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Articles by Karthik Mallilankaraman in JoVE
JoVE General
Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS
1Department of Biochemistry, Temple University, 2Department of Anesthesiology and Pain Medicine, University of Washington
Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.
Other articles by Karthik Mallilankaraman on PubMed
S-glutathionylation Attiva STIM1 E Altera L'omeostasi Mitocondriale
Lo stress ossidante influenza molti processi cellulari, tra cui la crescita cellulare, differenziazione e morte cellulare. Un legame riconosciuto tra questi processi e lo stress ossidante è via alterazioni nella segnalazione Ca(2+). Tuttavia, proprio come ossidanti influenzano Ca(2+) segnalazione rimane poco chiari. Lo stress ossidante portò a un cambiamento fenotipico in Ca(2+) mobilitazione un oscillatorio a un modello di elevata sostenuto tramite calcio attivato dal rilascio di calcio (CRAC) - mediata voce Ca(2+) capacitivo e molecola stromale interazione 1 (STIM1) - e Orai1-deficienti cellule resistenti agli stress ossidante. Funzionalmente, indotta da ossidante Ca(2+) voce altera mitocondriale Ca(2+) gestione e bioenergetica e trigger di morte delle cellule. STIM1 è S-glutathionylated a cisteina 56 in risposta allo stress ossidante ed evoca costitutiva Ca(2+) ingresso indipendente dei negozi Ca(2+) intracellulare. Questi esperimenti rivelano che cisteina 56 è un sensore per l'attivazione di ossidante-dipendente di STIM1 e dimostrare un legame molecolare tra lo stress ossidante e Ca(2+) segnalazione tramite il canale CRAC.
Un Vaccino DNA Altamente Ottimizzato Conferisce Immunità Protettiva Completa Contro Sfida Virus Della Coriomeningite Linfocitaria Letale Ad Alte Dosi
Protezione contro l'infezione è il segno distintivo dell'immunità e la base della vaccinazione efficace. Per una serie di motivi, c'è una grande richiesta per sviluppare nuovi vaccini più sicuri e più efficaci piattaforme. A questo proposito, mentre 'prima generazione' vaccini DNA erano scarsamente immunogenici, nuove strategie genetiche 'ottimizzazione' e l'applicazione di in vivo elettroporazione (EP) hanno notevolmente incrementato loro potenza. Abbiamo sviluppato un vaccino di DNA del plasmide altamente ottimizzato che esprime la proteina nucleocapsidica della Coriomeningite linfocitaria virus (LCMV) (NP) e valutata utilizzando il modello di sfida LCMV, un gold standard per lo studio di infezione e l'immunità. Quando somministrato per via intramuscolare con EP, robuste NP-specifico cellulare e umorale risposte immunitarie erano ha suscitate, le grandezze di cui si avvicinò a coloro che seguono l'infezione acuta LCMV. Inoltre, queste risposte sono state in grado di fornire protezione al 100% contro una sfida ad alte dosi, normalmente letale virus. Questo è il primo vaccino non infettivo che conferisce immunità protettiva completa fino a 8 settimane dopo la vaccinazione e dimostra il potenziale dei vaccini DNA 'next-generation'.
