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Articles by Joseph C. Corbo in JoVE
JoVE Neuroscience
の活動の定量化シス調節エレメント
Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine
このプロトコルは、外植片のエレクトロポレーションを使用してマウスの網膜を生体内でのシス調節エレメント（例えば、エンハンサー/プロモーター）の活性を定量化するための簡単で安価な方法を説明します。 DNA調製、網膜切開、エレクトロポレーション、網膜移植片培養、およびポスト固定分析と定量化が説明されています。
Other articles by Joseph C. Corbo on PubMed
Doublecortinは、海馬の積層ではなく新皮質のためにマウスが必要です
Doublecortin（DCX）は、ヒトの正常皮質と海馬の開発に必要な微小管関連蛋白質である。ヘテロ接合の女性は通常の皮質下と同様見当違い（異所性）ニューロンの第二のバンドと一緒にモザイクの表現型を示すのに対し、X連鎖人間DCX遺伝子の変異は、ヘミ接合男性で総新皮質の解体を（滑脳症または "スムーズな脳"）を引き起こす皮質（ "二重皮質症候群"）。我々は、DCX遺伝子の標的変異を有するマウスを作成しました。ヘミ接合男性DCXマウスは、重度の出生後の致死性を示す;大人に生き残ることがいくつかは、可変肥沃である。 DCX変異マウスは、野生型から大部分は区別がつかない新皮質の積層を示し、新皮質の神経や神経移行の正常なパターンを示しています。対照的に、ヘテロ接合雌とヘミ接合男性の両方の海馬では、CA3領域の中で最も深刻な中断ラミネーションを示しています。行動テストでは、海馬の学習の赤字は異常な細胞構築を伴うことを示唆し、コンテキスト、およびキューさ恐怖条件付け試験における欠陥を示しています。
強化されたS-錐体症候群のマウスモデルにおいて、桿体と錐体の遺伝子の両方を発現するハイブリッド光受容体
桿体と錐体光受容体はそれぞれ、薄暗い、明るい光条件の下でのビジョンを補助する。それらの機能の違いは、それらの異なる遺伝子発現パターン、形態、シナプス接続性に起因すると考えられている。本研究では、網膜変性7（RD7）変異マウス、ヒトの強化S-錐体症候群（ESCS）のモデルの視細胞を調べた。この変異体はNR2E3マウスのオルソログ、ESCSにおいて変異孤児核内受容体転写因子で自発的削除を運びます。マイクロアレイを用いるとin situハイブリダイゼーション解析で我々はRD7網膜の緩やかに増加した番号S-オプシン発現顕通常のコーンに見える細胞が含まれていることを発見した。驚くべきことに、RD7網膜の光受容体の大半は、ロッドと円錐特異的遺伝子の両方を発現する形態学的にハイブリッドセルの種類を表しています。さらに、遺伝子のin situハイブリダイゼーションスクリーニングに特異的にグルコース/グリコーゲンに関与する2つの遺伝子を含む生化学的機能の広い範囲で10種類の新しいコーン固有または円錐豊富な遺伝子を同定したマイクロアレイでRD7変異体網膜にアップレギュレートされることが示され代謝。我々は、ESCSと人間に見られる異常な電図、遅い網膜変性、網膜異形学は、部分的には、本研究で同定されたものと同様のハイブリッド光受容体細胞型の異常な機能に起因する可能性があることを示唆している。ここで同定された新規円錐特異的遺伝子の機能的多様性ははるか以前に発見されたものを超えて延長ロッドとコーンの間の分子の違いを示しています。
神経細胞の移動と軸索伸長にDoublecortinとDoublecortin様キナーゼ間の遺伝的相互作用
人間doublecortin遺伝子（DCX）の変異は、皮質ニューロン移動の深遠な欠陥を引き起こすが、マウスにおけるDCXの遺伝子欠失は、穏やかな欠陥を生成します。第二遺伝子座、doublecortin様キナーゼ（DCLK）は、DCXを補償することができる同様の "doublecortinドメイン"と微小管安定化特性を持つタンパク質をコードしている。ここでは、明白な遊走異常を生じないDCLKの変異でマウスを生成しますが、DCXとDCLKの両方の変異マウスは周産期死亡率、解体新皮質の階層化、そして深い海馬細胞構築の解体を実証することを示している。驚くべきことに、DCX（ - / Y）; DCLK（ - / - ）変異体は、脳梁、前交連、皮質下の繊維の管、および内部カプセルに影響を与え、広範な軸索の欠陥を持っています。 DCX / DCLK欠損解離ニューロンは、シナプス小胞タンパク質の軸索輸送の欠陥で、異常な軸索伸長、樹状構造を示しています。 DCXとDCLKは、直接または間接的に微小管ベースの小胞輸送、細胞移動と軸索伸長の両方に重要なプロセスを調節することができます。
