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Articles by Katalin Kariko in JoVE
JoVE Neuroscience
マウスにおける自発脳内出血をモデル化する自家血注入
1Department of Neurology, University of Connecticut Health Center, 2Department of Neurology, School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Neurosurgery, Hartford Hospital, 4Department of Neurosurgery, School of Medicine, University of Pennsylvania
このプロトコルで説明されているマウスの脳内出血の自家血注入モデルでは、針のトラックまでの血液逆流、ポンプシステムにおける無抗凝固剤のリスクを最小限に抑えるために二重注入の技術を使用し、システム内のすべてのデッドスペースと拡張可能なチューブを排除。
Other articles by Katalin Kariko on PubMed
細胞mRNAは腫瘍壊死因子-αの分泌を刺激し、ヌクレオチド受容体を介するシグナル伝達により樹状細胞活性化を誘導する
我々は以前にその樹状細胞（DC）は、主要組織適合遺伝子複合体クラスIおよびII抗原提示経路および活性化シグナルの配信の両方の負荷をもたらした抗原でエンコードされたmRNAとパルスを示した。 mRNAのパルス強力な一次免疫応答の誘導につながったT細胞とDCの共培養。 DCは、パターン認識受容体を介して外来抗原を認識することに加えて、また、変更された自己に対応する変換、または細胞内に細胞を感染させなければなりません。これは、炎症や細胞死の製品を認識する細胞表面受容体を介して行われます。本稿では、DCを有効にするには、細胞外発現によって利用される2シグナル伝達経路を特徴づける。さらに、新規リガンド、ポリ（A）は、P2Y型ヌクレオチド受容体を示唆する、媒介する百日咳毒素とスラミンによって抑制することができる受容体を介したシグナル伝達とATPとADPによる脱感作であることが識別されます。ワクチンの設計と免疫応答の誘導に損傷した細胞から放出されるmRNAの潜在的な影響で、このシグナル伝達活性の役割が説明されています。
血小板因子4は、低密度リポ蛋白質受容体に結合し、細胞表面上の低密度リポタンパク質の保持、その結果、エンドサイトーシス機構を混乱させる
アテローム性リポタンパク質の細胞内代謝に及ぼす血小板の影響が詳細に特徴付けされていません。したがって、我々は、LDL受容体（LDL-R）を介して、低密度リポタンパク質（LDL）の取り込みと分解に、血小板第4因子（PF4）、活性化血小板による高濃度にリリースされたカチオン性タンパク質の影響を検討した。培養細胞によるLDL-R依存性結合、内在化し、LDLの分解PF4のほかに、それぞれ50％、80％、80％阻害された。 PF4は、リガンド結合ドメインに特異的に結合した組換え可溶性LDL-R（最大値の半分の結合0.5マイクログラム/ mLのPF4）と部分的に（約50％）、LDLの結合を阻害した。 PF4によって内在化と分解の阻害は、主に細胞関連プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸が豊富で、それらの存在を必要とした。障害ヘパリン結合したPF4亜種は、LDLを抑制する能力を欠いていた。 PF4、LDL-R、可溶性、およびLDLは、細胞表面のプロテオグリカンと三元複合体を形成した。免疫電子顕微鏡法によって評価したPF4は、被覆ピットと関連付けられていない多分クラスタ内のヒト線維芽細胞の表面上のLDL / LDL-R複合体の保持を誘発した。これらの研究は、PF4は、セルに関連したコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとの相互作用を促進することにより、LDL-Rへの結合に対して競合することによって一部のin vitroでLDLの異化を阻害することを実証し、LDL / LDL-R複合体の通常のエンドサイトーシスの人身売買を破壊することによって。細胞表面上のLDLの保持は、アテローム形成の変更を容易にし、アテローム性動脈硬化症の病因における血小板の役割の拡大をサポートすることができます。
低分子干渉RNA媒介性RNA干渉によるHIV-1感染の阻害
