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Articles by Katalin Kariko in JoVE
JoVE Neuroscience
Iniezione di sangue autologo Modello spontanea emorragia intracerebrale in topi
1Department of Neurology, University of Connecticut Health Center, 2Department of Neurology, School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Neurosurgery, Hartford Hospital, 4Department of Neurosurgery, School of Medicine, University of Pennsylvania
L'iniezione di sangue autologo modello di emorragia intracerebrale in topi descritti in questo protocollo utilizza la tecnica di iniezione doppio per minimizzare il rischio di reflusso del sangue il percorso dell'ago, non anticoagulanti nel sistema di pompaggio, ed elimina tutto lo spazio morto e tubi espandibili nel sistema.
Other articles by Katalin Kariko on PubMed
MRNA Extracellulare Induce L'attivazione Delle Cellule Dendritiche Stimolando La Secrezione Di Fattore Di Necrosi Tumorale-alfa, E Segnalando Tramite Un Recettore Di Nucleotidi
Abbiamo dimostrato in precedenza che cellule dendritiche (DC) pulsare con mRNA codifica l'antigene ha portato a carico di entrambi complesso maggiore di istocompatibilità di classe I e II dell'antigene presentazione percorsi e la consegna di un segnale di attivazione. Coculture del mRNA-pulsed DC con cellule T ha condotto per l'induzione di una potente risposta immunitaria primaria. DC, oltre a riconoscere antigeni estranei tramite recettori di riconoscimento di pattern, inoltre deve rispondere per sé alterato, trasformato, o cellule infettate intracellularly. Questo si verifica attraverso i recettori di superficie cellulare che riconoscono i prodotti dell'infiammazione e delle cellule morte. In questa relazione, ci caratterizzano due percorsi di segnalazione utilizzati da extracellulare mRNA per attivare DC. In aggiunta, un romanzo ligando, poli (a), che media la segnalazione attraverso un recettore che può essere inibito dalla tossina pertosse e suramina e può essere desensibilizzato da ATP e ADP, suggerendo un recettore di nucleotide P2Y tipo è identificato. Viene discusso il ruolo di questa segnalazione attività nel design del vaccino e l'effetto potenziale di mRNA rilasciati dalle cellule danneggiate nell'induzione della risposta immunitaria.
Fattore Piastrinico 4 Si Lega Ai Recettori Delle Lipoproteine a Bassa Densità E Sconvolge Il Macchinario Endocitico, Con Conseguente Ritenzione Delle Lipoproteine a Bassa Densità Sulla Superficie Della Cellula
L'influenza delle piastrine sul metabolismo cellulare delle lipoproteine aterogeno non è stata caratterizzata in dettaglio. Pertanto, abbiamo studiato l'effetto del Fattore piastrinico 4 (PF4), una proteina cationica rilasciata in alta concentrazione di piastrine attivate, sull'assorbimento e degradazione delle lipoproteine a bassa densità (LDL) tramite il recettore LDL (LDL-R). Associazione LDL-R-dipendente, l'interiorizzazione e degradazione di LDL da cellule coltivate erano inibiti 50%, 80% e 80%, rispettivamente, sull'aggiunta di PF4. PF4 legato specificamente al dominio ligand-legantesi di recombinant solubile LDL-R (metà-massima 0,5 microg/mL PF4 di associazione) e parzialmente (50% circa) ha inibito il legame delle LDL. L'inibizione della degradazione di PF4 e interiorizzazione necessaria la presenza di proteoglicani cella-associati, soprattutto quelli ricchi di condroitina solfato. PF4 varianti con l'associazione eparina alterata mancavano la capacità di inibire la LDL. PF4, solubile LDL-R, e LDL formano complessi ternari con superficie cellulare proteoglicani. PF4 indotta la ritenzione dei complessi di LDL/LDL-R sulla superficie dei fibroblasti umani in multimolecular cluster non associati con pozzi rivestiti, come valutato da immuno-microscopia elettronica. Questi studi dimostrano che PF4 inibisce il catabolismo delle LDL in vitro in parte dai concorrenti per l'associazione di LDL-R, promuovendo le interazioni con cell-associated Condroitin solfato dei proteoglicani e interrompendo il normale traffico endocitico di complessi di LDL/LDL-R. Ritenzione di LDL sulla superficie delle cellule possa facilitare le modifiche proatherogenic e sostenere un ruolo più ampio per le piastrine nella patogenesi dell'aterosclerosi.
