficie celular, los niveles plasmáticos de membrana de hSVCT2 no se vieron afectados por la inhibición de microtúbulos de proteínas asociadas a motor, sino que la expresión superficial de hSVCT2-YFP se aumentó después del tratamiento con inhibidores de la miosina. En conjunto, estos resultados muestran que 1) tanto en NH (2) - y las secuencias terminales COOH-son esenciales para la correcta localización de hSVCT2, 2) la entrega de la superficie celular es dependiente de microtúbulos intactos, y 3) regular los microfilamentos de periféricos de inserción y recuperación de hSVCT2 en la membrana plasmática.
Una Familia Deuterostome Ancestral De Dos Canales De Poro Media La ácido Nicotínico Adenina Dinucleótido Fosfato Dependiente De La Liberación De Calcio Desde Orgánulos ácidos
Fosfato ácido nicotínico adenina dinucleótido (NAADP) es un potente y generalizada movilización de calcio mensajero, cuyas propiedades han sido más ampliamente descritos en huevos de erizo marino. La base molecular para la liberación de calcio por NAADP, sin embargo, no está claro y sujeto a controversia. Estudios recientes han proporcionado evidencia de que los miembros del canal de dos de los poros (TPC) de la familia de los mamíferos son la larga búsqueda de canales de destino para NAADP. En este sentido, muestran que el gen TPC3, que aún no se ha caracterizado funcionalmente, está presente en todo el linaje deuterostome, pero es un pseudogen en los seres humanos y otros primates. Se presenta la clonación molecular del gen ancestral familia completa TPC del erizo de mar y demuestran que las tres isoformas localizar a orgánulos ácidas para mediar NAADP dependiente de la liberación de calcio. Nuestros datos ponen de relieve la divergencia funcional de esta familia de genes durante la evolución de la novela de deuterostome y proporcionar una prueba más de que media NAADP liberación de calcio de los almacenes ácidos través de la activación de los cursos de política comercial.
Dos Canales De Poros: La Regulación Mediante NAADP Y Funciones a Medida En Señales De Calcio Disparo
NAADP es un potente regulador de los niveles de calcio citosólico. Hay mucha evidencia que sugiere que NAADP activa un canal nuevo situado en una tienda de calcio ácido (lisosomal-like), la movilización de lo que resulta en la liberación de calcio más desde el retículo endoplásmico. Aquí, se discute la reciente identificación de una familia de canales iónicos (mal caracterizado los canales de dos de los poros) como receptores NAADP endo-lisosomal. La generación de señales de calcio por estos canales se asemeja a los evocados por la despolarización durante el acoplamiento excitación-contracción en el músculo. Se discute la idea de que dos canales de poro puede mediar una liberación de disparo de calcio que se amplifica por el calcio inducida por la liberación de calcio del retículo endoplasmático. Esto es similar a la activación de los canales de calcio sensibles al voltaje y la movilización posterior de sarcoplásmicas tiendas retículo de calcio en el tejido cardíaco. Le sugerimos que dos de los poros canales físicos pueden interactuar con los receptores de rianodina para dar cuenta de más de la emisión directa de calcio en el retículo endoplásmico en analogía con el acoplamiento de conformación de canales de calcio voltaje-sensibles y los receptores de rianodina en el músculo esquelético. La interacción de dos canales de los poros con otros canales de calcio de liberación probable que se produce entre las tiendas de "trans-cháchara" y, posiblemente, dentro de la misma tienda "cis-charla". También especulan que el tráfico de dos canales de poros a través del sistema endo-lisosomal facilita la interacción con los canales de entrada de calcio. Colocación estratégica de los dos canales de los poros por lo tanto proporciona un medio versátil de la generación de señales celulares espaciotemporalmente complejos de calcio.