RNA干渉（RNAi）は、配列相同性をもつRNAを識別し、特にそれを切断するヌクレアーゼ複合体にdsRNAをと関連付けて処理し、古代の抗ウイルス応答です。我々は、RNAiは、特に永続的な細胞株および初代CD4（+）T細胞のHIV-1感染を阻害する21-bpのdsRNAにより媒介されることを示している。 HIV複製の阻害は、逆転写の製品の上清を、ノーザンブロット解析、およびDNA PCRでp24のGagタンパク質含有量を測定した。阻害は、融合後、逆転写前と統合されたプロウイルスからのウイルスRNAの転写時に、ウイルスのライフサイクルにおいて、2つのポイントで発生しました。アーゼに耐性のあるフッ素誘導体化siRNAを用いてHIVに感染した活性化CD4（+）T細胞の治療は、HIV感染の同様の阻害をもたらした。さらに、誘導体化されたsiRNAは、リポフェクチン錯化することなく、血清の存在下で配信される可能性があります。 HIV-1に対してRNAi活性の同定は、ウイルス感染、哺乳動物細胞におけるRNAiの抗ウイルス活性の概念実証を研究するために新しいアプローチを提示します。
MRNAは、Toll様受容体3の内因性リガンドである
Toll様受容体（TLR）は自然免疫系の基本的なシグナル伝達受容体である。彼らは、病原体または負傷した宿主細胞および組織に関連付けられている分子によって活性化される。 TLR3は二本鎖（ds）RNA、多くのウイルスの複製の仲介を倍にするに対応することが示されている。ここでは、異種RNAから解放または壊死細胞に関連付けられている、またはin vitro転写により生成されたことを示す証拠もTLR3を刺激し、免疫活性化を誘導紹介します。評価するためにRNAを媒介TLR3の活性化、安定的にTLR3を発現し、核因子-κBの依存性ルシフェラーゼレポーターを含むヒト胚性腎臓293細胞が生成されました。 in vitro転写RNAのこれらのセルを公開すると、ルシフェラーゼ活性およびインターロイキン-8分泌のTLR3依存的誘導をもたらした。チロシンリン酸化を用量依存性と関与していたプロセスを通じて、TLR3を介したin vitro転写mRNAの活性化核因子-κBのと治療。さらに、自然、in vitroでの転写または2'-フルオロ置換mRNAは、調節因子-1インターフェロン、TLR3の発現を誘導する腫瘍壊死因子-α、ヒト樹状細胞（DC）におけるインターロイキン-1受容体関連キナーゼ-MのmRNA 。 DCが活性化マーカーを発現させることにより治療をmRNAに対応しており、この成熟は拮抗TLR3特異的抗体によって阻害された。内因性のRNAから解放または壊死細胞も刺激したDCに関連付けられた、RNアーゼと壊死細胞の前処理により廃止することができインターフェロン-αの分泌につながる。これらの結果は、RNAは、おそらく二次構造を介して、TLR3の強力なホスト由来の活性化因子であることを示している。損傷組織からの脱出またはエンドサイトーシス、細胞内に含まれるRNAが誘導する、あるいは免疫応答を調節するTLR3の内因性リガンドとして機能する可能性があるため、この知見は、潜在的な生理的な関連性を持っています。
エッジをカットする：自然免疫系は細菌対真核生物の構造的特徴を含むRNAを区別つまり、樹状細胞によって高レベルのIL-12分泌のための首相
ヒト単球由来樹状細胞前駆体にトランスフェクトし、細菌が真核生物のいないソースから派生したRNAは、樹状細胞の成熟刺激と一緒に高レベルのIL-12分泌を誘導する。同様にIL-12分泌を誘導する長い3'-ポリ（A）テールの欠如では細菌のmRNAの構造を模倣したが、このプロパティは、3'-ポリアデニル化効率的な酵素によって失われたin vitroで転写されたmRNAである。他のテストされたRNAのうち、唯一ポリウリジル酸は、IL-12 P70を誘発した。このRNAの応答現象は、dsRNAの古典的な定義された応答から、生物学的に別個に表示されます。 RNAトランスフェAPCはまた、適切に構造化されたRNAの検出と向かって免疫応答の偏りとの間のリンクを示唆し、（低）IL-5（高）IFN-γに向かって、IL-12依存的にTh1細胞表現型をT細胞の分極それらの最高の細胞内微生物を制御するために適しています。細菌のパターンをエミュレートするように構成されたRNAは偏Th1型免疫応答を生むための新たなワクチン戦略を構成しています。
低分子干渉RNAは、配列の独立した遺伝子抑制を仲介するとToll様受容体3を介したシグナルによる免疫活性化を誘導
干渉小さい（Si）とショートヘアピン（sh）のRNAは、それらの哺乳動物細胞での遺伝子サイレンシングを実現するための強力なツールとなり、相同mRNAの強力な分解を誘導する。最近のレポートは、そのsiRNAはまた、I型IFNシステムを介してシグナル伝達を誘導示唆しているものの、それは、標的遺伝子の特異性の高いと考えられているので、siRNAによるサイレンシングは、広く使われています。ヒト胚性腎臓293（HEK293）またはケラチノサイト（HaCaT細胞）の細胞株やヒト初代樹状細胞やマクロファージは、siRNAまたはshRNAをトランスフェクトした場合には、非標的mRNA発現の抑制が検出されました。それらの配列の独立したさらに、siRNAやshRNAは、IFN-αおよびTNF-α産生を含む免疫活性化を開始し、トランスフェクトされたマクロファージや樹状細胞に、HLA-DRの発現を増加させた。低誘導されたsiRNAが、かなり、HEK293とHaCaT細胞のIFN-βのレベル。 HEK293細胞過剰発現したToll様受容体3（TLR3）、およびIFN-βの増加分泌がTIRドメイン含有アダプター誘導IFN-β、TLR3アダプタータンパク質の阻害剤の共発現によって抑制されたときに、これらのサイトカインの分泌が大幅に増加3シグナリング調節因子をIFNにリンクされます。遺伝子のsiRNAとshRNAのノックダウンは、新しい強力なツールを表しますが、それは我々がTLR3を介したシグナル伝達によって部分的に媒介されている実証する非特異的な影響、ないわけではありません。
