Analyse De La Série étiquettes De Séquences Ribosomiques (SARST): Une Méthode à Haut Débit Pour Le Profilage Des Communautés Microbiennes Complexes

Environmental Microbiology. Feb, 2004  |  Pubmed ID: 14756878

Deux décennies de la culture-études indépendantes ont confirmé que les communautés microbiennes représentent la piscine la plus complexe et concentré de la diversité phylogénétique sur la planète. Il reste un besoin pour des outils innovants moléculaires qui peuvent approfondir nos connaissances de la diversité microbienne et de ses implications fonctionnelles. Nous présentons la méthode et l'application de l'analyse en série de marqueurs de séquence ribosomique (SARST) comme un nouvel outil pour élucider les communautés microbiennes complexes, tels que ceux trouvés dans les sols et les sédiments. Analyse sérielle des étiquettes de séquences ribosomiques utilise une série de réactions enzymatiques d'amplifier et de ligaturer étiquettes de séquences ribosomiques (EAR) à partir de bactéries petite sous-unité gène de l'ARNr (SSU ADNr) V1-régions en concatémères qui sont clonés et séquencés. Cette approche offre une augmentation significative du débit sur les bibliothèques traditionnelles SSU ADNr clone, comme jusqu'à 20 EAR sont obtenus à partir de chaque réaction de séquençage. Pour tester et mesurer SARST le biais associé à cette approche, les bibliothèques de la TVD ont été préparés à partir d'un mélange défini de cultures pures et des échantillons d'ADN en double arctiques du sol. La distribution TVD reflète la composition théorique du mélange original défini. Les données provenant des bibliothèques du sol en double (1345 et 1217 EAR, avec 525 et 505 EAR uniques, respectivement) ont indiqué que la réplication fournit un profil TVD fortement corrélée (r (2) = 0,80) et la division distribution au niveau de la TVD (r (2) = 0,99). En utilisant les données de séquence à partir du sol EAR abondantes, nous avons conçu des amorces spécifiques qui ont réussi à amplifiés une plus grande partie de l'ADNr SSU pour l'analyse phylogénétique plus loin. Ces résultats suggèrent que SARST est une approche puissante pour reproductible à haut débit profilage de la diversité microbienne prêtent à médicales, industrielles ou de l'environnement des applications en microbiologie.

Fluorophore Marqué Amorces D'améliorer La Sensibilité, La Polyvalence Et La Normalisation Des électrophorèse En Gradient De Gel Dénaturant

Applied and Environmental Microbiology. Aug, 2005  |  Pubmed ID: 16085891

Électrophorèse sur gel dénaturant gradient (DGGE) est largement utilisé dans l'écologie microbienne. Nous avons testé l'effet d'amorces marquées par un fluorophore sur la migration bande DGGE, la sensibilité, et la normalisation. Les fluorophores Cy5 et Cy3 n'a pas visiblement de modifier les empreintes digitales DGGE; la migration bande cependant, la 6-carboxyfluorescéine retardé. Fluorophore modification d'améliorer la sensibilité de détection d'empreintes digitales DGGE et facilitée normalisation des échantillons à partir de gels multiples par l'application de normes intralane.

De Façon Inattendue Une Grande Diversité Bactérienne Dans La Toundra Arctique Relative Aux Sols De La Forêt Boréale, Révélés Par L'analyse De La Série étiquettes De Séquences Ribosomiques

Applied and Environmental Microbiology. Oct, 2005  |  Pubmed ID: 16204479

La toundra arctique et les sols de la forêt boréale ont des fonctions au niveau mondial pertinents qui influent sur la chimie atmosphérique et du climat, mais la composition bactérienne et la diversité de ces sols ont été peu étudiés. Analyse sérielle des étiquettes de séquences ribosomiques (SARST) et électrophorèse sur gel dénaturant gradient (DGGE) ont été utilisés pour comparer des échantillons de sol composites prélevés boréale et les biomes arctiques. Cette étude comprend une comparaison exhaustive des communautés bactériennes des sols géographiquement éloignés, impliquant l'analyse de 12,850 étiquettes de séquences ribosomiques de six échantillons de sol composites. Estimations diversité bactérienne étaient plus importants pour l'Arctique intacte la toundra des échantillons de sol que pour les échantillons de sols forestiers boréaux, avec la plus grande diversité associée à un échantillon d'une situation extrême nord (82 (o) N). L'estimation plus faible diversité a été obtenu à partir d'un échantillon de sol de l'Arctique qui a été perturbée par la compaction et échantillonné à partir d'une plus grande profondeur. Depuis des échantillons provenant des deux biomes ne forment des grappes distinctes sur la base de données et les empreintes digitales SARST DGGE, d'autres facteurs que la latitude a vraisemblablement influé sur les compositions phylogénétiques de ces communautés. Le nombre élevé de séquences ribosomiques analysées ont permis d'identifier d'éventuelles cosmopolites et endémiques distributions bactériennes dans les sols particuliers.