Inibizione Dell'infezione Da HIV-1 Da Piccola Interferenza RNA-mediata RNA Interferente
Interferenza del RNA (RNAi) è un antico risposta antivirale che elabora dsRNA e associa in una complessa di nucleasi che identifica RNA con omologia di sequenza e in particolare si fende. Dimostriamo che RNAi mediata da 21-bp dsRNA specificamente inibisce la infezione da HIV-1 della cellula permanente e le cellule T CD4(+) primarie. L'inibizione della replicazione dell'HIV è stato misurato da Gag p24 contenuto proteico in analisi supernatante, Northern blot e PCR del DNA per i prodotti della trascrizione inversa. L'inibizione verificato in due punti del ciclo di vita virale, dopo la fusione e prima trascrizione d'inversione e durante la trascrizione di RNA virale da provirus integrato. Trattamento dell'infezione da HIV attivato le cellule T CD4(+) con un siRNA derivatizzata fluoro che è resistente alle RNasi A reso simile inibizione dell'infezione da HIV. Inoltre, i siRNA derivatizzata potrebbe essere trasportato senza lipofectin complessanti e in presenza di siero. L'identificazione di RNAi attività contro l'HIV-1 presenta un nuovo approccio per studiare le infezioni virali e una prova del concetto di attività antivirale RNAi in cellule di mammifero.
MRNA è Un Ligando Endogeno Per Recettore Toll-like 3
Recettori toll-like (TLR) sono il base segnalazione recettori del sistema immunitario innato. Essi sono attivati da molecole associate con agenti patogeni o cellule ospiti feriti e tessuto. TLR3 ha dimostrato di rispondere al RNA double-stranded (ds), un intermediario di replica per molti virus. Presentiamo qui le prove che eterologa RNA rilasciato da o connesso con le cellule necrotiche o generati da trascrizione in vitro anche stimola TLR3 e induce attivazione immunitaria. Per valutare l'attivazione TLR3 RNA-mediata, cellule renali embrionali umane 293 stabilmente esprimendo TLR3 e contenente un reporter luciferasi dipendente dal fattore-kappaB nucleare sono state generate. Esporre queste cellule in vitro RNA trascritto ha provocato un'induzione TLR3-dipendente della secrezione di luciferase attività e interleuchina-8. Trattamento con mRNA trascritti in vitro attivato nuclear factor-kappaB via TLR3 attraverso un processo che è stato di fosforilazione della tirosina dose-dipendente e coinvolti. Inoltre, in vitro trascritto naturale o 2'--fluoro sostituito mRNA indotta l'espressione di TLR3, interferon regulatory factor-1, fattore di necrosi tumorale-alfa e interleuchina-1 receptor-associated kinase-M mRNA in cellule dendritiche (DCs). DCs ha risposto al trattamento di mRNA che esprimono marcatori di attivazione, e questa maturazione è stata inibita dall'anticorpo TLR3 specifico antagonista. RNA endogeno rilasciato da o connesso con le cellule necrotiche anche stimolato DCs, che portano alla secrezione di interferone-alfa, che potrebbe essere abolita dal pretrattamento delle cellule necrotiche con RNAsi. Questi risultati dimostrano che RNA, probabilmente attraverso la struttura secondaria, è un potente attivatore host-derivato di TLR3. Questa constatazione ha potenziale rilevanza fisiologica perché RNA fuga dal tessuto danneggiato o contenuti all'interno di endocytosed cellule potrebbero servire come un ligando endogeno per TLR3 che induce o altrimenti modula la risposta immunitaria.
Cutting Edge: Sistema Immunitario Innato Discrimina Tra RNA Contenenti Batterica Versus Eucariotiche Caratteristiche Strutturali Che Adescare Per La Secrezione Di IL-12 Ad Alto Livello Di Cellule Dendritiche
RNA derivato da fonti batteriche ma non eucariotiche, quando transfected in precursori di cellule dendritiche umane monocyte-derivati, induce la secrezione di IL-12 ad alto livello in collaborazione con stimoli di maturazione delle cellule dendritiche. In vitro-trascritto mRNA che imita la struttura del mRNA batterici nella mancanza di una 3'-poly(A) lunga coda similarmente induce la secrezione di IL-12, ma questa proprietà è persa su efficienza enzimatica 3'-poliadenilazione. Tra l'altro RNAs testato, solo polyuridylic acido indotta p70 IL-12. Questo fenomeno di risposta RNA appare biologicamente distinto dalla risposta classicamente definita a dsRNA. RNA-transfected APC polarizzare anche cellule T in maniera dipendente dal-12 verso il fenotipo Th1 IFN-gamma (alta) IL-5 (basso), suggerendo un legame tra il rilevamento del RNA adeguatamente strutturato e l'inclinazione delle risposte immunitarie verso quelli meglio adatto per il controllo dei microbi intracellulari. RNA strutturato per emulare modelli batteriche costituisce una strategia di romanzo vaccino per suscitare polarizzata risposta immunitaria di tipo Th1.