Inositol (1,4,5)-trifosfato Formas Microarquitectura Del Receptor De Ca2 + Cinética Puff
Inositol (1,4,5)-trifosfato (IP receptores (3) R) liberación intracelular de Ca (2 +) como localizado Ca (2 +) señales (Ca (2 +) pulsaciones) que representan la actividad de un pequeño número de cluster PI (3) R espaciados a lo largo de la retículo endoplásmico. Aunque el énfasis se ha puesto mucho sobre la estimación del número de activos de Ca (2 +) los canales de liberación de apoyo Ca (2 +) bocanadas, menos atención se ha puesto en la comprensión del papel de la microarquitectura del clúster. Esto es importante ya que los datos recientes pone de relieve el carácter dinámico de la PI (3) R transiciones entre arquitecturas heterogéneas celulares y el comportamiento diferencial de la propiedad intelectual (3) R socializa en grupos. En este caso, se aplicó un modelo de alta resolución que incorpora estocásticamente IP de puerta (3) R dentro de un espacio frente al citoplasma de tres dimensiones para demostrar: 1), Ca (2 +) bocanadas son compatibles con una amplia gama de IP de clúster (3) R microarquitecturas , 2), del grupo formas ultraestructura Ca (2 +) las características de hojaldre, y 3), IP vagamente acorralados (3) grupos de investigación (> 200 la separación entre canales nm) no coordinan Ca (2 +) bocanadas, debido a la activación ineficiente y deterioro de acoplamiento debido a la reducción de Ca (2 +) inducida por Ca (2 +) velocidad de la microonda de liberación (menos de 10 nm / s) a lo largo de la matriz de canal. Consideraciones dinámicas microarquitectura por lo tanto, puede influir en Ca (2 +) de hojaldre ocurrencia / propiedades de las células intactas, lo que contrasta con un papel más mínimo para el número de canal en las mismas condiciones simuladas en la formación local de Ca (2 +) la dinámica.
Papel De Residuos De Cisteína En La Superficie Celular Expresión De La Riboflavina Transportador Humano-2 (hRFT2) En Las Células Intestinales
El B2 vitamina soluble en agua (riboflavina, RF) es un micronutriente esencial para la función celular normal y la supervivencia. Estudios recientes han identificado un papel para el ser humano riboflavina transportador-2 (hRFT2) en la absorción normal de RF intestinal. Sin embargo, poco se conoce sobre la biología de las células de este transportador y específicamente sobre el factor determinante molecular (s) que dicte su expresión en la superficie celular en las células epiteliales intestinales. Aquí nos muestran que la proteína de longitud completa hRFT2 fusionado a la proteína verde fluorescente (GFP) (GFP-hRFT2) se expresa exclusivamente en el dominio de membrana apical de las células Caco-2. COOH-terminal de la secuencia era esencial en el dictado de la expresión de la superficie celular con una función específica para los residuos conservados de cisteína (C463 y C467). La mutación de C463 y C467 ablacionada absorción de RF, explicada por la retención de las construcciones dentro del retículo endoplasmático. Análisis de modelos sugieren un puente disulfuro de potencial entre el C463 y el C386. De acuerdo con esta predicción, mutando el sitio C386 en el contexto del transportador de longitud completa como resultado la retención intracelular, mientras que la mutación de otro cisteína conservado (C326A) no tuvo efecto sobre hRFT2 focalización. El tráfico intracelular de hRFT2 También se examinó y pareció involucrar a distintas estructuras vesiculares, la motilidad de las vesículas depende críticamente de una red de microtúbulos intacta. Estos resultados demuestran un papel potencial para los residuos de cisteína específicos en la expresión en la superficie celular de la hRFT2 en humanos células epiteliales intestinales.
El Sistema Endo-lisosomal Como Ca NAADP Sensible ácida (2 +) De La Tienda: El Papel De Los Canales De Dos De Los Poros
La acumulación de pruebas sugiere que el sistema endo-lisosomal proporciona un almacén importante de Ca (2 +) que es aprovechado por el Ca (2 +)-la movilización de mensajero, NAADP. En este artículo se revisa la evidencia de que NAADP mediada por Ca (2 +) la liberación de este ácido Ca (2 +) el producto tienda a través de la activación de las recientemente descritas de dos canales de los poros (cursos de política comercial). Se discuten los avances recientes en la definición de la focalización sub-celular, la topología y la biofísica de los cursos de política comercial. También se discuten las funciones fisiológicas y la evolución de esta familia de canales de iones en todas partes.