Distribution Et Phylogénie Des Bactéries Qui Dégradent L'hexachlorocyclohexane-dans Les Sols De L'Espagne

Environmental Microbiology. Jan, 2006  |  Pubmed ID: 16343322

L'hexachlorocyclohexane (HCH) des bactéries dégradant sont soupçonnés de servir de médiateur atténuation naturelle de la contamination HCH et ont un potentiel pour les procédés de bioremédiation actifs. Cette étude a porté sur la compréhension très limitée de la spécificité de distribution, la diversité et le substrat de ces bactéries à partir de 13 échantillons de sol, variant dans les niveaux de contamination HCH, provenant de quatre sites en Espagne. Retrait hexachlorocyclohexane sont survenues chez 16 des 36 cultures d'enrichissement. Hexachlorocyclohexane qui dégradent les populations ont été clairement associée à la HCH-sols contaminés, et la croissance démographique sur l'isomère delta-HCH ont été trouvés seulement dans les sols contaminés par des delta-HCH. bêta-hexachlorocyclohexane était persistant dans les cultures d'enrichissement, et il n'y avait aucune preuve pour les populations croissantes sur le bêta-HCH. A partir de cultures d'alpha-et gamma-HCH d'enrichissement, neuf HCH-dégradantes isolats ont été obtenus, qui étaient tous spp Sphingomonas. Les tentatives visant à isoler les organismes à partir de cultures d'enrichissement delta-HCH a échoué. Aucun des isolats a grandi sur le HCH comme un seul substrat organique en culture pure. Tous les isolats d'alpha-et gamma-HCH dégradée, et les plus dégradées de bêta-HCH. delta-hexachlorocyclohexane a inhibé la croissance de la plupart des isolats, mais pourrait être dégradée par des suspensions cellulaires d'au moins quatre souches. Électrophorèse sur gel dénaturant gradient a indiqué que les isolats représentaient les populations prédominantes dans les cultures d'enrichissement, mais d'autres populations prédominantes, y compris certains Pseudomonas spp., Ne pouvaient pas être isolé.

Composition Des Communautés Microbiennes Dans L'hexachlorocyclohexane (HCH) Sols Contaminés En Provenance D'Espagne Révélé Avec Une Puce à ADN Spécifique De L'habitat

Environmental Microbiology. Jan, 2006  |  Pubmed ID: 16343328

Technologie des microréseaux a été utilisée pour caractériser et de comparer l'hexachlorocyclohexane (HCH) des sols contaminés de l'Espagne. Une bibliothèque de 2,290 séquences hypervariables gène de l'ARNr 16S a été préparé avec l'analyse en série de marqueurs de séquence ribosomique (SARST) à partir d'un composite de sols contaminés et non contaminés. En concevant des sondes d'hybridation spécifiques pour les 100 les plus abondantes étiquettes de séquences ribosomiques (EAR) dans la bibliothèque composite, le tableau TVD a été conçu pour être l'habitat spécifique et prédites pour surveiller la réaction de polymérase en plus abondante en chaîne (PCR)-amplifiés phylotypes chez l'individu échantillons. La sensibilité et la spécificité de la TVD tableau a été testé avec une série de purs spécifiques à la culture et hybridé avec des sondes marquées produits de PCR du sol pour générer des profils d'hybridation pour chaque sol. Le séquençage des bandes de premier plan dans électrophorèse sur gel dénaturant gradient (DGGE) les empreintes digitales provenant de ces sols a fourni un moyen par lequel nous avons réussi à confirmer l'habitat spécifique de conception réseau et validé la majeure partie des signaux de la sonde. Non métrique multidimensionnelle ont révélé des corrélations entre les signaux de la sonde et paramètres physico-chimiques du sol. Parmi les plus fortes corrélations à HCH contamination totale sont des signaux de la sonde correspondant à Gamma Proteobacteria inconnue, potentiels polluants qui dégradent phylotypes, et plusieurs organismes avec de l'acide-tolérantes phénotypes. Les corrélations les plus fortes à l'alpha-HCH ont été signaux de la sonde correspondant aux Sphingomonas genre, qui contient connus dégradeurs HCH. Ceci suggère que la population a été détecté enrichi in situ par l'exposition au HCH et peut jouer un rôle dans la dégradation du HCH. Autres paramètres environnementaux étaient également susceptibles contribué à façonner la composition des communautés dans ces sols. Les résultats mettent en évidence la puissance de l'habitat spécifiques puces pour comparer les communautés microbiennes complexes.

Considérations Méthodologiques Pour L'utilisation Des Isotopes Stables En écologie Microbienne De Palpage

Microbial Ecology. Apr, 2007  |  Pubmed ID: 17072677

Isotopes stables de sondage (SIP) est une méthode utilisée pour l'étiquetage des micro-organismes non cultivés dans des échantillons environnementaux ou directement dans les études sur le terrain en utilisant substrat enrichi en isotope stable (par exemple, (13) C). Après la consommation du substrat, les cellules de micro-organismes qui consomment le substrat devenir enrichi en isotope. Biomarqueurs marqués, tels que des phospholipides dérivés d'acides gras (PLFA), l'ARN ribosomal et l'ADN peuvent être analysés avec une gamme de techniques moléculaires et analytique, et utilisés pour identifier et caractériser les organismes qui ont incorporé le substrat. Les avantages et les inconvénients de PLFA-SIP, SIP-ARN et l'ADN-SIP sont présentés. En utilisant des exemples tirés de notre laboratoire et de la littérature, nous discutons d'importantes considérations méthodologiques pour une expérience réussie SIP.

Guidon: Un Flexible, Inventory Manager Sur Le Web Pour La Manipulation Des échantillons à Code-barres

BioTechniques. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17390536

ADN Isotopes Stables De Palpage

Nature Protocols. 2007  |  Pubmed ID: 17446886

Isotopes stables de sondage est une méthode utilisée en écologie microbienne qui fournit un moyen par lequel des groupes fonctionnels spécifiques des organismes qui intègrent des substrats particuliers sont identifiés sans la condition préalable de la culture. Isotopes stables de carbone marqué (13C) ou de l'azote (15N) sources sont assimilées dans la biomasse microbienne des échantillons environnementaux. Séparation et analyse moléculaire de étiquetés acides nucléiques (ADN ou ARN) révèle phylogénétique et fonctionnelle de l'information sur les micro-organismes responsables du métabolisme d'un substrat particulier. Ici, nous mettons en évidence des lignes directrices générales pour l'incubation des échantillons de l'environnement avec un substrat marqué et de fournir un protocole détaillé pour la séparation de l'ADN marqué à partir de l'ADN non marqué la communauté. Le protocole comprend une modification des méthodes actuelles de publiés, ce qui maximise la récupération de l'ADN marqué à partir de gradients de CsCl. La séparation de l'ADN et la récupération des fractions non marquées et étiquetées peuvent être effectuées dans les 4-5 jours, avec la plupart du temps commis à l'étape d'ultracentrifugation.