Small Interfering RNAs Mediare Soppressione Indipendente Dalla Sequenza Genica E Indurre Attivazione Immunitaria Di Segnalazione Attraverso Il Recettore Toll-like 3
Piccolo interferenti (si) e breve tornante (sh) RNAs indurre robusto degradazione dei mRNAs omologhe, che li rende un potente strumento per realizzare il silenziamento genico in cellule di mammifero. Silenziamento di siRNA è ampiamente utilizzato perché è considerato altamente specifico per il gene mirato, anche se un recente rapporto suggerisce che siRNA inducono anche segnalazione attraverso il tipo I sistema IFN. Quando Rene embrionale umano 293 (HEK293) o linee cellulari di cheratinociti (HaCaT) o cellule dendritiche umane primarie o macrofagi erano transfected con siRNA o shRNAs, è stata rilevata la soppressione dell'espressione del mRNA immaturi. Inoltre, siRNA e shRNA, indipendente delle loro sequenze, avviata attivazione immunitaria, tra cui IFN-alfa e la produzione di TNF-alfa e aumentata espressione di HLA-DR, transfected macrofagi e cellule dendritiche. I siRNAs indotta da livelli bassi, ma significativi, di IFN-beta cellule HEK293 e HaCaT. Secrezione di queste citochine aumentato immensamente quando HEK293 cellule recettore Toll-like overexpressed 3 (TLR3), e l'aumentata secrezione di IFN-beta è stata inibita da coexpression di un inibitore di TIR dominio-contenente induttori adattatore IFN-beta, la proteina dell'adattatore TLR3 collegata a IFN fattore regolatore 3 segnalazione. Sebbene siRNA e shRNA atterramento di geni rappresenta un nuovo e potente strumento, non è senza effetti aspecifici, che dimostriamo che sono in parte mediato da segnali attraverso TLR3.
Breve Interfering RNA-mediata Inibizione Del Virus Herpes Simplex Tipo 1 Espressione Genica E La Funzione Durante L'infezione Di Cheratinociti Umani
Interferenza del RNA (RNAi) è un meccanismo antivirale che viene attivato quando il RNA double-stranded è scisso in frammenti, chiamati breve RNA interferente (siRNA), che primo un inducible gene silencing complesso enzimatico. Abbiamo applicato la RNAi contro un virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) gene, glicoproteina E, che media diffusa cellula-cellula ed evasione immune. In un modello in vitro di infezione, cheratinociti umani erano transfected con specifico per la glicoproteina E siRNA e quindi infettati con HSV-1 wild-type. RNAi-mediata del gene silencing riprodotto il fenotipo placca piccola di un virus mutante gE-eliminazione. La specificità di gene targeting è stata dimostrata da analisi Northern blot e citometria a flusso. SiRNA esogeno può sopprimere HSV-1 glicoproteina E espressione e funzione durante un'infezione attiva in vitro attraverso la RNAi. Questo lavoro stabilisce RNAi come strumento di genetico per lo studio di HSV e fornisce una base per lo sviluppo di RNAi come un romanzo terapia antivirale.
SiRNA Esogeno Da Intermediario Soppressione Indipendente Dalla Sequenza Genica Di Segnalazione Attraverso Il Recettore Toll-like 3
Interferenza del RNA (RNAi) è un metodo potente che sopprime in particolare espressione genica in modo sequenza-dipendente cui macchinari sono trovato negli organismi da funghi ai mammiferi. Le cellule di mammiferi hanno sviluppato un sistema indipendente dalla sequenza di soppressione genica spesso indotta dalla replicazione virale che include il riconoscimento del RNA double-stranded (dsRNA) attraverso il recettore Toll-like 3 (TLR3) e induzione della sintesi di interferone di tipo I. Interferone attiva la trascrizione di una serie di geni, tra cui la chinasi di proteina attivata mediante dsRNA che sopprime la sintesi proteica e 2' -5 '-oligoadenylate sintetasi, che genera un prodotto che attiva la RNasi L per fendere il RNA in modo indipendente dalla sequenza. Abbiamo osservato che 21-bp dsRNA, mediatore chiave di RNAi, non solo induce soppressione specifica sequenza genica, ma anche segnali TLR3 per indurre l'interferone di tipo I e attiva indipendente dalla sequenza di soppressione della sintesi proteica e la valorizzazione della degradazione di mRNA. Questa soppressione indipendente dalla sequenza è stata dimostrata per entrambi un gene reporter esogenicamente amministrato così come durante il targeting dei geni virali nel corso della acuta herpes simplex virus tipo I infezione dei cheratinociti. TLR3 è espressa da molti tipi di cellule primarie e linee cellulari, questa soppressione indipendente dalla sequenza dovrebbe essere considerata nella progettazione di esperimenti usando piccole soppressione d'interferenza di RNA-mediata del gene.