Expresión Diferencial De Los Transportadores Humanos Riboflavina -1, -2 Y -3 En El Epitelio Polarizado: Un Papel Clave Para HRFT-2 En La Captación Intestinal De Riboflavina
El transporte de la riboflavina (RF) a través tanto de la membrana del borde en cepillo (BBM) y la membrana basolateral (BLM) del enterocito polarizada se produce a través de determinados mecanismos mediados por portadora. Aunque, tres transportadores humanos riboflavina (hRFTs), es decir, HRFT-1, HRFT 2-3-HRFT y se expresan en el intestino, se sabe poco sobre la superficie de la célula de dominio (s) en la que estos hRFTs específicos se expresan. En este caso, hemos utilizado imágenes de células vivas confocal del epitelio intestinal Caco-2 y las células renales MDCK para demostrar que la HRFT-1 se expresa principalmente en la BLM, HRFT-2 se expresa exclusivamente en la membrana apical, mientras que HRFT-3 se localizan en su mayoría en el interior intracelulares estructuras vesiculares (con alguna expresión en la BLM). Además, el nivel de HRFT-2 expresión del ARNm en células Caco-2 y en el intestino humano nativo es significativamente mayor que la de HRFT-1 y -3; HRFT-2 fue también más eficaz en el transporte de 3H-RF que HRFT-1 y - 3. Estos hallazgos implica un papel importante para HRFT-2 en la absorción de RF intestinal, una conclusión que fue apoyado por los resultados de HRFT-2 genes específicos de investigación de siRNA desmontables. Estos resultados muestran que los miembros de la familia HRFT son expresados diferencialmente en el epitelio polarizado, y que el apical expresado HRFT-2 juega un papel clave en la acumulación intestinal de RF.
Oponerse a Las Funciones De Los Dependientes De Voltaje Canales De Ca2 + En El Control Neuronal De Los Patrones Regenerativa
Hay un gran interés en el desarrollo de métodos para regular la proliferación y diferenciación de las células madre neuronales en los destinos a los efectos de la medicina regenerativa. Una forma de hacerlo es a través de la ingeniería farmacológica in vivo usando pequeñas moléculas. Sin embargo, un desafío clave es la identificación de las correspondientes vías de señalización y los objetivos de la misma druggable para manipular el comportamiento de células madre de manera eficiente en vivo. Aquí, se utiliza el gusano planaria como un modelo simple de tamizaje de química-genética para la regeneración del sistema nervioso para demostrar que la isoquinolina drogas prazicuantel (PZQ) actúa como una molécula pequeña neurogénica para producir animales de dos cabezas con CNSs integrados después de la regeneración. Caracterización de toda la familia de planaria tensión de accionamiento de Ca (2 +) canal α subunidades (Ca (v) α), seguido por in vivo ARNi de específica de Ca (v) subunidades, reveló que PZQ subvertido regeneración por la activación de un voltaje específico -gated Ca (2 +) del canal isoforma (Ca (v) 1A). PZQ-evocó Ca (2 +) a través de la entrada de Ca (v) 1A servido para inhibir las señales de Hedgehog neuronalmente derivados, como lo demuestran los datos que muestran que el ARNi de Ca (v) 1A prevenir la bipolaridad PZQ evocada, Ca (2 +) de entrada, y disminuye en Wnt1 y wnt11 5-niveles. Sorprendentemente, la acción de PZQ se opone por Ca (2 +) afluencia a través de una estrecha relación neuronal de Ca (v) isoforma (Ca (v) 1B), se establece una interacción entre novela específicos Ca (V) 1 isoformas de canal, Ca (2 +) la entrada, y las neuronas de señalización de Hedgehog. Estos datos mapa eficacia PZQ a específicos neuronales Ca (v) los complejos in vivo y subrayar que ambos activadores (Ca (v) 1A) e inhibidores de (Ca (v) 1B) de Ca (2 +) afluencia puede actuar como molécula pequeña en neurogenics vivo en cuenta el acoplamiento único de Ca (2 +) canales a las señales de polaridad neuronalmente derivados.