Qui Mange Quoi, Où Et Quand? Isotopes D'étiquetage Expériences Are Coming of Age

The ISME Journal. Jun, 2007  |  Pubmed ID: 18043620

Isotopes d'étiquetage des expériences ont changé la façon dont les écologistes microbiens enquêter sur l'écophysiologie des populations microbiennes et des cellules dans l'environnement. Un aperçu de la «majorité inculte» accompagne la méthodologie qui implique l'incorporation d'isotopes stables ou radio-isotopes dans les sous-populations d'échantillons environnementaux. L'analyse ultérieure des biomarqueurs, étiquetés et sous-populations ayant des isotopes stables de sondage (l'ADN-SIP, SIP-ARN, un phospholipide dérivé d'acide gras-SIP) ou des cellules individuelles avec une combinaison de la fluorescence par hybridation in situ et microautoradiographie révèle phylogénétique liée et de l'information fonctionnelle sur les organismes qui assimilés ces composés. Ici, nous passons en revue une partie de la littérature la plus récente, en mettant l'accent sur les améliorations méthodologiques à la sensibilité et l'utilité de ces méthodes. Nous soulignons également les techniques isotopiques connexes qui sont en développement continu et maintenez la promesse de transformer la façon dont nous relions la phylogénie et de la fonction dans les communautés microbiennes complexes.

Témoigner De La Dernière Cène De Cellules Microbiennes Non Cultivés Avec Raman-FISH

The ISME Journal. Aug, 2007  |  Pubmed ID: 18043637

Isotopes Stables De Sondage Implique Methylophaga Spp Et Roman Gammaproteobacteria En Méthanol Marine Et Métabolisme Méthylamine

The ISME Journal. Oct, 2007  |  Pubmed ID: 18043650

Le métabolisme de l'un de carbone (C (1)) composés dans le milieu marin affecte le réchauffement climatique, l'écologie d'eau de mer et de la chimie atmosphérique. En dépit de leur importance mondiale, micro-organismes marins qui consomment C (1) composés in situ restent mal caractérisés. Isotopes stables de sondage (SIP) est un outil idéal pour relier la fonction et la phylogénie des organismes méthylotrophes par le métabolisme et l'incorporation de isotopes stables étiquetés substrats dans des acides nucléiques. En combinant l'ADN-SIP et de séries chronologiques d'échantillonnage, nous avons caractérisé les organismes impliqués dans l'assimilation de méthanol et méthylamine dans l'eau de mer côtière (Plymouth, Royaume-Uni). Appelés acides nucléiques ont été analysés par électrophorèse sur gel dénaturant gradient (DGGE) et les bibliothèques de clones de gènes de l'ARNr 16S. En outre, nous avons caractérisé le gène fonctionnel complément d'acides nucléiques marqués avec un jeu d'amorces meilleur ciblage méthanol déshydrogénase (mxaF) et des amorces nouvellement conçus pour déshydrogénase méthylamine (maua). Phylotypes DGGE prédominantes, ARNr 16S, les séquences de méthanol et méthylamine déshydrogénase, et les isolats de culture tous impliqués Methylophaga spp, methylotrophs marins modérément halophiles, de la consommation de méthanol et méthylamine. En outre, une séquence mxaF obtenu à partir d'ADN extrait de l'eau de mer en cluster avec celles détectées dans (13) C-ADN, ce qui suggère une prédominance de Methylophaga spp parmi les methylotrophs marins. De façon inattendue, 16S ARNr prédominantes et des séquences de gènes fonctionnels à partir de (13) C-ADN ont été regroupés dans des parties distinctes du substrat spécifiques clades, avec des gènes codant les ARNr 16S de clustering avec des séquences de la Gammaproteobacteria. Ces clades n'ont pas de représentants de culture et de révéler une adaptation écologique des particuliers methylotrophs incultes à certaines C (1) composés dans l'environnement marin côtier.

Quelque Chose De (presque) Rien: L'impact De La Displacement Amplification Multiple Sur L'écologie Microbienne

The ISME Journal. Mar, 2008  |  Pubmed ID: 18256705

L'écologie microbienne est un domaine qui applique des techniques moléculaires pour analyser les gènes et communautés associées à une pléthore d'environnements uniques sur cette planète. Dans le passé, une faible biomasse et la prédominance de quelques membres de la communauté abondantes ont entravé l'application de techniques telles que la PCR, l'analyse des microréseaux et la métagénomique aux populations microbiennes complexes. En l'absence de méthodes culturales appropriées, il n'était pas possible d'obtenir des échantillons d'ADN provenant de micro-organismes individuels. Récemment, une méthode appelée amplification par déplacement de multiple (MDA) a été utilisé pour contourner ces limitations en amplifier l'ADN de communautés microbiennes dans les environnements à faible biomasse, des cellules individuelles à partir d'espèces microbiennes incultes et des organismes actifs obtenus par des isotopes stables de sondage incubations. Cette revue décrit le développement et les applications de la MDA, discute de ses forces et ses limites et met en évidence l'impact de la MDA sur le terrain de l'écologie microbienne. D'amplification du génome entier par l'intermédiaire MDA a augmenté l'accès à l'ADN génomique des micro-organismes non cultivés et faible biomasse des environnements et représente un «outil de puissance» dans la boîte à outils moléculaire des écologues microbiens.