マウスの光受容体の遺伝子発現パターンの類型
光受容体に富んだ遺伝子の突然変異は、ヒトの網膜疾患の多数に関与している、まだ、桿体と錐体の遺伝子発現パターンの系統的な分析が行われていません。さらに、多くの網膜疾患の罹患率のための錐体視の損失のアカウントが、比較的少数の錐体特異的遺伝子が知られている。本研究では、光受容体遺伝子発現の類型論を確立し、新たなコーンを識別するためにマイクロアレイとコーンに棒の一斉転換を示しています。マウス神経網膜ロイシンジッパー遺伝子（NRL）変異体のin situハイブリダイゼーション解析の実施特異的遺伝子。我々は18の新しいコーンに富む遺伝子、uncloned網膜疾患遺伝子座の近くにどのマップのいくつかの合計を発見しました。これらの遺伝子のいくつかは、短期または中期波長オプシンに似た式の背腹（DV）のパターンを持っています。我々は、背側と腹側マイクロダイセクションWT網膜のマイクロアレイ解析を行い、非対称分布で追加の光受容体遺伝子を発見した。全体として、我々は多くのロッドとコーン共発現の度合いを表示した状態で、感光体の遺伝子がロッド特有の円錐から固有に発現スペクトル上に落ちることがわかった。これらの発現パターンは、確実に単独でマイクロアレイデータから予測することができます。我々の結果は、光受容体のこれらの2つのクラス間の生理的な違いが根底にあるロッドとコーンの間に決定的な分子の違いを示しています。
発散臨床プレゼンテーションとPallidoluysionigral変性症および筋萎縮性側索硬化症の家族形態
我々は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）と前頭側頭型認知症（FTD）ではなくpallidoluysionigral変性を含む異常な神経病理学的特徴と機能を備えた急速進行性神経変性疾患を持つ家族について説明します。発端者は無言症に発展しました原発性進行性失語症と発表した。彼はその後、軽度の脱抑制とパーキンソニズムと痴呆を開発し、疾患の後期には、運動ニューロン疾患の証拠を示した。他の2つのケース（発端者の母親と母方の叔父）が排他的にALSの機能を持っていた。すべての3つの症状の発症から4年の死亡までの平均時間を持つ若い発症（第四十）と急速な臨床経過を持っていた。発端者と彼の叔父の死後神経病理学的検査は、神経原線維変化、ユビキチン介在物、または小脳の歯状核で検出可能な異常はなく、ALSの変更や大規模なpallidoluysionigral変性を示した。神経病理学的特徴のこの例外的な組み合わせが散発的ALS-FTDのまれなケースで説明してきたが、全く家系はこれまで報告されていません。このファミリーの2影響を受けたメンバーでは、脱力感、運動障害、またはALS、FTD、選択した脊髄小脳性運動失調、及びハンチントン病を含む認知症に関連付けられている遺伝子に変異を同定するために失敗しました。したがって、この疾患は臨床症状が一般的な神経病理学的特徴のスペクトルを有する新規な常染色体優性遺伝と急速に進行性の神経変性疾患を表すことができる。
哺乳類の光受容体転写ネットワークのシス調節ロジック
網膜の視細胞は、人体内の他の細胞型より遺伝性疾患のより多くの対象になります。 120以上のクローン化された人間の失明の遺伝子の大半は非常に光受容体で表されます。これらの疾患を理解するための統合的な枠組みを確立するために、我々は哺乳類の光受容体転写因子、CRX、NRL、およびNr2e3によって制御されるネットワークの実験的および計算の分析を実施している。マイクロアレイを用いてin situハイブリダイゼーションデータセットに我々は、多くの網膜疾患の遺伝子座だけでなく、以前に未知の光受容体の転写因子を含む600以上の遺伝子が含まれているこのネットワークのモデルを作成しています。このネットワークの接続性を解明するために、我々はこれらの転写因子とその標的遺伝子間の相互作用を仲介する光受容体固有のシス調節エレメント（CRES）を識別するための計算アルゴリズムを考案した。私たちの計算予測のin vivoでの検証では、網膜疾患遺伝子の近くに19の新規光受容体固有のCRESの発見をもたらした。これらのCRESの検討は、高レベルの式に関連付けられているシンプルなシス調節文法規則の定義を許可した。このルールの一般性をテストするために、我々は、in silicoでのランダムなDNA配列から、感光体CRESを発展させるために選択フィルタとしての拡張形式を使用していました。蛍光レポーターに融合したときに、これらの進化したCRESは、in vivoで強力な、光受容体特異的発現を行なった。この研究は、哺乳類の神経細胞の種類の最初の系統的な同定とCRESのin vivoでの検証のを表しており、光受容体転写制御のシステム生物学の基礎となります。