Induzione Della Tolleranza All'ischemia Focale Nel Cervello Del Ratto: Dissociazione Tra Lesioning Corticale E Depressione Di Diffusione
Applicazione corticale di KCl in precedenza ha dimostrato di indurre tolleranza per un successivo episodio di ischemia cerebrale. KCl episodi ricorrenti di depressione di diffusione corticale si innesca e produce una piccola lesione presso il sito di applicazione corticale. Per determinare che se una lesione corticale da sola è sufficiente per indurre tolleranza all'ischemia, gli autori hanno utilizzato 5-mol/L NaCl di precondizione cervello ratto 3 giorni prima permanente dell'occlusione dell'arteria cerebrale media. NaCl ha prodotto una piccola lesione presso il sito di applicazione senza evocare la depressione di diffusione corticale. Precondizionamento con 5-mol/L NaCl significativamente attenuato la diminuzione in CBF dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media e ridotto il volume dell'infarto corticale del 35%. I risultati mostrano che una piccola lesione corticale, di per sé, è sufficiente per indurre tolleranza all'ischemia.
Inibizione Del Recettore Toll-like E Cytokine Signaling - Un Tema Unificante Nella Tolleranza Ischemica
Ischemia cerebrale provoca infiammazione acuta, che aggrava il danno cerebrale primario. L'attivazione del sistema immunitario innato è un componente importante di questa risposta infiammatoria. L'infiammazione si verifica attraverso l'azione di citochine proinfiammatorie, come TNF, IL-1 beta e IL-6, che alterano il sangue fluire e aumentare la permeabilità vascolare, portando così alla ischemia secondaria e accumulo di cellule immunitarie nel cervello. Produzione di queste citochine è iniziata da segnalazione attraverso i recettori Toll-like (TLR) che riconoscono molecole derivate da host rilasciati da cellule e tessuti lesionati. Recentemente, sono stati fatti grandi progressi nella comprensione della regolazione del sistema immunitario innato, particolarmente i meccanismi di segnalazione di TLR. feedback negativo inibitori TLR e citochine infiammatorie ora sono stati identificati e caratterizzati. È anche evidente che zattere lipidiche presenti nelle membrane e giocano un ruolo negli eventi di segnalazione infiammatori mediata dal recettore. Nella presente recensione, usando questo appena disponibile vasto corpo di conoscenza, diamo uno sguardo fresco presso gli studi di tolleranza ischemica. Sulla base di questa analisi, riconosciamo una somiglianza impressionante tra tolleranza ischemica e tolleranza di endotossine, uno stato immunitario soppressiva caratterizzata da hyporesponsiveness al lipopolisaccaride (LPS). In considerazione di questa analogia e considerando le recenti scoperte relative ai meccanismi molecolari di tolleranza di endotossine, abbiamo postulato che l'inibizione di TLR e proinflammatory cytokine signaling criticamente contribuisce alla tolleranza ischemica nel cervello e in altri organi. Tolleranza ischemica è un meccanismo protettivo, indotto da una varietà di stimoli di precondizionamento. Tolleranza può essere stabilita con due profili temporali: (i) una forma rapida, in cui il trigger induce tolleranza all'ischemia in minuti e (ii) una forma ritardata in cui lo sviluppo della protezione richiede diverse ore o giorni e richiede sintesi proteica de-novo. Rapida forma di tolleranza è raggiunto da un'ingerenza diretta con fluidità di membrana, causando la rottura delle zattere lipidiche che portano all'inibizione del TLR/cytokine signaling pathways. In forma ritardata di tolleranza, lo stimolo precondizionamento prima innesca i percorsi TLR/citochina infiammatori, che portano non solo per l'infiammazione, ma anche per simultanea sovraregolazione di inibitori di feedback di infiammazione. Questi inibitori, che includono gli inibitori di segnalazione, i recettori decoy, citochine anti-infiammatorie, riducono la risposta infiammatoria a un successivo episodio di ischemia. Questa romanzo interpretazione del meccanismo molecolare della tolleranza ischemica evidenzia nuove vie per la futura indagine nella prevenzione e nel trattamento di ictus e malattie correlate.