Methylotrophs Marines Révélées Par Isotopes Stables De Sondage, Multiple Displacement Amplification Et Métagénomique

Environmental Microbiology. Jun, 2008  |  Pubmed ID: 18294205

Les concentrations de carbone d&#39;un des substrats que les communautés microbiennes du carburant méthylotrophes dans l&#39;océan sont limités et les guildes spécialisées de bactéries qui utilisent ces molécules peuvent exister à l&#39;abondance relative faible. En conséquence, ces organismes sont difficiles à identifier et sont souvent manquées avec la culture existante et des méthodes d&#39;extraction de gènes. Ici, nous démontrons une preuve nouvelle de la notion: en utilisant des concentrations de substrat respectueux de l&#39;environnement pertinents en isotopes stables de sondage (SIP) incubations pour donner suffisamment d&#39;ADN pour l&#39;analyse à grande insert métagénomique par amplification par déplacement de multiple (MDA). Un marin d&#39;eau de surface échantillon a été étiqueté de manière suffisante par incubation avec près de concentrations in situ de méthanol. Quantités de picogramme marqué (13) C-ADN ont été purifiés à partir des gradients de chlorure de césium, amplifié avec MDA pour produire des quantités de microgramme de haute masse moléculaire d&#39;ADN ( <or= 40 kb) and cloned to produce a fosmid library of > 10 000 clones. Électrophorèse sur gel dénaturant gradient (DGGE) fait preuve de partialité minime associée à l&#39;étape MDA et impliqués Methylophaga-comme phylotypes avec le métabolisme marine de méthanol. Dépistage réaction en chaîne par polymérase de 1500 clones a révélé une déshydrogénase du méthanol (MDH) contenant insert et séquençage aléatoire de cette insertion conduit à l&#39;assemblage d&#39;un fragment de 9 kb d&#39;ADN codant pour un cluster d&#39;enzymes impliquées dans la biosynthèse MDH, la réglementation et l&#39;assemblage. Cette nouvelle combinaison de la méthodologie permet futures études structure-fonction des communautés microbiennes pour atteindre l&#39;objectif tant convoité de l&#39;identification des populations microbiennes actives en utilisant des conditions in situ et en effectuant une analyse métagénomique dirigé pour ces micro-organismes écologiquement pertinentes.

Gratter La Surface De La Biosphère Rare Avec Ribosomal Amorces Sequence Tag

FEMS Microbiology Letters. Jun, 2008  |  Pubmed ID: 18429998

Ensembles de données de plus en plus grand nombre de séquences du gène 16S ARNr révéler de nouvelles informations sur l&#39;étendue de la diversité microbienne et de l&#39;étendue surprenante de la biosphère rare. Actuellement, la plupart des grands ensembles de données sont représentés par de courtes et variables étiquettes de séquences ribosomiques (EAR) qui sont limités dans leur capacité à attribuer des séquences avec précision à des arbres phylogénétiques à grande échelle. Dans cette étude, nous avons sélectionné 30 EAR rares ensembles de données de séquences existantes et des amorces conçues pour amplifier c. 1400 bases des ARNr 16S afin de déterminer si ces séquences ont été représentés par des bases de données existantes ou si elles pourraient révéler de nouvelles lignées dans les bactéries. Environ un tiers des amorces TVD succès amplifiés plus grande portion de ces 16S ARNr faible abondance des gènes d&#39;une manière spécifique. Après analyse phylogénétique a démontré que la plupart de ces séquences étaient (1) de loin lié à des micro-organismes cultivés existants et (2) étroitement liée à des séquences de clones incultes qui ont été récemment déposées dans GenBank. La présence de tant de la collecte récente de séquences de gènes ARNr 16S de référence dans les bases de données existantes indiquent que des progrès sont réalisés rapidement vers un recensement microbien, celui qui a commencé de rayer la surface de la «biosphère rare&quot;.

Révéler La Majorité Inculte: La Combinaison De L&#39;ADN Isotopes Stables De Sondage, Multiple Displacement Amplification Et Analyses Métagénomiques De Methylocystis Incultes Dans Les Tourbières Acides

Environmental Microbiology. Oct, 2008  |  Pubmed ID: 18631364

Les tourbières constituent un énorme réservoir de carbone et ont un impact potentiel sur le climat mondial en raison de la méthanogénèse active et Méthanotrophie dans ces sols. Méthanotrophes incultes de sept tourbières européennes ont été étudiés en utilisant une combinaison de méthodes moléculaires. Le dépistage de la diversité méthanotrophe l&#39;aide d&#39;un méthane monooxygénase particules à base de réseaux de gènes de diagnostic a révélé que Methylocystis liées espèces étaient dominantes dans six des sept tourbières étudiées. L&#39;abondance et l&#39;activité de l&#39;oxydation du méthane Methylocystis spp. ont été confirmées par l&#39;ADN des isotopes stables de sondage analyse d&#39;un échantillon prélevé dans la tourbière Moor House (Angleterre). Après ultracentrifugation, (13) C-ADN marqué, contenant l&#39;ADN génomique de ces spp Methylocystis., A été séparé de (12) C ADN et soumis à une amplification de déplacement multiples (MDA) pour générer suffisamment d&#39;ADN pour la préparation d&#39;une bibliothèque fosmide metagénomique. Biais potentiel de la MDA a été détectée par analyse des empreintes digitales de l&#39;ARNr 16S en utilisant électrophorèse sur gel dénaturant gradient à faible matrice d&#39;amplification (0,01 ng modèle). Modèle suffisante (1-5 ng) a été utilisé dans MDA pour contourner ce biais et artefacts chimérique ont été minimisés en utilisant un traitement enzymatique de l&#39;ADN-MDA généré par la nucléase S1 et le dépistage ADN polymérase I. de la bibliothèque métagénomique a révélé une déshydrogénase fosmide contenant du méthanol et deux fosmides contenant 16S ARNr de ces espèces Methylocystis liées ainsi que d&#39;un fosmide contenant un gène ARNr 16S liée à celle de Methylocella / Methylocapsa. Le séquençage du méthanol 14 kb déshydrogénase contenant fosmide a permis l&#39;assemblage de polypeptides de gènes codant pour un cluster impliqués dans l&#39;utilisation du méthanol bactérienne (mxaFJGIRSAC). Cette combinaison de l&#39;ADN des isotopes stables de sondage, MDA et la métagénomique a donné accès à l&#39;information génomique d&#39;un fragment d&#39;ADN relativement importante de ces méthanotrophes jusqu&#39;ici inculte, prédominants et active dans le sol des tourbières.

