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Articles by Justin S. Lenhart in JoVE
JoVE General
イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌
Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan-Ann Arbor
詳細なプロトコルは、イメージングのためのDNA修復複合体のリアルタイムの形成を説明しています
Other articles by Justin S. Lenhart on PubMed
ミスマッチ修復からのDNA複製における役割を分離すること枯草菌ベータクランプの変異
βクランプはプロセッシブのDNA合成に必要不可欠な複製スライディングクランプです。 βクランプは、DNAミスマッチ修復（MMR）を含むDNA代謝のいくつかの追加の側面が重要です。枯草菌のdnaN5対立遺伝子はG73R置換を含むβクランプの変異型をエンコードします。 dnaN5対立遺伝子を持つ細胞は49℃でのDNA複製の欠陥に起因する成長のための温度感受性であり、それらは許容温度でMMRの部分的な欠陥によって引き起こされる突然変異頻度の増加を示しています。我々は、DNA複製欠陥がMMRの欠陥から分離することができたかどうかを判断するために49度Cで生存率を救出dnaN5の遺伝子内抑制のために選択されます。我々は突然変異頻度の増加を維持しながら、非許容温度での成長を復元したことdnaN5の3遺伝子内サプレッサーを単離した。すべての3つのdnaN対立遺伝子は3つの新規のミスセンス変異のいずれかに沿ってG73R置換をエンコードされています。隔離されたミスセンス変異は、S22P、S181G、とE346Kた。これらのうち、S181GとE346Kは、βクランプ裂、疎水性、βクランプに結合するタンパク質によって占有され一般的なサイトの近くに位置しています。いくつかの方法を用いて、各dnaN対立遺伝子に起因する変異頻度の増加はMMRの欠陥にリンクされていることを示しています。さらに、S181GとE346Kは、高温での成長を許さG73Rから分離されたときに変異頻度にかなりの効果を持っていなかったことがわかった。そこで、MMRにおけるその役割から、DNA複製のβクランプの役割を分離するクランプ枯草菌のβ内のその特定の残基の変化を発見しました。
ミスマッチ修復複製フォークから必要なDNAポリメラーゼの動的放出を引き起こす
ミスマッチ修復（MMR）はゲノムの複製中に発生するDNAポリメラーゼのエラーを修正します。 MMRは、ゲノム維持のために重要であり、その損失は、突然変異率を数百倍に増加します。最近の研究は、ミスマッチ認識タンパク質のMutSおよびレプリケーションプロセクランプとの間の相互作用が、枯草菌におけるMMRのために重要であることが示されている。さらにMMRは、DNA複製に結合されている方法を理解するために、我々はDNA複製エラーの増加に続いて、生細胞に緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合したMMRとDNA複製タンパク質の細胞内局在を調べた。我々は、本質的なDNAポリメラーゼDnaE-GFPの減少後に不一致の取り込みとDnaE-GFP病巣のその損失の焦点はのMutSが必要であることを示しています。さらに、我々のMutSおよびin vitroでのMutLバインドDnaEは、DnaEを修復するために結合されていることを示唆していることを示している。我々はまた、in vivoでのDnaE-GFP病巣の減少がDnaE-GFP病巣の損失を示すDNA合成のDNA損傷に依存しない停止がDNA複製に摂動によって引き起こされる、以下のことがわかった。私たちは、MMRの間に複製フォークにおけるDnaEの組織内の動的な変化を引き起こし、DNAの複製機構のMutSその直接コンタクトを提案する。我々の結果は、MMRおよびin vivoでの複製DNAポリメラーゼ複合体の間に印象的で親密な接続を確立します。
