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Articles by Justin S. Lenhart in JoVE
JoVE General
Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis
Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan-Ann Arbor
Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe beschrieben
Other articles by Justin S. Lenhart on PubMed
Mutationen in Der Bacillus Subtilis Beta Klemme, Die Seine Rolle in Der DNA-Replikation Von Konflikt Trennen Reparieren
Die Beta-Klemme ist eine wesentliche Replikation Gleitklemme für prozessualen DNA-Synthese benötigt. Die Beta-Klemme ist auch wichtig für einige zusätzliche Aspekte der DNA-Stoffwechsel, einschließlich DNA-Mismatch-Reparatur (MMR). Die dnaN5-Allel von Bacillus Subtilis codiert eine mutierte Form des Beta-Schelle, enthält die G73R-Substitution. Zellen mit der dnaN5-Allel sind temperaturempfindlich für Wachstum durch einen Defekt in der DNA-Replikation bei 49 Grad C, und sie zeigen eine Erhöhung in Mutation Frequenz durch einen teilweise defekt in MMR bei permissive Temperaturen verursacht. Wir ausgewählt für intragenic Dämpfer der dnaN5, die Lebensfähigkeit bei 49 Grad C zu bestimmen, ob der DNA-Replikation Fehler getrennt werden könnte gerettet aus der MMR-defekt. Wir isoliert drei intragenic Dämpfer der dnaN5, das Wachstum der nonpermissive Temperatur und gleichzeitig eine Erhöhung der Mutation Frequenz wiederhergestellt. Alle drei DnaN Allele codiert die G73R Substitution zusammen mit einem der drei neuartige Missense-Mutationen. Die Missense-Mutationen, die isoliert wurden, S22P, S181G und E346K. Von diesen befinden sich S181G und E346K in der Nähe der hydrophoben Hasenscharte der Beta-Klammer, einem gemeinsamen Standort von Proteinen, die die Beta-Klammer binden besetzt. Mit verschiedenen Methoden, zeigen wir, dass der Anstieg der Mutation Frequenz jedes Allel DnaN infolge eines Mangels in MMR verknüpft ist. Darüber hinaus fanden wir, dass S181G und E346K Wachstum bei erhöhten Temperaturen erlaubt und haben keine spürbare Auswirkung auf Mutation Frequenz von G73R getrennt. So fanden wir, dass bestimmte Rückstände Änderungen in der B. Subtilis-Beta-Klemme die Rolle der Beta-Klammer in der DNA-Replikation von ihrer Rolle in MMR trennen.
Unpassender Reparatur Ursachen Der Dynamischen Veröffentlichung Eine Wesentliche DNA-Polymerase Von Der Wiederholunggabel
Fehlanpassung Reparatur (MMR) korrigiert Störungen der DNA-Polymerase, die während der Morphologie. MMR ist kritisch für Genom-Wartung, und seinen Verlust steigert die Mutation Raten mehrere hundert Falten. Die jüngsten Arbeiten hat gezeigt, dass die Interaktion zwischen das Missverhältnis Anerkennung Protein MutS und der Replikation Processivity Klemme wichtig für MMR in Bacillus Subtilis. Um noch besser zu verstehen, wie MMR DNA Reproduktion gekoppelt ist, haben wir die subzellulare Lokalisation der MMR und DNA Replikation-Proteine, die verschmolzen zu grün fluoreszierendes Protein (GFP) in lebenden Zellen, nach eine Zunahme der Störungen der DNA-Replikation. Wir zeigen, dass die Brennpunkte der wesentliche DNA-Polymerase DnaE-GFP nach Missverhältnis Aufnahme verringern und Verlust von DnaE-GFP-Foki MutS erfordert. Darüber hinaus zeigen wir, dass MutS und MutL DnaE in vitro darauf hindeutet binden, dass DnaE gekoppelt ist, um zu reparieren. Wir fanden auch, dass DnaE-GFP-Herde-Abnahme in-vivo nach einer DNA Schäden-unabhängige Festnahme der DNA-Synthese, die zeigen, dass Verlust der DnaE-GFP-Foki Perturbationen DNA Replikation zurückzuführen ist. Wir schlagen MutS den DNA-Replikation-Maschinen, direkt Kontakte verursacht eine dynamische Veränderung in der Organisation der DnaE an der Wiederholunggabel während der MMR. Unsere Ergebnisse legen eine markante und intime Verbindung zwischen MMR und der replizierende DNA Polymerase-Komplex, der in-vivo.