Assimilation De Méthane Et D&#39;interactions Trophiques Avec Methylomicrobium Marine En Eau Profonde De Sédiments Sur Les Récifs Coralliens Au Large De La Côte De La Norvège

FEMS Microbiology Ecology. Nov, 2008  |  Pubmed ID: 18811651

Récifs coralliens en eau profonde sont des environnements sous-marines avec les diverses communautés biologiques entourées par l&#39;obscurité permanente à froid. Les sources d&#39;énergie et de carbone pour la nourriture de ces récifs sont actuellement pas clair. Nous avons étudié un aspect de la chaîne alimentaire en utilisant l&#39;ADN des isotopes stables de sondage (l&#39;ADN-SIP). Les sédiments de dessous un récif Lophelia pertusa large de la côte de la Norvège a été incubé jusqu&#39;à l&#39;assimilation de 5 g micromol 13CH4 (-1) poids humide a eu lieu. L&#39;ADN extrait a été séparé en «lumière» et des lourds des fractions pour l&#39;analyse de l&#39;étiquetage. Empreintes digitales de la communauté bactérienne des fragments amplifiés par PCR du gène 16S ARNr a révélé deux principaux 13C-bandes spécifiques. Le séquençage de ces bandes a indiqué que le carbone de 13CH4 avait été assimilée par un Methylomicrobium et un membre de l&#39;inculte Gammaproteobacteria. Le clonage et de séquençage d&#39;ARNr 16S des gènes de l&#39;ADN lourde, en plus des gènes codant pour les particules et le méthane monooxygénase déshydrogénase méthanol, l&#39;ensemble Methylomicrobium reliée avec le métabolisme du méthane. Putatifs croisées mangeoires étaient affiliés à Methylophaga (Gammaproteobacteria), Hyphomicrobium (Alphaproteobacteria) et methylotrophs antérieurement non des Gammaproteobacteria, les Alphaproteobacteria, les Deferribacteres et Bacteroidetes. Ce méthane premier marin SIP étude fournit des preuves de la présence de methylotrophs qui participent dans les réseaux trophiques des sédiments associés aux récifs coralliens en eau profonde.

Substrat Spécifiques Clades De Methylotrophs Marine Actif Associé à Un Bloom Phytoplanctonique Dans Un Environnement Côtières Tempérées

Applied and Environmental Microbiology. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 18849453

Micro-organismes marins qui consomment un carbone (C (1)) composés sont mal décrites, en dépit de leur impact sur le climat mondial par l&#39;intermédiaire d&#39;une influence sur la chimie aquatique et atmosphérique. Cette étude a porté sur les communautés bactériennes marines impliquées dans le métabolisme de C (1) composés. Ces communautés étaient d&#39;un intérêt pour l&#39;eau de mer de surface et de la chimie atmosphérique dans le contexte d&#39;une fleur qui a été dominée par le phytoplancton connus pour produire des diméthylsulfoniopropionate. En plus d&#39;utiliser les empreintes digitales du gène 16S ARNr et les bibliothèques de clones de caractériser des échantillons prélevés à partir d&#39;un transect floraison en Juillet 2006, des échantillons d&#39;eau de mer de la prolifération du phytoplancton ont été incubées avec (13) méthanol C-étiquetés, monométhylamine, la diméthylamine, le bromure de méthyle, et le sulfure de diméthyle pour identifier les populations microbiennes impliquées dans le chiffre d&#39;affaires de C (1) composés, à l&#39;aide d&#39;isotopes stables d&#39;ADN de sondage. Les [(13) C] des échantillons d&#39;ADN à partir d&#39;un seul moment ont été caractérisées et comparées en utilisant électrophorèse sur gel dénaturant gradient (DGGE), une analyse typologique des empreintes digitales, et du gène 16S ARNr clone analyse de la bibliothèque. Bactériennes empreintes digitales DGGE communautaires de (13) d&#39;ADN marqué au C étaient distincts de ceux obtenus avec l&#39;ADN de l&#39;ADN de la communauté non marquée et a suggéré un certain chevauchement dans l&#39;utilisation des substrats entre les populations méthylotrophe actifs qui poussent sur différents C (1) substrats. Methylotrophs actifs étaient affiliés à Methylophaga spp. et plusieurs clades de Gammaproteobacteria indécrit qui ont utilisé le méthanol, méthylamines (à la fois monométhylamine et la diméthylamine) et le sulfure de diméthyle. des séquences de gènes ARNr correspondantes aux populations assimilatrices (13) du bromure de méthyle C-étiquetés et d&#39;autres substrats ont été associés avec les membres de la Alphaproteobacteria (par exemple, le Rhodobacteraceae famille), le groupe Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides, et de taxons inconnus. Cette étude élargit la diversité connue des marins methylotrophs en eau de mer de surface et fournit un ensemble complet de données pour la culture ciblée et analyses métagénomiques à l&#39;avenir.