Soppressione Del Riconoscimento Di RNA Da Recettori Toll-like: L'impatto Della Modifica Di Nucleosidi E L'origine Evolutiva Di RNA
DNA e RNA stimolano il sistema immunitario innato dei mammiferi attraverso l'attivazione dei recettori Toll-like (TLR). DNA che contengono motivi CpG metilati, tuttavia, non è stimolante. Selezionato nucleosidi naturali RNA sono anche metilato o altrimenti modificato, ma gli effetti immunomodulatori di queste alterazioni rimangono non testati. Mostriamo che RNA segnali attraverso umana TLR3, TLR7 e TLR8, ma incorporazione di nucleosidi modificati m5C, m6A, m5U, s2U o pseudouridine distrugge attività. Le cellule dendritiche (DCs) esposti a tali express RNA modificato significativamente meno marcatori citochine e l'attivazione di quelli trattati con RNA non modificato. DCs e le cellule che esprimono TLR sono potentemente attivate da RNA mitocondriale e batterica, ma non da RNA totale dei mammiferi, che è abbondante nei nucleosidi modificati. Concludiamo che le modifiche nucleoside sopprimono il potenziale di RNA per attivare DCs. Il sistema immunitario innato può quindi rilevare RNA privo di modificazione del nucleoside come mezzo di rispondere in modo selettivo ai batteri o tessuto necrotico.
Precondizionamento Cerebrale Corticale Applicazione Di Soluzioni Saline Ipertoniche: Upregulation Dei MRNAs Encoding Inibitori Dell'infiammazione
Precedenti studi hanno dimostrato che la applicazione locale di ipertonica KCl o NaCl alla corteccia cerebrale induce tolleranza per un successivo episodio di ischemia. L'obiettivo del presente studio era di determinare se l'applicazione di questi sali aumenta i livelli di mRNA codifica inibitori dell'infiammazione. Ipertonica KCl o NaCl è stato applicato per 2 h a corteccia frontale dei ratti Sprague-Dawley. Dopo periodi di recupero fino a 24 h, livelli di mRNA selezionati sono stati misurati nei campioni da frontale e corteccia parietale usando del nord le macchie. Applicazione di KCl ipertonica ha causato un aumento rapido e diffuso nei livelli di mRNA che codifica per il fattore di necrosi tumorale (TNF), tristetraprolin (TTP), suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS3) e il brain-derived neurotrophic factor (BDNF) e una 24-h ritardata induzione di ciliary neurotrophic factor (CNTF) mRNA. Applicazione di NaCl ipertonica causato alterazioni nei livelli di mRNA che erano limitati alla corteccia frontale. In questa regione, applicazione di NaCl rapidamente aumentati livelli di mRNA codifica TNF, TTP e SOCS3, ma non BDNF e ha causato una ritardata ad induzione di CNTF mRNA. Questi risultati aumentare la possibilità che sovraregolazione di inibitori dell'infiammazione dopo precondizionamento può contribuire all'induzione della tolleranza all'ischemia.
GP340 Espresso Su Epiteli Genitali Umani Si Lega La Proteina Envelope Di HIV-1 E Facilita La Trasmissione Virale
Durante la trasmissione sessuale dell'HIV nelle donne, le prime cellule suscettibili di essere infetti sono sottomucosa cellule CD4(+) T e le cellule dendritiche del tratto genitale inferiore. L'HIV è segregato da queste cellule bersaglio da uno strato di cellule epiteliali che può essere bypassato anche quando sana e intatta. Per capire come l'HIV penetra questa barriera, abbiamo identificato una proteina host, gp340, che si è espresso sull'epitelio genitale e si lega la busta del HIV attraverso un'interazione proteina-proteina specifica. Questa associazione consente altrimenti subinfectious quantità di HIV per infettare efficientemente le celle di destinazione e permette questa infezione si verifichi per un periodo prolungato di tempo dopo l'associazione. I nostri risultati suggeriscono un meccanismo di entrata virale durante la trasmissione eterosessuale dove l'HIV è associato a epiteli genitali intatti, che quindi promuove gli eventi iniziali dell'infezione. Comprensione di questo passaggio nell'inizio dell'infezione consentirà lo sviluppo di strumenti e metodi per bloccare la trasmissione dell'HIV.