感光体や遺伝子治療の展望の遺伝性疾患
網膜の光受容体細胞は、遺伝性疾患の広い範囲の対象となります。このレビューは、感光体に富んだ遺伝子の突然変異によって引き起こされる網膜疾患の重要なグループに関する現在の知識をまとめたものです。さらに、アデノ随伴ウイルスの遺伝子治療を介した動物モデルでこれらの疾患の様々な治療に向けた進捗状況が説明されています。ない人間の臨床試験はまだ光受容体に富んだ遺伝子の突然変異によって引き起こされる疾患を治療するために開始されていないが、アデノ随伴ウイルスの遺伝子治療を使用して、これらの疾患を治療の見通しについては楽観大量のがあります。
継承可能な失明のための遺伝子治療ベクターの設計におけるシス調節エレメントの役割
遺伝性網膜疾患は、現在約200の異なった遺伝子座を含むことが知られています。ウイルスベースのベクターを用いた動物モデルの遺伝子治療を介して網膜疾患の治療に著しい最近の進歩がありました。網膜疾患の大部分はいくつかの細胞型のいずれかに影響を与えます。治療を必要としている細胞に特異的に救助導入遺伝子の発現を標的とするためには、これらの細胞に特異的に導入遺伝子の発現を駆動するためのシス調節エレメント（CRE）を採用する必要があります。
鳥類の錐体光受容体のタイル網膜ファイブ独立、自己組織化モザイクとして
鳥類の網膜は、脊椎動物の中で最も洗練された錐体視システムのいずれかを持っています。鳥はtetrachromatic色覚と無彩色の動きの知覚を媒介すると考えられているダブルコーンをサポートする4つのシングルコーン、コーンを含む5つのタイプがあります。この豊かさにもかかわらず、ほとんどが鳥の円錐とその適応的意義の空間的な組織について知られている。ここでは、鶏の5のコーンタイプと同じタイプのコーンの間に特徴的な間隔で高度に秩序化されたモザイクとして独立してタイル網膜を示している。トポロジカル秩序の対策が可能動き検出におけるそれらの断定的な役割を反映して、ダブルコーンがより高度に秩序化されたシングルコーンよりであることを示している。コーンは、細胞タイプに固有のものです間隔の相互作用を示すが、すべてのコーンタイプが同じ密度に依存しintercone距離を測定する尺度を使用しています。我々は、これらの観測を考慮することができる簡単な発達モデルを提案する。我々はまた、単一のパラメータ、グローバルな規則性指数は、すべての5つの円錐形のモザイクの規則を定義していることを示しています。最後に、我々はこれらのパターンの原則が鳥の間で普遍的なものであることを示唆し、さらに3つの鳥種で同様の円錐分布を示しています。定期的な光受容体の間隔が視覚的な空間の一様サンプリングのための非常に重要ですので、鳥類の網膜の錐体モザイクは、個々の光受容体間の単純な局所的相互作用による二次適応グローバルパターニングの出現のエレガントな例を表しています。我々の結果は、強化された色弁別のために鳥類の網膜の様々な適応をもたらした進化の圧力が、色と輝度のその空間サンプリングを微調整するために行動したことを示しています。
CRXのChIP-seqはマウスの光受容体のシス調節アーキテクチャを明らかに
哺乳動物のDNAの約98％は非コードですが、まだ我々は、ゲノムのこの謎めいた部分の機能については比較的少ない理解しています。制御遺伝子の発現は非コード領域に存在し、組織特異的転写因子の結合部位をマッピングすることによって識別することができるシス調節エレメント。円錐ロッドホメオボックス（CRX）は、感光体の分化·生存に重要な転写因子であるが、その生体内ターゲットに不明な点が多い。ここでは、成体マウスの網膜の光受容体遺伝子の周囲のシス調節領域の数千を識別するために、CRXに超並列シーケンシング（CHIP-SEQ）とクロマチン免疫沈降法を使用していました。 CRXは、直接各遺伝子座の周り空間的に分散調節要素のネットワークを経由して下流の光受容体転写因子とその標的遺伝子を調節する。 CRX-結合した領域は、転写を活性化し、微調整する転写レベルに間隔と方向依存的に相互作用する複数のCRXの結合部位を含むように相乗的な方法で行動する。 （ - / - ）錐体光受容体の濃縮ソースを表す網膜、CRXのChIP-seqのは、NRLで行われた。野生型のChIP-seqのデータとの比較は、多くのロッドとコーン特有のCRX-バインドされた地域だけでなく、多くの共有要素を識別し設定します。したがって、CRXは組合せ的ほとんどの網膜疾患の遺伝子を含む光受容体遺伝子の発現を調整することによってロッドとコーンの両方の転写ネットワークを調整します。加えて、本研究では、ピンポイントでメンデルと複合型の両方網膜疾患との関連性の非翻訳領域の何千もの。