Analyse De L&#39;ADN Métagénomique Enrichis Isotopiquement

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2010  |  Pubmed ID: 20830556

Ce protocole décrit une approche détaillée pour combiner l&#39;ADN des isotopes stables de sondage basé sur l&#39;enrichissement, l&#39;amplification par déplacement multiple (MDA), et la métagénomique. Ensemble, ces trois méthodes permettent un accès sélectif à des génomes des organismes non cultivés qui ont activement poussent à l&#39;aide de carbone isotopiquement étiquetés et sources d&#39;azote. Les incubations avec des isotopes stables étiquetés substrats enrichir l&#39;ADN isotopiquement marqué à partir de fonctionnellement pertinents micro-organismes, ce qui sert de filtre pour réduire la complexité du métagénome. L&#39;étape MDA génère suffisamment d&#39;ADN à partir d&#39;acide nucléique marqué pour la construction de bibliothèque métagénomique. Par la suite, des fragments de génome peut être soumis à une variété d&#39;écrans pour les gènes phylogénétiques ou fonctionnelle intérêt pour les membres actifs de la communauté. L&#39;ADN-MDA générée peut également servir de modèle pour directe séquençage à haut débit pour faciliter la reconstruction des voies métaboliques de ces organismes actifs. Dernières preuve de concept des études ont démontré que cette nouvelle combinaison de méthodes moléculaires peuvent offrir des améliorations substantielles à des fréquences de détection des gènes et pourrait avoir un grand potentiel futur pour la découverte de nouveaux gènes, les enzymes, et les voies métaboliques.

Génération De Plusieurs Millions De Séquences De Gènes ARNr 16S Bibliothèques De Communautés Microbiennes Complexes Par Assemblage Par Paires Fin De Illumina Lit

Applied and Environmental Microbiology. Jun, 2011  |  Pubmed ID: 21460107

Les communautés microbiennes accueillir la diversité taxonomique inégalée. Caractérisation adéquate des échantillons de l&#39;environnement et de l&#39;hôte associé reste un défi pour les microbiologistes, en dépit de l&#39;avènement du séquençage du gène 16S ARNr. Afin d&#39;augmenter la profondeur d&#39;échantillonnage pour les diverses communautés bactériennes, nous avons développé une méthode pour le séquençage et l&#39;assemblage des millions de paires de fin se lit comme suit à partir du gène ARNr 16S (couvrant la région V3; ~ 200 nucléotides) en utilisant un analyseur de génome Illumina. Pour confirmer la reproductibilité et à identifier un pipeline approprié de calcul pour l&#39;analyse des données, les bibliothèques de séquences ont été préparés en double exemplaire à la fois un mélange défini d&#39;ADN à partir de culture des isolats bactériens connus (&gt; 1 million de séquences postassembly) et une toundra arctique échantillon de sol (&gt; 6.000.000 postassembly séquences). Les bibliothèques d&#39;Illumina gène 16S rRNA représentent une augmentation substantielle du nombre de séquences plus toutes les approches existantes de séquençage de prochaine génération (par exemple, 454 pyroséquençage), tandis que l&#39;ensemble des paires de fin 125-base de lit offre un avantage méthodologique en intégrant un contrôle de la qualité initiale étape pour chaque séquence du gène 16S ARNr. Cette méthode intègre amorces indexés pour permettre la caractérisation des communautés microbiennes multiples dans une voie cellulaire à flux unique, peut être modifié facilement pour cibler d&#39;autres régions variables ou des gènes, et démontre un accès sans précédent et économique à ADN provenant d&#39;organismes qui existent au bas abondances relatives.

Minimum D&#39;informations Sur Une Séquence De Gène Marqueur (MIMARKS) Et Minimum D&#39;informations Sur Tout (x) Des Séquences (MIXS) Spécifications

Nature Biotechnology. May, 2011  |  Pubmed ID: 21552244

Nous présentons ici une norme développée par le consortium génomique normalisation (CMN) pour rendre compte des séquences de gènes marqueurs - le minimum d&#39;informations sur une séquence de gène marqueur (MIMARKS). Nous introduisons également un système permettant de décrire l&#39;environnement à partir duquel un échantillon biologique provient. Les paquets des environnement ne s&#39;appliquent l&#39;une quelconque séquence du génome d&#39;origine connue et peut être utilisé en combinaison avec d&#39;autres listes de contrôle et MIMARKS CGC. Enfin, pour établir une norme unifiée pour décrire des données de séquences et de fournir un point d&#39;entrée unique pour la communauté scientifique d&#39;accéder et d&#39;apprendre des listes de contrôle de la CGC, nous présentons le minimum d&#39;informations sur n&#39;importe quelle séquence (x) (MIXS). Adoption de MIXS permettra d&#39;améliorer notre capacité à analyser la diversité génétique naturelle documentée par d&#39;énormes efforts de séquençage d&#39;ADN provenant d&#39;écosystèmes myriade de notre constante évolution de la biosphère.

Prévalence De L&#39;anaérobie Ammonium-oxydantes Des Bactéries Dans Les Eaux Souterraines Contaminées

Environmental Science & Technology. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21786759

Anaérobies d&#39;ammonium-oxydantes (anammox) bactéries effectuer une étape importante dans le cycle global de l&#39;azote: l&#39;oxydation anaérobie de l&#39;ammonium et la réduction des nitrites pour former du gaz diazote (N (2)). Organismes Anammox semblent être largement diffusé dans les milieux naturels et artificiels. Cependant, leurs rôles dans l&#39;atténuation d&#39;ammonium des eaux souterraines restent floues et que des données limitées biomarqueur basé confirmé leur présence avant cette étude. Nous avons utilisé des méthodes moléculaires complémentaires et des isotopes visant à évaluer la diversité anammox et l&#39;activité se produisant sur trois sites en eaux souterraines contaminées par d&#39;ammonium: PCR quantitative, électrophorèse sur gel dénaturant gradient, le séquençage de gènes de l&#39;ARNr 16S, et (15) N-traceurs incubations. Ici, nous montrons que les organismes les plus performants étaient abondantes anammox membres de la communauté bactérienne. Bien que tous les sites ont été dominées par Candidatus Brocadia séquences de type, de la communauté sur un site a été particulièrement diversifié, qui possède quatre des cinq genres connus de bactéries anammox. Les données isotopiques ont montré que anammox produit jusqu&#39;à 18 et 36% de N (2) sur ces sites. En combinant les résultats moléculaires et isotopiques, nous avons démontré la diversité, l&#39;abondance et l&#39;activité de ces bactéries autotrophes. Nos résultats fournissent des preuves solides pour leur rôle important dans l&#39;atténuation biogéochimique contamination des eaux souterraines d&#39;ammonium.

