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- Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 1
- Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 2
- Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 3
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Articles by Judy Yen in JoVE
JoVE General
Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 1
Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology
Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.
JoVE General
Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 2
Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology
Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.
JoVE General
Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 3
Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology
Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux. Partie 3 décrit le processus d'étiquetage de l'ARN par fluorescence amplifié à partir de l'hôte et des échantillons viraux par le couplage d'allyle aminés de colorants.
Other articles by Judy Yen on PubMed
Le Virus Recombinant Cytomégalovirus Humain Viable Avec Une Délétion Interne Du Gène IE2 86 Affecte Les Dernières Phases De La Réplication Virale
Utilisant la technologie de chromosomes artificiels bactériens (BAC), nous avons construit et caractérisé un virus recombinant de cytomégalovirus humain avec une mutation dans l'exon spécifique pour la grande région précoce immédiate 2 (IE2) produit du gène. La protéine de 86 kDa IE2 qui en résulte (IE2 86) a une délétion interne d'acides aminés 136 à 290 et est fusionnée à l'extrémité de carboxy terminale de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP). La suppression supprime également la méthionine initiateur et promoteur du formulaire p40 de méthionine IE2 et initiateur du formulaire p60 de la protéine, et par conséquent, ces produits de gène tardif ne sont pas produits. Le virus mutant IE2 86 Delta SX-EGFP est viable mais présente altéré les caractéristiques de croissance en culture de tissus, comparée à une pleine longueur sauvage (wt) virus EGFP 86 IE2 ou un virus révertant. Lorsque des cellules sont infectées par le virus mutant à une faible multiplicité d'infection (MOI), il y a un retard sensible dans la production de virus infectieux. Ceci est associé à plus lente cellule-cellule propagation du virus. Par immunofluorescence et buvardage de Western, nous montrons que les premières étapes dans la réplication du virus mutant sont comparables à ceux de l'équipe de travail. Bien qu'il y a nettement moins IE2 de protéines dans les cellules infectées par le mutant, il n'y a seulement un modeste lag dans l'accumulation initiale de 72 IE1 et des protéines virales précoces et réplication de l'ADN virale procède normalement. La mutation a également qu'un faible effet sur la synthèse de la protéine de capside majeure. L'anomalie moléculaire plus notable de l'infection par le virus mutant est que les niveaux d'équilibre de la pp65 (UL83) et pp28 (UL99) protéines de la matrice sont considérablement réduites. Dans le cas de UL83, mais pas UL99, il y a aussi une diminution correspondante au montant de l'ARNm dans les cellules infectées par le virus mutant.
Infection De Cellules Par Le Cytomégalovirus Humain Au Cours De La Phase S Se Traduit Par Un Blocus à L'expression Des Gènes Précoces Immédiats Qui Peut être Surmontée Par L'inhibition Du Protéasome
Les cellules infectées par le cytomégalovirus humain (HCMV) après le début de la réplication de l'ADN ne pas initier virale expression des gènes précoce immédiate (IE) et diviser avant d'arrêter. Pour déterminer la nature de ce blocus, nous avons examiné les cellules qui ont été infectés 24 h après la libération du transect linéaire à l'aide d'immunofluorescence, cytométrie en flux balayage laser et fluorescence-lancée de cellules tri analyse (FACS). Environ 40 à 50 % des cellules a teneur en ADN 2N, est devenu IE(+) au cours des 12 premières heures et arrêté. La plupart, mais pas la totalité des cellules avec > 2N contenu en ADN n'a pas formulé d'antigènes IE jusqu'après la mitose. Pour définir la petite population de cellules IE(+) qui peu à peu accumulé dans les S et G (2) compartiments/m, les cellules ont été pulsés avec bromodéoxyuridine (BrdU) juste avant l'infection de la phase S et analysés 12 h après l'infection pour l'expression des gènes IE BrdU positivité et position du cycle cellulaire. La plupart des cellules BrdU(+) ont été IE(-) et avait progressé dans/m G (2) ou en g (1). La majorité de la IE(+) des cellules dans f et D (2) / m ont été BrdU(-). Seules quelques cellules ont été IE(+) BrdU(+), et ils ont résidé en sol (2) / M. Multipoint BrdU pulse-étiquetage a révélé que, comparativement aux cellules activement de synthétiser l'ADN au début de l'infection, un pourcentage plus élevé des cellules qui a initié la réplication de l'ADN 4 h plus tard pourrait exprimer des antigènes IE et soumettre leurs S. synchronisation des cellules avec aphidicoline a également indiqué que le blocus à l'activation de l'expression génique IE a été créé en peu de temps après l'initiation de la réplication de l'ADN des cellules. Il semble qu'une protéine de courte durée dans les cellules en phase S peut-être être requise pour l'expression des gènes IE car il est partiellement rétablie par le traitement avec l'inhibiteur du protéasome MG132.