Naturalmente Le Modifiche Nucleoside Sopprimono L'attività Immunostimolante Di RNA: Implicazioni Per Lo Sviluppo Di RNA Terapeutico
DNA e RNA stimolano il sistema immunitario innato dei mammiferi innescando una varietà di sensori, tra cui i recettori Toll-like (TLR). TLR9 segnali su esposizione al DNA, mentre TLR3, TLR7 e TLR8 rispondere al RNA. La maggior parte dei DNA e RNA da fonti naturali contengono nucleosidi modificati. Metilazione di motivi CpG in blocchi di DNA TLR9 segnalazione. Solo di recente è stata affrontata la questione se un effetto analogo può essere attribuito alle modifiche del nucleoside in RNA. Questa recensione caratterizza alcuni naturally occurring nucleoside modifiche di RNA e loro influenza sulla capacità del RNA per attivare le cellule immunitarie e TLR. RNAs contenente nucleosidi modificati e quindi privo di proprietà di attivazione immunitaria, hanno potenziale importanza nelle applicazioni cliniche.
Soppressione Di Angiogenesi E Indipendente Dalla Sequenza E Dal Target Di SiRNA Via TLR3
Studi clinici di piccolo RNA interferente (siRNA) targeting vascular endothelial growth factor-A (VEGFA) o il suo recettore VEGFR1 (chiamato anche FLT1), nei pazienti con neovascolarizzazione coroidale accecante (CNV) da degenerazione maculare legata all'età, sono Premessa sul silenziamento genico mediante intracellulare interferenza del RNA (RNAi). Dimostriamo invece che l'inibizione CNV è un effetto di siRNA-classe: 21-nucleotide o più siRNA targeting mammiferi geni, geni non espresso, sequenze non-genomiche, geni pro - e anti-angiogenica e siRNA RNAi-incompetente soppressa CNV nei topi in modo paragonabile a siRNA targeting Vegfa o Vegfr1 senza RNAi fuori bersaglio o attivazione di interferone-alfa/beta. Non mirati (contro mammiferi geni) e mirati (contro Vegfa o Vegfr1) siRNA soppressa CNV via superficie cellulare recettore toll-like 3 (TLR3), adattatore TRIF e induzione di interferone-gamma e interleuchina-12. SiRNA mirate non soppressa efficacemente come Vegfa siRNA dermico neovascolarizzazione nei topi. inibizione siRNA-indotta della neovascolarizzazione necessaria una lunghezza minima di 21 nucleotidi, una passerella necessità in un complesso di TLR3-RNA modellato 2:1. Le cellule endoteliali della coroide da persone che esprimono la variante 412FF del codifica TLR3 erano refrattarie al extracellulare citotossicità indotta da siRNA, facilitando la terapia farmacogenetica individualizzata. Più tipi di cellule endoteliali umane espresse superficie TLR3, indicando che gli siRNA generici potrebbero trattare angiogenic malattie che interessano l'8% della popolazione mondiale, e che siRNA potrebbero indurre effetti imprevisti vascolari o immuni.
Incorporazione Di Pseudouridine in MRNA Rendimenti Superiori Vector Nonimmunogenic Con Maggiore Capacità Traslazionale E Stabilità Biologica
In vitro-trascritto mRNA codificano per proteine fisiologicamente importante avere notevoli potenzialità per applicazioni terapeutiche. Tuttavia, nella sua forma attuale, mRNA è irrealizzabile per uso clinico a causa della sua natura labile e immunogenico. Qui, abbiamo studiato se incorporazione di nucleotidi modificati naturalmente in trascrizioni conferirebbe maggiore proprietà biologiche di mRNA. Abbiamo trovato che mRNAs contenente pseudouridines hanno una maggiore capacità traslazionale che non modificato mRNAs quando testati in cellule di mammifero e lisati o somministrato per via endovenosa in topi a 0,015-0,15 mg/kg le dosi. Consegnati mRNA e la proteina codificata potrebbe essere rilevati nella milza a 1, 4 e 24 ore dopo l'iniezione, dove entrambi i prodotti erano a livelli significativamente più alti quando pseudouridine-contenente mRNA è stato somministrato. Anche a dosi più elevate, solo il mRNA non modificato è stato immunogenico, inducendo i livelli sierici elevati di interferone-alfa (IFN-alfa). Questi risultati indicano che la modificazione del nucleoside è un approccio efficace per migliorare la stabilità e la capacità di traslazione del mRNA mentre diminuisce la sua immunogenicità in vivo. Proprietà migliorata conferiti da pseudouridine rendono tale mRNA uno strumento promettente per la sostituzione del gene e la vaccinazione.