Aquarium Nitrification Revisited: Thaumarchaeota Les Oxydants D&#39;ammoniac Dans L&#39;eau Douce Aquarium Dominant Biofiltres

PloS One. 2011  |  Pubmed ID: 21858055

Ammoniac-oxydante archées (AOA) sont plus nombreux que l&#39;ammoniac bactéries oxydant (AOB) dans de nombreux milieux terrestres et aquatiques. Bien que la nitrification est la fonction principale des biofiltres aquarium, très peu d&#39;études ont étudié les micro-organismes responsables de ce processus dans les aquariums. Cette étude a utilisé quantitative PCR en temps réel (qPCR) pour quantifier la monooxygénase l&#39;ammoniac (AMOA) et 16S ARNr des bactéries et Thaumarchaeota en aquarium d&#39;eau douce biofiltres, en plus d&#39;évaluer la diversité des gènes amoA AOA par électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE) banques de clones et. AOA étaient numériquement dominants dans 23 des 27 biofiltres en eau douce, et dans 12 de ces AOA biofiltres contribué tous les gènes détectables amoA. Huit aquariums d&#39;eau salée et deux commerciaux aquarium suppléments nitrifier ont été inclus à titre de comparaison. Gènes amoA deux thaumarchaeal et bactériennes ont été détectés dans tous les échantillons d&#39;eau de mer, avec des gènes AOA plus nombreuses que les gènes AOB dans cinq des huit biofiltres. Gènes bactériens amoA étaient abondants dans les deux suppléments, mais thaumarchaeal amoA et 16S ARNr n&#39;a pas pu être détecté. Pour aquariums d&#39;eau douce, la proportion de gènes à partir amoA par rapport à l&#39;AOA AOB a été inversement corrélée avec la concentration d&#39;ammonium. DGGE des gènes amoA AOA a révélé la diversité variable selon les échantillons, avec non métrique multidimensionnelle (NMDS) indiquant la séparation des empreintes digitales d&#39;eau douce et eau salée. Banques de clones composites de gènes amoA AOA révélé d&#39;eau douce distincte et grappes d&#39;eau salée, ainsi que des grappes mixtes contenant à la fois douce et eau salée séquences de gènes amoA. Ces résultats révèlent un aperçu de banales biofiltres résidentiels et suggèrent que les biofiltres aquarium peut représenter microcosmes biofilm précieuse pour les études futures de l&#39;écologie AOA.

Autotrophe Actif Ammoniac-oxydant Bactéries Dans Des Biofilms Enrichissements à Partir Des écosystèmes Creek Simulés à Deux Concentrations D&#39;ammonium Réagir à Une Manipulation De La Température

Applied and Environmental Microbiology. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21890674

La première étape de la nitrification, l&#39;oxydation de l&#39;ammoniac en nitrites, est important pour réduire l&#39;eutrophisation dans les environnements d&#39;eau douce lorsqu&#39;elle est associée à anammox (oxydation anaérobie de l&#39;ammonium) ou la dénitrification. Nous avons analysé précédemment actif biofilm aérobie associé à l&#39;ammoniac-oxydant communautés originaires de Ammerbach (AS) et du Sud Leutra cours d&#39;eau (LS) (683 ± 550 [moyenne ± écart-type] et 16 ± 7 uM (4) NH (+), respectivement ) qui ont été développés dans une expérience de canal d&#39;écoulement et incubés dans trois régimes de température. Par isotopes stables de sondage en utilisant (13) CO (2), nous avons constaté que les membres des bactéries et des archées étaient pas les fonctionnellement dominantes oxydants d&#39;ammoniac autotrophes à toutes les températures sous les charges d&#39;ammonium relativement élevés. Le nombre de copies de gènes bactériens dans amoA (13) C-ADN marqué étaient inférieurs à 30 ° C qu&#39;à 13 ° C dans les deux cultures d&#39;enrichissement des cours d&#39;eau. Toutefois, la composition de la communauté des bactéries ammoniaque oxydants (AOB) dans l&#39;ADN (13) C-étiquetés ont réagi différemment à la manipulation de température à deux concentrations d&#39;ammonium. En enrichissements LS incubées à la température in situ (13 ° C), Nitrosomonas oligotropha séquences de type ont été récupérés avec des séquences de Nitrosospira Amoa groupe 4, tandis que la proportion de séquences Nitrosospira augmenté à des températures plus élevées. Dans AS enrichissements incubées à 13 ° C et 20 ° C, AmoA cluster de 4 séquences étaient dominante; Nitrosomonas nitrosa séquences de type dominé à 30 ° C. Biofilm associées communautés AOB ont été touchées différemment par la température à deux concentrations relativement élevées d&#39;ammonium, les impliquant dans un rôle potentiel dans la gouvernance contaminés distributions AOB d&#39;eau douce.

