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- Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 1
- Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Part 2
- Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3
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Articles by Judy Yen in JoVE
JoVE General
Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 1
Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology
Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 1 di 3.
JoVE General
Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Part 2
Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology
Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 2 di 3.
JoVE General
Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3
Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology
Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 3 descrive il processo di fluorescenza etichettatura RNA amplificato da entrambi host e campioni di virus da aminoacidi accoppiamento allilico di coloranti. Parte 3 di 3.
Other articles by Judy Yen on PubMed
Vitali Citomegalovirus Umano Ricombinante Virus Con Un Interno Delezione Del Gene IE2 86 Colpisce Ultime Fasi Della Replicazione Virale
Utilizzando la tecnologia di cromosomi artificiali batterici (BAC), abbiamo costruito e caratterizzato un virus ricombinante citomegalovirus umano con una mutazione dell'esone specifico per l'importante regione immediata inizio 2 (IE2) prodotto del gene. IE2 86-kDa proteina risultante (IE2 86) ha un'eliminazione interna di aminoacidi 136 a 290 e si fonde al capolinea carboxy di avanzata proteina fluorescente verde (EGFP). L'eliminazione rimuove anche la metionina iniziatore e promotore della forma p40 di metionina IE2 e iniziatore per il modulo p60 della proteina, e quindi, non sono prodotti questi prodotti genici tardo. Il virus mutante IE2 86 Delta SX-EGFP è praticabile ma esibisce alterate le caratteristiche di crescita in coltura tissutale rispetto ad un full-length wild-type (wt) virus 86-EGFP IE2 o un virus revertanti. Quando le cellule sono infettate con il virus mutante a una molteplicità di basso di infezione (MOI), c'è un ritardo marcato nella produzione di virus infettivo. Questo è associato con più lento a cella diffusione del virus. Dall'analisi Western blot e immunofluorescenza, mostriamo che i primi passi nella replicazione del virus mutante sono paragonabili a quelli per la wt. Anche se c'è significativamente meno IE2 proteina nelle cellule infettate con il mutante, c'è solo un modesto ritardo nell'accumulazione iniziale dei 72 IE1 e proteine virali, le prime, e la replicazione del DNA virale procede normalmente. La mutazione ha anche solo un piccolo effetto sulla sintesi della proteina del capside virale importante. Il difetto molecolare più notevole nell'infezione da virus mutante è che i livelli di steady-state del pp65 (UL83) e pp28 proteine di matrice (UL99) sono notevolmente ridotti. Nel caso di UL83, ma non UL99, c'è anche una corrispondente diminuzione della quantità di mRNA presenti in cellule infettate con il virus mutante.
Infezione Delle Cellule Con Citomegalovirus Umano Durante La Fase S Si Traduce in Un Blocco Di Espressione Del Gene Immediato Precoce Che Può Essere Superata Mediante Inibizione Del Proteasoma
Le cellule infettate con citomegalovirus umano (HCMV) dopo che inizia la replicazione del DNA non avviare virale immediato precoce espressione genica (IE) e dividere prima di arrestare. Per determinare la natura di questo blocco, abbiamo esaminato le cellule che sono state infettate 24 h dopo il rilascio da g mediante immunofluorescenza, citometria a scansione laser e fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS). Circa il 40-50% delle cellule aveva contenuto di DNA di 2N, divenne il primo h 12 IE(+) e arrestato. La maggior parte ma non tutte le celle con > 2N contenuto di DNA non ha fatto esprimere antigeni IE fino a dopo la mitosi. Per definire la piccola popolazione di cellule IE(+) che gradualmente accumulate all'interno della S e G (2) m compartimenti, le cellule erano pulsati con bromodeoxyuridine (BrdU) appena prima dell'infezione in fase S e analizzati a postinfection di 12 h per l'espressione di gene IE, BrdU positività e posizione del ciclo cellulare. La maggior parte delle cellule del BrdU(+) erano IE(-) e avevano progredito in m G (2) o torna a g (1). La maggior parte del IE(+) cellule in S e G (2) m sono stati BrdU(-). Solo poche cellule erano IE(+) BrdU(+), e risiedevano in G (2) / M. Multipoint BrdU pulse-etichettatura ha rivelato che, rispetto alle cellule attivamente sintetizzano DNA all'inizio dell'infezione, una percentuale maggiore di cellule che ha avviato 4 h dopo la replicazione del DNA potrebbe esprimere antigeni di IE e procedere in S. sincronizzazione delle cellule con aphidicolin anche indicato che il blocco all'attivazione dell'espressione di gene di IE è stato istituito in cellule subito dopo l'avvio della replicazione del DNA. Sembra che una breve durata della proteina nelle cellule in fase S può essere necessaria per l'espressione di gene di IE, come esso è parzialmente restaurato da un trattamento con l'inibitore del proteasoma MG132.