Incorporazione Di Pseudouridine in MRNA Migliora La Traduzione Da Diminuzione Attivazione PKR
Studi precedenti hanno mostrato che il livello di traduzione di in vitro trascritto RNA messaggero (mRNA) è rafforzato quando sua uridines sono sostituiti con pseudouridines; Tuttavia, la ragione di questo miglioramento non è stata identificata. Qui, ci dimostrano che le trascrizioni in vitro contenente uridina attivano la chinasi di proteina RNA-dipendente (PKR), che poi tirosine traduzione iniziazione fattore 2-alfa (FEI-2α) e inibisce la traduzione. Al contrario, in vitro mRNA trascritto contenente pseudouridine attiva PKR in minor grado e traduzione di pseudouridine contenente mRNA non è represso. Saggi di pull-down RNA dimostrano che mRNA contenente uridina è vincolato da PKR in modo più efficiente di mRNA con pseudouridine. Infine, il ruolo di PKR è convalidato mostrando che RNAs pseudouridine e uridina contenenti - sono state tradotte ugualmente in celle knockout PKR. Questi risultati indicano che la traduzione avanzata dei mRNAs contenente pseudouridine, rispetto a quelli contenenti uridina, è mediata dalla diminuita attivazione di PKR.
DICER1 Deficit Induce Tossicità Alu RNA Nella Degenerazione Maculare Legata All'età
Atrofia geografica (GA), un'incurabile forma avanzata di degenerazione maculare legata all'età, deriva dalla degenerazione delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Qui vi mostriamo che i microRNA (miRNA)-elaborazione enzima DICER1 è ridotto in RPE degli esseri umani con GA e che l'ablazione condizionale di Dicer1, ma non sette altri miRNA-elaborazione enzimi, induce degenerazione RPE nei topi. DICER1 atterramento induce accumulo di Alu RNA nelle cellule umane RPE e Alu-come B1 e B2 RNAs in mouse RPE. Alu RNA è aumentato nell'EPR degli esseri umani con GA, e questo RNA patogeno induce citotossicità RPE umana e degenerazione RPE nei topi. Oligonucleotidi antisenso targeting Alu/B1/B2 RNAs prevenire DICER1 deplezione indotta la degenerazione del RPE nonostante downregulation dei miRNA globale. DICER1 degrada Alu RNA, e questo digerito Alu RNA non può indurre degenerazione RPE nei topi. Questi risultati rivelano una funzione di sopravvivenza miRNA-indipendente dalla cellula per DICER1 che comportano degrado trascrizione retrotrasposoni, mostrano che la Alu RNA può direttamente causare patologia umana e identificare nuovi bersagli per delle principali cause di cecità.
Deplezione Dei Neutrofili Diminuisce Infiltrazione Di Monociti E Migliora Il Risultato Funzionale Dopo Emorragia Intracerebrale Sperimentale
L'infiammazione contribuisce a lesioni secondarie e perdita di neuroni dopo emorragia intracerebrale, ma non è chiaro il ruolo delle singole popolazioni immuni in questi processi. In un modello murino, l'iniezione di sangue autologo nello striato è stato associato con un infiltrato di cellule infiammatorie intenso composto da neutrofili, monociti e cellule dendritiche. Deplezione selettiva dei neutrofili ha provocato diminuita infiltrazione di monociti e migliorati gli esiti funzionali al post-hemorrhage giorno 3. Questi risultati indicano che l'infiltrazione dei neutrofili nel sito di emorragia contribuisce alla lesione cerebrale da danno cellulare diretto o il reclutamento dei monociti.
Le Modifiche Del Nucleoside in RNA Limitano Attivazione Di 2' -5 '-oligoadenylate Sintetasi E Aumento Di Resistenza Alla Scissione Da RNAsi L
Gli enzimi interferone indotta 2' -5 '-oligoadenylate sintetasi (OAS) e RNasi L sono componenti chiave dell'immunità innata coinvolti nella sensoriale e funzioni effettrici seguendo le infezioni virali. Su binding RNA bersaglio, OAS è attivato per produrre 2' -5 '-oligoadenylates collegato (2-5A) che attivano la RNasi L, che poi si fende single-stranded RNA non-sé e sé. Nucleosidi modificati che sono presenti nel cellulare trascrizioni hanno dimostrati di sopprimere l'attivazione di diversi sensori di RNA. Qui, ci dimostrano che trascritti in vitro, RNA non modificato attiva OAS, induce la scissione RNasi L-mediated RNA ribosomiale (rRNA) e rapidamente è fenduta da RNAsi L. Al contrario, RNA contenenti nucleosidi modificati attiva OAS meno efficiente e induce la scissione di rRNA limitata. Modifiche nucleoside rendono anche RNA resistente alla scissione da RNAsi L. esame traduzione nelle cellule L(-/-) RNAsi e topi hanno confermato che attività RNasi L riduce la traduzione di mRNA non modificato, che non è osservato con mRNA modificato. Inoltre, mRNA contenente il pseudouridine modifica nucleoside è tradotto in più e ha un'emivita estesa. L'osservazione che modificato nucleosidi nel RNA ridurre 2-5A pathway attivazione join OAS e RNasi L alla lista di RNA sensori ed effettori cui funzioni sono limitate, RNA viene modificato, confermando il ruolo delle modifiche nucleoside nella soppressione immunitaria riconoscimento del RNA.