FAM161A原因でナンセンス変異はRP28に関連した劣性網膜色素変性症
網膜色素変性症（RP）は進行性の視力低下にと、多くの場合、最後の段階で法的な失明につながる網膜の変性疾患である。 RP28遺伝子座は、常染色体劣性RP（arRP）を分離する大規模なインドの家族の中でホモ接合性マッピングによる2番染色体短腕に1999年に割り当てられています。クロマチン免疫沈降法とゲノムDNAの並列シーケンスを組み合わせたアプローチに続いて、我々は、元RP28血統から患者にホモ接合性のナンセンス変異（p.Arg229X）を運ぶことが示された遺伝子、FAM161Aを同定した。別のホモ接合FAM161A停止変異（p.Arg437Xは）118明らかに無関係なドイツのRP患者のコホートから3科目で検出された。これらの患者の発症年齢は50歳代の重度視覚障害者、七十年に6回には法的な失明で、20代の2番目であった。 FAM161Aは、比較的高いレベルで網膜で発現させ、未知の関数の推定76 kDaのタンパク質をコードする、系統発生的に保存された遺伝子である。クロマチン免疫沈降法と植網膜上の器官レポーターアッセイにより示されるように、マウスの網膜では、Fam161a mRNAは、発達、転写因子CRXによって規制され、制御されています。 Fam161aタンパク質は、開発中に視細胞に局在し、大人の動物で、それは内側のセグメントと同様に網膜外網状層、光受容体とその遠心性ニューロン間のシナプスのインターフェースに存在しています。一緒に、我々のデータはFAM161Aのヌル変異はRP28関連arRPの責任であることを示している。
リスクと10q26 AMD軌跡の影響ARMS2 MRNA発現における非リスクに関連した変異体が、タンパク質欠乏による病原性の影響を除外します。
10q26の15の亜種は強い連鎖不平衡にあり、加齢黄斑変性症（AMD）のリスクの増加、先進国における失明の頻繁な原因に関連付けられています。これらの変異体は、タグの遺伝子ARMS2（加齢黄斑変性症感受性2）とHTRA1の一部（HtrAセリンペプチダーゼ1）を包含する単一のリスクハプロタイプを。 10q26における真のAMD感受性遺伝子を定義するには、いくつかの研究はARMS2および/またはHTRA1の発現リスク対立遺伝子の影響に焦点を当てているが、結果は一貫していない。ゲノムARMS2亜種の異種発現によって、私たちは現在、リスクハプロタイプから転写ARMS2 mRNAレベルは有意に非リスクmRNAアイソフォームと比較して減少していることを示している。バリアントARMS2構造を分析し、この効果は、特にARMS2の3'-非翻訳領域で知られている挿入/欠失多型（C.（）372_815del443ins54）に割り当てることができます。 HTRA1プロモーター配列とレポーター遺伝子アッセイは、転写開始部位のさらに上流にミュラーグリア固有のシス調節領域の存在を実証した。しかし、AMDのリスク対立遺伝子は、網膜におけるHTRA1プロモーター活性にほとんど、あるいはまったく影響を与えなかった。人間の死後網膜/リスクハプロタイプのヘテロ接合体網膜色素上皮のサンプルの大規模な一連の分析は、in vitro / ex vivoでの結果で確認し、リスクハプロタイプはARMS2なくHTRA1 mRNA発現に影響を及ぼすことを実証した。さらに、我々は一般的な非リスクに関連する非同義変異（rs2736911）もARMS2転写レベルを減少につながることをin vivoでの証拠に提供しています。したがって、我々のデータはARMS2タンパク質欠乏による病原作用は、AMDの病理を説明するためにそうあることを示唆している。
ヘテロ接合性のNotchの損失は血管腫瘍とマウスにおける致死出血を引き起こす