L'attività Della Chinasi Ciclina-dipendente è Necessaria Nei Primi Istanti Per L'accurata Lavorazione E L'accumulo Di Citomegalovirus Umano UL122-123 E UL37 Immediate Inizio Trascrizioni E in Futuro Per La Produzione Di Virus
Infezione da citomegalovirus umano (HCMV) conduce al dysregulation di più proteine ciclo cellulare-normative. In questo studio, abbiamo esaminato gli effetti di inibizione dell'attività di chinasi ciclina-dipendenti (cdk) sulla replicazione virale. Con la droga Roscovitine, un inibitore specifico di chinasi ciclina-dipendente 1, 2, 5, 7 e 9, abbiamo dimostrato che durante il primo 6 h di infezione, ciclina-dipendente della chinasi-dipendente eventi si sono verificati che comprendeva l'elaborazione regolamentato e accumulo delle trascrizioni (IE) UL122-123-inizio immediate e trascrizioni UL36-37. Alterata elaborazione del UL122-123 ha portato ad una perdita di IE1-72 e un aumento in IE2-86. Il rapporto di impiombato a unspliced UL37 trascrizioni anche cambiate. Questi effetti non richiedono de novo sintesi proteica o la degradazione delle proteine dal proteasoma. Aggiunta di Roscovitine all'inizio dell'infezione era anche associato con l'inibizione dell'espressione di prodotti genici virali selezionati precoce, la replicazione del DNA virale e tarda espressione del gene virale. Quando Roscovitine è stato aggiunto dopo il primo 6 h di infezione, non sono stati osservati effetti sull'espressione genica di IE e replicazione virale procedette attraverso la fase tarda, ma titoli virali sono stati ridotti. La riduzione del titolo virale è stata osservata anche quando Roscovitine è stato prima aggiunto a postinfection di 48 h, che indica che l'attività della chinasi ciclina-dipendente è necessaria sia a IE e tempi tardi. Flavopiridol, un altro specifico inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti, ha avuto effetti simili su IE e precoce espressione genica. Questi risultati sottolineano l'importanza dell'accurata elaborazione di RNA e ribadire il ruolo significativo di fattori ciclo cellulare-normativi nell'infezione da HCMV.
Terapeutica Della Febbre Emorragica Ebola: Whole-genome Analisi Trascrizionale Di Mitigazione Malattia Successo
I meccanismi della patogenesi Ebola (EBOV) sono solo parzialmente comprensibili, ma la disregolazione della risposta immunitaria ospite normale (comprese distruzione dei linfociti, aumenta a livelli di citochine e di sviluppo di anomalie della coagulazione in circolazione) è pensato per giocare un ruolo importante. Accumulando prove suggerisce che gran parte della patologia osservata non è la diretta conseguenza di danni strutturali indotta dal virus ma piuttosto a causa del rilascio di mediatori immuni solubili da EBOV-cellule infette. È pertanto essenziale per capire come il candidato terapeutico possa essere interrompendo il processo di malattia o l'agente infettivo di targeting. Per identificare le firme genetiche che sono correlati di protezione, abbiamo utilizzato un approccio basato su microarray del DNA per confrontare le risposte genome-wide host di infezione di EBOV primati (NHPs) risponde a terapie candidato. Abbiamo osservato che, sebbene la risposta immunitaria circolo globale era simile in presenza e in assenza di inibitori della coagulazione, sopravvivendo NHPs raggruppati insieme. Differenze notevoli in geni associati a coagulazione apparvero per correlare con la sopravvivenza, che ha rivelato un sottoinsieme dei geni distintamente differenzialmente espressi, tra cui chemochina ligando 8 (CCL8/MCP-2), che può prevedere possibili obiettivi di fase diagnostica o terapeutica futura. Queste analisi ci aiuterà a comprendere i meccanismi patogenetici dell'infezione di EBOV e nell'individuazione di strategie terapeutiche migliori.