Un Vaccino a DNA Contro Il Virus Chikungunya è Protettivo Nei Topi E Induce Anticorpi Neutralizzanti Nei Topi E Primati
Chikungunya virus (CHIKV) è un alphavirus emergenti trasmesse dalle zanzare autoctone tropicali di Africa e Asia. Malattia acuta è caratterizzata da febbre, artralgie, congiuntivite, eruzione cutanea e talvolta l'artrite. Relativamente poco si sa circa le destinazioni antigeniche per l'immunità, e nessuna licenza vaccini o terapie attualmente disponibili per l'agente patogeno. Mentre la zanzara Aedes aegypti è il vettore primario, recenti evidenze suggeriscono che altri vettori in grado di trasmettere CHIKV alzando così preoccupazioni circa la sua diffusione di fuori di aree endemiche naturale a nuovi paesi tra cui Stati Uniti e in Europa. Considerando il potenziale di diffusione pandemica, comprendere che lo sviluppo dell'immunità è di primaria importanza per lo sviluppo di contromisure efficaci contro CHIKV. In questo studio, abbiamo isolato un nuovo virus CHIKV da un paziente umano acutamente infettato e sviluppato una scorta definita sfida virale nei topi che ci ha permesso di studiare la patogenesi virale e sviluppare un test di neutralizzazione virale. Abbiamo quindi costruito un vaccino DNA sintetico consegnato dall'elettroporazione in vivo (EP) che esprime una componente della glicoproteina busta CHIKV e utilizzato questo modello per valutare la sua efficacia. Vaccinazione indotta robuste antigene-specifiche del cellulare e umorale risposte immunitarie, che singolarmente sono stati in grado di fornire protezione contro sfida CHIKV nei topi. Inoltre, studi di vaccino in rhesus macaques dimostrato induzione di nAb risposte, che imitavano quelli indotti in convalescenza sieri umani. Questi dati suggeriscono un ruolo protettivo per nAb contro la malattia di CHIKV e supportare un'ulteriore studio dei vaccini DNA CHIKV basati su busta.
NF-kappaB Protegge Le Cellule Dalla Gamma Interferone Indotta RIP1-dipendente Necroptosis
Gli interferoni (IFN) sono citochine con proprietà antivirali e immunomodulatori ben descritto, ma meno è conosciuto circa i meccanismi che promuovono la morte delle cellule di sopravvivenza o di una cella. Qui, ci mostra che l'IFN-γ induce RIP1 chinasi-dipendente necroptosis in cellule di mammifero carenti nella segnalazione di NF-κB. Induzione di necroptosis di IFN-γ è stato trovato a dipendere dal Jak1 e parzialmente STAT1. Abbiamo anche dimostrare che l'IFN-γ attiva IκB kinase β (IKKβ)-dipendente da NF-κB per regolare un programma trascrizionale che protegge le cellule da necroptosis. Progressivo accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e l'eventuale perdita del potenziale di membrana mitocondriale nelle cellule manca la subunità NF-κB rilassarsi, indotta da IFN-γ. Analisi microarray intero genoma individuato sod2, codifica l'antiossidante enzima manganese superossido dismutasi (MnSOD), un gene di antinecroptotic Real target e potenzialità. Sovraespressione di MnSOD inibito accumulo di ROS mediata da IFN-γ e parzialmente salvato le cellule carenti relazioni da necroptosis, mentre l'interferenza del RNA (RNAi)-silenziamento mediato di sod2 espressione aumentata suscettibilità alla morte cellulare indotta da IFN-γ. Insieme, questi studi dimostrano che NF-κB protegge le cellule dall'IFN-γ-mediated necroptosis transcriptionally attivando una risposta di sopravvivenza che disseta ROS per preservare l'integrità mitocondriale.
Iperomocisteinemia Danneggia L'endotelio-derivato Hyperpolarizing Mediata Dal Fattore Vasorelaxation in Mouse Di Transgenici Cistationina Beta Sintasi-carenti
Iperomocisteinemia (HHcy) è associata a disfunzione endoteliale (de), ma il meccanismo è in gran parte sconosciuto. In questo studio, abbiamo studiato il ruolo e il meccanismo di HHcy-indotta ED in microvasculature nel nostro modello di mouse neonata di grave HHcy (omocisteina totale plasmatica, 169,5 μM). Abbiamo trovato che grave HHcy ha alterato l'ossido nitrico (NO) - e fattore hyperpolarizing endotelio-derivato (EDHF) - mediata, rilassamenti endotelio-dipendente delle piccole arterie mesenteriche (SMAs). Endotelio-indipendente e prostaciclina-mediata rilassamenti endotelio-dipendente non sono stati modificati. Un canale del potassio attivato Ca(2+) non selettivi (inibitore di K(Ca)) completamente bloccato relax EDHF-mediata. Bloccanti selettivi per piccolo-conduttanza K(Ca) (SK) o intermedio-conduttanza K(Ca) (IK) non è riuscito a inibire EDHF-mediata relax nei topi HHcy. HHcy aumentato i livelli di proteina SK3 e IK1, superossido (O(2)(-)) e 3-nitrotyrosine nell'endotelio di SMAs. Preincubazione con antiossidanti e perossinitrito (ONOO(-)) inibitori migliorate endotelio-dipendente ed EDHF-mediata rilassamenti e diminuita produzione O(2)(-) in SMAs da HHcy topi. Relax più ulteriormente, EDHF-mediata è stato inibito da ONOO(-) e impedito dalla catalasi nei topi di controllo. Infine, L-omocisteina ha stimolato la produzione di O(2)(-), che è stata invertita di antiossidanti e aumento dei livelli della proteina SK/IK e nitrazione di tirosina in colture umane microvascolare endothelial cellule cardiache. I nostri risultati suggeriscono che HHcy altera relax EDHF in SMAs inibendo le attività SK/IK tramite meccanismi correlati a nitrazione ossidazione - e tirosina.