腫瘍の発生におけるNotchシグナル伝達経路の役割は、癌遺伝子としてまたはコンテキスト依存の方法で腫瘍抑制因子としてどちらたNotch1の機能で、複雑です。さらに腫瘍の開発にNotch1の役割を定義するために、我々は体系的に生体内でのNotch1の腫瘍抑制活性のために調査した。我々は、前述たNotch1の膜内タンパク質分解CRE（Nip1 :: CRE）たNotch1のヘテロ接合性の散発的な、低周波損失のマウスモデルを作成するfloxedたNotch1の対立遺伝子と対立遺伝子を組み合わせた。このアプローチを通じて、我々はほとんどのたNotch1の損失によって影響を受ける細胞の種類を決定した。我々は、Notch1の損失が広範囲に血管腫瘍および大量出血に続発する生物の致死性を引き起こしたと報告している。これらの知見は、血管系の抑制腫瘍におけるNotchのための細胞自律的な役割を反映し、内皮細胞の悪性形質転換のメカニズムを探求するこれによってモデルを提供します。重要なのは、これらの結果は、内皮のためのメカニズムベースの毒性のNotch経路は、特にそれらの標的たNotch1を標的薬の慢性的なアプリケーションの安全性に関する懸念を提起。我々の戦略は、広くその経験たNotch1の活性化前駆細胞内の任意の条件付きの対立遺伝子のヘテロ接合体のin vivoでの損失に散発的な誘導するために適用することができます。
Exomeシーケンシングとシス調節マッピングは網膜色素変性症の原因として、MAK、繊毛の長さの調節因子をコードする遺伝子の変異を同定
exomeシーケンスのデータを分析の基本的な課題は、バックグラウンドの多型から病原性の変異を区別しています。遺伝的異質性疾患、網膜色素変性症（RP）のコンテキストでこの問題に対処するため、我々は、候補遺伝子をランク付けする光受容体転写因子CRX用CHIP-SEQデータを利用したシス調節マッピングと呼ばれる候補遺伝子の優先順位付けの戦略を考案した。このアプローチを組み合わせるExomeシーケンシングは、RPと血族のトルコの家族の単一の影響を受ける部材の雄性生殖細胞に関連するキナーゼ（MAK）のホモ接合性のナンセンス変異を同定した。 MAKはその機能が人間に毛藻類、クラミドモナスから、保存されている繊毛関連マイトジェン活性化プロテインキナーゼをコードしている。マウスや他のモデル生物のオルソログMAKの変異が、マウスでは、急速な光受容体変性が異常に長い毛になります。 RPの追加の個人のその後の配列解析は、MAKのミスセンス変異を持つ5発端者を同定した。これらの変異の二つは、すべての既知のキナーゼに保存されているアミノ酸を変更、およびin vitroキナーゼアッセイにおけるキナーゼ活性の損失は、これらの突然変異の結果を示しています。したがって、キナーゼ活性は、ヒトのMAKの機能にとって重要であると思われる。本研究では、光受容体の毛様体の遺伝子の直接の転写調節因子としてCRXのために以前に過小な役割を強調しています。さらに、それはexomeデータから優先順位の候補遺伝子でCRX-ベースのシス調節マッピングの有効性を示し、この戦略は一般的に網膜疾患の範囲に適用可能であるべきであることを示唆している。
神経網膜ロイシンジッパー（NRL）、視細胞の運命決定因子の転写調節
転写因子神経網膜ロイシンジッパー（NRL）は、桿体細胞の運命とロッド分化のキーレギュレータの重要な決定要因である。 NRL（ - / - ）ロッド前駆体は、ロッドの遺伝子をオンにし、代わりにコーンのように区別するために失敗します。さらに、ヒトのNRLの変異は網膜色素変性症の原因となります。この遺伝子の発達と臨床的意義にもかかわらず、少しはNRL自体の転写調節についてはほとんど知られていない。本研究では、cis-及びマウス網膜におけるNRLの転写の開始と維持に責任をトランス作用因子を定義しようとした。定量的なマウス網膜植エレクトロポレーションアッセイを利用して、我々はNRLのプロモーター活性のために必要とされる転写開始部位のすぐ上流の系統発生的に保存され、30塩基対の領域を発見しました。この領域は、網膜の転写因子CRX、OTX2、とRORβの結合部位が含まれており、これらのサイトでの点変異は完全に生きている網膜にプロモーター活性を廃止する。 ChIP実験は、生体内で重要な領域にCRXとOTX2の結合を示すのに対し、ゲルシフト実験は、CRX、OTX2、とRORβは、in vitroでの重要な領域に結合することができることを示している。したがって、我々の結果は、CRX、OTX2、とRORβ直接NRLのプロモーター内の重要な部位に結合することによって、NRLの転写を調節することを示しています。我々はNRL式は主にOTX2とRORβによって開始され、後でCRXとRORβによって高いレベルで維持されたモデルを提案する。