Fotoafinidad Etiquetado De ácido Nicotínico Adenina Dinucleótido Fosfato (NAADP) Objetivos En Células De Mamíferos
Fosfato ácido nicotínico adenina dinucleótido (NAADP) es un segundo mensajero agonista generado que libera Ca (2 +) intracelular de Ca ácida (2 +) las tiendas. La evidencia reciente ha identificado los canales de dos cursos de política comercial (los poros) en el sistema de endolisosómica como NAADP regulados por Ca (2 +) que la liberación de los canales de organoides Ca (2 +) en respuesta a NAADP. Sin embargo, poco se sabe acerca de la NAADP acoplamiento mecanismo obligatorio para la liberación de calcio. Para identificar el sitio de unión NAADP, se empleó un método de marcaje de fotoafinidad utilizando un photoprobe radiactivos basada en 5-azido-NAADP ([P (32)-5N (3)] NAADP) que exhibe alta afinidad de unión a los receptores NAADP. En varios sistemas que son ampliamente utilizados para el estudio de NAADP-evocó Ca (2 +) de señalización, incluyendo huevos de erizo marino, líneas de células humanas (HEK293, SKBR3) y el páncreas de ratón, 5N (3)-NAADP selectivamente los sitios etiquetados bajo peso molecular que exhibió la farmacología de diagnóstico de NAADP sensible a Ca (2 +) de liberación. Sorprendentemente, no hemos podido demostrar el etiquetado de los endógenos, o sobreexpresado, cursos de política comercial. Además, el etiquetado de los sitios de alta afinidad de unión NAADP fue preservado en muestras pancreáticas de TPC1 y TPC2 ratones knock-out. Estos datos sugieren que photolabeling un componente accesorio dentro de un complejo mayor TPC es responsable de NAADP unión que es única desde el canal propio núcleo. Esta observación obliga a la evaluación crítica de los modelos actuales de NAADP desencadenada por la activación de la familia de TPC.
Fotoafinidad Etiquetado De Fosfato De Alta Afinidad De ácido Nicotínico Adenina Dinucleótido (NAADP)-proteínas De Unión Del Huevo De Erizo De Mar
Fosfato ácido nicotínico adenina dinucleótido (NAADP) es un mensajero que regula la liberación de calcio intracelular en las tiendas de ácidos. Estudios recientes han identificado dos canales de los poros (cursos de política comercial) como canales endolisosómica que están regulados por NAADP, sin embargo, la naturaleza del sitio receptor NAADP unión es desconocida. Para estudiar más sitios de unión NAADP, se han sintetizado y caracterizado [(32) P-5-azido] adenina dinucleótido ácido nicotínico fosfato ([(32) P-5N (3)] NAADP) como una sonda fotoafinidad. Fotólisis de erizo de mar huevo homogeneizado preincubaron con [P (32)-5N (3)] NAADP resultó en el etiquetado específico de 45 -, 40 -, y 30-kDa proteínas, que fue impedido por la inclusión de concentraciones nanomolares de etiqueta NAADP o 5N (3)-NAADP, pero no por las concentraciones micromolares de nucleótidos estructuralmente relacionados, como NAD, dinucleótido de adenina ácido nicotínico, nicotinamida mononucleótido, ácido nicotínico, nicotinamida o. [P (32)-5N (3)] NAADP unión era saturable y se muestran alta afinidad (K (D) ~ 10 nm) en experimentos tanto de unión y photolabeling. [P (32)-5N (3)] photolabeling NAADP era irreversible en un alto K (+) tampón, una característica distintiva de NAADP obligatorio en el sistema de huevo. Las proteínas photolabeled por [P (32)-5N (3)] NAADP tienen masas moleculares más pequeñas que el cursos de política comercial de erizo de mar, y los anticuerpos a cursos de política comercial no se detecta ninguna inmunoreactividad que comigrates ya sea con el 45-kDa o de las proteínas de 40 kDa photolabeled . Curiosamente, los anticuerpos a TPC1 y TPC3 fueron capaces de inmunoprecipitar una pequeña fracción de la 45 - y 40-kDa photolabeled proteínas, lo que sugiere que estas proteínas se asocian con cursos. Estos datos sugieren que los sitios de alta afinidad de unión NAADP son distintos de los cursos de política comercial.