Requisito Di FADD, NEMO E BAX/BAK Per Aberrante Funzione Mitocondriale in Necrosi Fattore Di Necrosi Tumorale Alfa-indotta
Necroptosis rappresenta una forma di morte cellulare programmata alternativi che dipende la chinasi RIP1. RIP1-dipendente necroptotic morte si manifesta come produzione di specie (ROS) aumentato reattive dell'ossigeno nei mitocondri ed è accompagnata da perdita di biogenesi ATP ed eventuale dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale. Qui, ci mostra che il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α)-indotto necroptosis richiede proteine adattatore FADD e NEMO. FADD è stato trovato a mediare la formazione del complesso della chinasi indotta da TNF-α pronecrotic RIP1-RIP3, mentre la subunità IκB Kinase (IKK) NEMO sembra funzionare a valle del RIP1-RIP3. È interessante notare, perdita di relazioni potenziate TNF-α-dipendente necroptosis, che indica che NEMO regola necroptosis indipendentemente da NF-κB. Utilizzando approcci farmacologici e genetici, dimostriamo che la sovraespressione di antiossidanti allevia necroptosis ed elevazione di ROS. Infine, eliminazione di BAX e BAK o sovraespressione di Bcl-x(L) protegge le cellule da necroptosis in un passo successivo. Questi risultati forniscono la prova che i mitocondri svolgono un ruolo di amplificazione in infiammazione indotta da necroptosis.
Acidosi Indotta Da Ipossia Disaccoppia Il STIM-Orai Calcio Complesso Di Segnalazione
Le proteine Ca(2+)-sensing STIM reticolo endoplasmatico mediano segnali voce Ca(2+) di accoppiamento per attivare canali di membrana plasmatica Orai. Vi sveliamo che STIM-Orai giunto rapidamente è bloccato da ipossia e la conseguente diminuzione del pH citosolico. Nelle cellule muscolari lisce o cellule HEK293 coexpressing STIM1 e Orai1, condizioni ipossiche acute rapidamente bloccati operati dal negozio Ca(2+) voce e la Ca(2+) Orai1-mediato rilascio-attivato Ca(2+) corrente (I(CRAC)). Blocco ipossia-indotto della voce Ca(2+) e I(CRAC) è stato invertito da NH(4) (+)-indotta citosolico alcalinizzazione. L'ipossia e l'acidificazione sia bloccato I(CRAC) indotta dalla breve regione STIM1 Orai-attivazione. Sebbene l'ipossia indotta STIM1 traslocazione in giunzioni, esso non ha fatto dissociare il complesso STIM1-Orai1. Tuttavia, sia ipossia e acidosi citosolico rapidamente diminuita Förster resonance energy transfer (FRET) tra STIM1-YFP e Orai1-CFP. Così, anche se l'ipossia promuove accumulo giunzionale STIM1, la conseguente acidificazione spariglia funzionalmente il complesso STIM1-Orai1 fornendo un importante meccanismo che protegge le cellule da sovraccarico Ca(2+) in condizioni di stress ipossico.