Generando Il MRNA Ottimale Per La Terapia: Purificazione HPLC Elimina Attivazione Immunitaria E Migliora La Traduzione Del MRNA Di Nucleosidi Modificati, Codifica Della Proteina
In mRNA trascritti in vitro ha un grande potenziale terapeutico transitoriamente esprimere la proteina codificata senza gli effetti negativi di costrutti virali e basati sul DNA. Le cellule di mammiferi, tuttavia, contengono sensori RNA del sistema immunitario innato che devono essere considerati nella generazione di RNA terapeutico. Incorporazione di nucleosidi modificati entrambi riduce innato immune attivazione e aumenti traduzione di mRNA, ma Induzione residua di tipo interferoni (IFN) e citochine proinfiammatorie rimane. Identifichiamo quel contaminanti, tra cui il RNA double-stranded, in nucleoside-modificato in vitro-trascritto RNA sono responsabili dell'attivazione immunitaria innata e la loro rimozione da high performance liquid chromatography (HPLC) si traduce in mRNA che non inducono IFN e citochine infiammatorie e viene tradotto, a livello 10 - a 1000 volte maggiore nelle cellule primarie. Sebbene mRNAs non modificate sono state tradotte significativamente meglio dopo purificazione, essi ancora indotta da alti livelli di secrezione di citochine. HPLC purificata nucleoside-modificato mRNA è un potente vettore per applicazioni che vanno da ex vivo delle cellule staminali generazione di terapia genica in vivo.
Recettore Toll-like 4 Contribuisce a Prognosi Sfavorevole Dopo Emorragia Intracerebrale
Emorragia intracerebrale (ICH) è un sottotipo di ictus devastante in cui perihematomal l'infiammazione contribuisce alla lesione neuronale e disabilità funzionale. Istologicamente, la regione diventa infiltrata con neutrofili e attivato le microglia seguita dalla perdita di neuroni, ma poco si sa circa i segnali immuni che coordinano questi eventi. Questo studio finalizzato a determinare il ruolo del recettore Toll-like 4 (TLR4) nella risposta immunitaria innata dopo ICH e il suo impatto sul risultato neurocomportamentale.
Aumentata Eritropoiesi Nei Topi Iniettati Con Submicrogram Quantità Di MRNA Contenente Pseudouridine Codifica Eritropoietina
Progressi nell'ottimizzazione di in vitro-trascritti di mRNA portando mRNA mediato terapia più vicino alla realtà. In cellule in coltura, abbiamo recentemente raggiunto alti livelli di traduzione con cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)-purificato, in vitro-trascritto mRNA contenente il pseudouridine nucleosidi modificati. Soprattutto, pseudouridine reso il mRNA non immunogenico. Qui, utilizzando eritropoietina (EPO)-codifica mRNA complessato con transito-mRNA, abbiamo valutato questa nuova generazione di mRNA in vivo. Una singola iniezione di 100 ng (0,005 mg/kg) mRNA elevati livelli sierici di EPO nei topi significativamente da 6 ore e livelli sono stati mantenuti per 4 giorni. In confronto, mRNA contenente uridina prodotto 10-100 volte più bassi livelli di EPO dura solo 1 giorno. EPO tradotto da pseudouridine-mRNA era funzionale e ha causato un aumento significativo di conta dei reticolociti e di ematocrito. Così piccolo quanto 10 ng mRNA raddoppiato i numeri dei reticolociti. Iniezione settimanale di 100 ng di EPO mRNA era sufficiente per aumentare l'ematocrito da 43 a 57%, che è stato mantenuto con il trattamento continuato. Anche quando una grande quantità di mRNA pseudouridine è stata iniettata, no citochine infiammatorie erano rilevabili nel plasma. Utilizzando macachi, noi potremmo anche rilevare livelli di siero aumentato significativamente EPO dopo iniezione intraperitoneale di rhesus EPO mRNA. Questi risultati dimostrano che purificato per HPLC, contenenti pseudouridine mRNA codificano per proteine terapeutiche hanno un grande potenziale per le applicazioni cliniche.