Activité De La Kinase Cycline-dépendante Est Requise Au Début D'un Traitement Précis Et L'accumulation Des Transcriptions Cytomégalovirus Humain UL122-123 Et UL37 Précoces Immédiates Et Ulterieurement Pour La Production De Virus
Infection par le cytomégalovirus humain (HCMV) conduit à une dysrégulation de plusieurs protéines de cycle cellulaire-régulation. Dans cette étude, nous avons examiné les effets de l'inhibition de l'activité des kinases cycline-dépendantes (cdk) sur la réplication virale. Avec la drogue Roscovitine, un inhibiteur spécifique de la kinase cycline-dépendante 1, 2, 5, 7 et 9, nous avons montré que durant les 6 premières heures de l'infection, événements axés sur la kinase cycline-dépendante qui comprenait le traitement réglementée et l'accumulation des relevés de notes (IE) UL122-123 précoces immédiats et transcriptions UL36-37. Modifié le traitement des UL122-123 a conduit à une perte de 72 IE1 et IE2-86 une augmentation. Le ratio d'épissé à unspliced UL37 transcriptions a également changées. Ces effets n'exigeaient pas de synthèse protéique de novo ou de dégradation des protéines par le protéasome. Ajout de Roscovitine au début de l'infection était également associée à l'inhibition de l'expression de certains produits de gène précoce virale, réplication de l'ADN virale et expression des gènes viraux tardive. Lorsque Roscovitine a été ajouté après les 6 premières heures de l'infection, les effets sur l'expression génique IE n'est plus observés et réplication virale s'est rendu à la fin de la phase, mais les titres virus ont été réduits. La réduction du titre viral a été observée même quand Roscovitine a été tout d'abord ajouté 48 h après l'infection, ce qui indique que l'activité de la kinase cycline-dépendante est exigée à IE et la fin de l'époque. FLAVOPIRIDOL, un autre inhibiteur spécifique de la kinase cycline-dépendante, eut des effets similaires sur IE et l'expression des gènes précoces. Ces résultats soulignent l'importance de la maturation de l'ARN précise et réaffirmer le rôle important des facteurs de régulation-cycle cellulaire à l'infection à cytomégalovirus.
Therapeutics De Fièvre Hémorragique Ebola: Génome Entier Analyse Transcriptionnelle De L'atténuation Des Maladies Réussie
Les mécanismes d'Ebola (EBOV) pathogenèse ne sont que partiellement compris, mais le dérèglement des réponses normales de l'hôte immunitaire (y compris la destruction des lymphocytes, des augmentations de taux circulants de cytokines, et le développement de troubles de la coagulation) est pensé pour jouer un rôle majeur. L'accumulation des données suggère qu'une grande partie de la pathologie observée n'est pas le résultat direct du virus induite par les dommages structurels, mais est plutôt due à la libération de médiateurs immunitaires solubles de EBOV les cellules infectées. Il est donc essentiel de comprendre comment le candidat peut être thérapeutique interrompre le processus de la maladie et / ou le ciblage de l'agent infectieux. Pour identifier les signatures génétiques qui sont les corrélats de protection, nous avons utilisé un microréseau d'ADN approche pour comparer les hôtes du génome entier de réponses EBOV infectés par les primates non humains (PNH) ont répondu à la thérapeutique candidats. Nous avons observé que, bien que la réponse globale immuns circulants a été similaire dans la présence et l'absence d'inhibiteurs de la coagulation, les PSN survivants regroupés. Des différences notables dans la coagulation des gènes associés semblait corrélée à la survie, qui a révélé un sous-ensemble de gènes différentiellement exprimés distinctement, dont 8 ligand des chimiokines (CCL8/MCP-2), qui peuvent fournir des cibles possibles pour le diagnostic à un stade précoce ou thérapeutiques futures. Ces analyses nous aideront à comprendre les mécanismes pathogènes de l'infection EBOV et à identifier les meilleures stratégies thérapeutiques.