Acide Butyrique Et De Diméthyle Disulfure-assimilatrices Micro-organismes Dans Un Biofiltre Traitement Des émissions Atmosphériques à Partir D&#39;une Installation D&#39;élevage

Applied and Environmental Microbiology. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22003018

Biofiltration s&#39;est révélée un outil efficace pour l&#39;élimination de composés organiques volatils (COV) et ammoniac provenant des installations d&#39;élevage, réduisant ainsi les nuisances olfactives et les émissions d&#39;ammoniac à l&#39;environnement local. Les communautés microbiennes actives comprenant ces biofilms filtres n&#39;ont pas été bien caractérisés. Dans cette étude, un biofiltre filet traitement de l&#39;air à partir d&#39;une installation de porc a été étudiée et s&#39;est avérée efficace dans l&#39;élimination des acides carboxyliques (réduction&gt; 70%), principalement attribuable à la section filtre primaire au sein de ce qui a réduit des composés organiques soufrés ont également été appauvri (jusqu&#39;à 50% ). Le filtre secondaire a éliminé plusieurs composés aromatiques: phénol (81%), le p-crésol (89%), 4-éthylphénol (68%), indole (48%), et le scatole (69%). La participation active d&#39;acide butyrique dégradants de la communauté bactérienne d&#39;un échantillon de filtre à air a été identifié par l&#39;ADN des isotopes stables de sondage (l&#39;ADN-SIP) et microautoradiographie, combiné avec l&#39;hybridation fluorescente in situ (MAR-FISH). Les séquences du gène 16S ARNr prédominantes à partir d&#39;une banque de clones provenant de &quot;lourd&quot; d&#39;ADN à partir de [(13) C (4)] incubations acide butyrique étaient Microbacterium, Gordonia, Dietzia, Rhodococcus, Propionibacterium, et Janibacter, tous de la Actinobacteria. Actinobacteria ont été confirmés et quantifiés par MAR-FISH comme étant le phylum bactérien majeur assimiler l&#39;acide butyrique avec plusieurs Burkholderiales liée Betaproteobacteria. La communauté bactérienne active assimiler le disulfure de diméthyle (DMDS) a été caractérisé par de l&#39;ADN-SIP et MAR-FISH et j&#39;ai trouvé pour être associé à la Actinobacteria, avec quelques représentants de Flavobacteria et Sphingobacteria. Fait intéressant, l&#39;ammoniac-oxydant Betaproteobacteria ont également été impliqués dans la dégradation de DMDS, comme l&#39;étaient les champignons. Ainsi, plusieurs méthodes basées sur des isotopes ont fourni des données complémentaires, permettant à haute résolution d&#39;identification et des évaluations quantitatives de l&#39;odeur, éliminant Actinobacteria dominés par les populations de ces milieux biofiltre.

Électrophorèse Non Linéaire Pour La Purification De L&#39;ADN Du Sol Pour Métagénomique

Journal of Microbiological Methods. Jan, 2012  |  Pubmed ID: 22056233

Purification de l&#39;ADN microbien du sol est difficile en raison de la co-extraction des acides humiques et des composés phénoliques associés qui inhibent la suite du clonage, l&#39;amplification ou le séquençage. La suppression de ces contaminants est essentielle pour la réussite de construction de la bibliothèque métagénomique et séquençage à haut débit de l&#39;ADN extrait. En utilisant trois différents échantillons de sol composites, nous avons comparé une technique de purification d&#39;ADN nouveau en utilisant l&#39;électrophorèse non linéaire sur le coefficient de traînée de la modification synchrone (SCODA) instrument avec des méthodes de purification de rechange tels directe électrophorèse (DC) en cours sur gel d&#39;agarose suivie d&#39;une filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d&#39;anions , Assistant d&#39;ADN système de nettoyage, et le kit ADN PowerSoil isolement. La fois non linéaire et continue électrophorèse sont efficaces pour extraire l&#39;ADN de haut poids moléculaire avec une grande pureté, convient pour la construction de bibliothèques d&#39;insertion grande. Le kit d&#39;ADN PowerSoil isolement et l&#39;électrophorèse non linéaire avait élevé de récupération de l&#39;ADN de haute pureté convenable pour le séquençage des fins. Toutes les méthodes ont démontré la cohérence élevé dans les profils des communautés bactériennes générés à partir des extraits d&#39;ADN. Électrophorèse non linéaire en utilisant l&#39;instrument est SCODA la méthode idéale pour la préparation d&#39;échantillons d&#39;ADN du sol appropriées à la fois pour séquençage à haut débit et des applications de clonage à grande insert.

PANDAseq: Jumelage-END Assembleur Pour Les Séquences D&#39;Illumina

BMC Bioinformatics. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22333067

RÉSUMÉ: CONTEXTE: Illumina appariées fin lit sont utilisés pour analyser les communautés microbiennes en ciblant amplicons du gène ARNr 16S. Outils disponibles publiquement sont nécessaires pour assembler chevauchement jumelé fin de lit tout en corrigeant les disparités et les bases non appelés; de nombreuses erreurs peuvent être corrigées pour obtenir des rendements plus élevés en utilisant des séquences d&#39;information de qualité. RÉSULTATS: PANDAseq assemble jumelé la fin se lit rapidement et avec la correction de la plupart des erreurs. Corrections d&#39;erreurs d&#39;incertitude proviennent de lit avec beaucoup de mauvaise qualité des bases définies par le traitement en amont. Des repères ont été fait en utilisant des masques d&#39;erreur réels sur des données simulées, un modèle de source pure, et un modèle de mise en commun de l&#39;ADN génomique à partir d&#39;organismes connus. PANDAseq assemblé lit plus rapidement et avec incorporation d&#39;erreur réduite par rapport à d&#39;autres méthodes. CONCLUSIONS: PANDAseq assemble rapidement des séquences et des échelles à des milliards de paires de fin lit. Assemblée des bibliothèques de contrôle a montré une augmentation de 4 {50% du nombre de séquences assemblées sur le montage naïve avec une perte négligeable de &quot;bonne&quot; séquence.

Omiques Pour Comprendre La Dynamique Fonctionnelle Microbiens

Environmental Microbiology. Jan, 2012  |  Pubmed ID: 21651688