ヒトケラチノサイトの感染中に単純ヘルペスウイルス1型遺伝子の発現と機能の短鎖干渉RNA媒介性阻害
RNA干渉（RNAi）は、二本鎖RNAが断片に切断されたときに活性化される抗ウイルス機構であり、短鎖干渉RNAは（siRNA）を主要な誘導性遺伝子は、酵素複合体をサイレンシングすること、と呼ばれる。我々は、細胞間拡散と免疫回避を仲介する単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）遺伝子、糖蛋白質E、に対してRNAiを適用した。感染のin vitroモデルでは、ヒトケラチノサイトは、糖蛋白質Eの特異的なsiRNAをトランスフェクトし、次いで、野生型HSV-1に感染した。 RNAiによる遺伝子サイレンシングは、GE-欠失変異体ウイルスのプラーク小さな表現型を再現しました。遺伝子ターゲッティングの特異性は、フローサイトメトリーおよびノーザンブロット分析によって示された。外因性siRNAは、RNAiを介してin vitroでのアクティブな感染時にHSV-1糖蛋白質Eの発現と機能を抑制することができます。この作品は、HSVの研究のための遺伝的ツールとしてRNAiを確立し、新たな抗ウイルス療法としてのRNAiの開発のための基盤を提供します。
Toll様受容体3を介したシグナルによる外因性のsiRNA仲介シーケンスに依存しない遺伝子の抑制
RNA干渉（RNAi）は、特に、その機械真菌から哺乳動物までの生物で発見されたシーケンスに依存した方法で遺伝子発現を抑制する強力な方法です。哺乳動物細胞では、I型インターフェロン合成のToll様受容体3（TLR3）と誘導を介して二本鎖RNA（dsRNA）の認識が含まれています頻繁にウイルスの複製によって誘導される遺伝子抑制のシーケンスに依存しないシステムを開発しました。インターフェロンはタンパク質の合成やシーケンスに依存しない方法で切断するRNAにRNase-Lのを活性化する製品を生成する2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素を抑制するdsRNAの活性化プロテインキナーゼを含む遺伝子のセットの転写を活性化する。我々は21-bpのdsRNAが、RNAiの鍵となるメディエーターでは、配列特異的な遺伝子抑制を誘導するだけでなく、I型インターフェロンを活性化mRNA分解のタンパク質合成と機能拡張のシーケンスに依存しない抑制を誘導するためにTLR3を通知するだけでなく、ことを観察した。このシーケンスに依存しない抑制は外因的に投与レポーター遺伝子だけでなく、ケラチノサイトの急性単純ヘルペスウイルスI型感染の過程でウイルス遺伝子を標的との間の両方で示された。 TLR3は、多くの主要な細胞型および細胞株によって発現されるように、このシーケンスに依存しない抑制は、低分子干渉RNAによる遺伝子抑制を用いた実験の設計に考慮する必要があります。
ラット脳における局所的虚血耐性の誘導：皮質Lesioningと拡散うつ病と解離
KClの皮質のアプリケーションは、以前に脳虚血のその後のエピソードへの寛容を誘導することが示されている。 KClは皮質拡散うつ病の再発をトリガし、皮質のアプリケーション·サイトでの小さな病変を生成します。一人で皮質病変は虚血耐性を誘導するのに十分であるかどうかを判断するために、著者らは3日中大脳動脈永久閉塞する前に、前提条件のラットの脳に5 mol / Lの塩化ナトリウムを使用していました。 NaClは皮質拡散うつ病を喚起することなく、アプリケーション·サイトでの小さな病変を生じた。 CBFの減少は、中大脳動脈閉塞後に有意に減衰し、5モル/ L NaClで前処理し、35％の皮質梗塞の体積を減少させた。結果は、それ自体が小さな皮質病変は、虚血耐性を誘導するのに十分であることを示している。
Toll様受容体とサイトカインシグナル伝達の阻害 - 虚血耐性の統一テーマ
脳虚血は、主脳損傷を悪化させる急性炎症をトリガーします。自然免疫系の活性化は、この炎症反応の重要なコンポーネントです。炎症は、TNF、血液の流れを変えるため、脳内の免疫細胞の二次的虚血と蓄積につながる、血管透過性を増加させるIL-1βとIL-6などの炎症性サイトカインの作用を介して行われます。これらのサイトカインの産生は、負傷した組織や細胞から放出される宿主由来の分子を認識するToll様受容体（TLR）を介したシグナルによって開始されます。最近では、長足の進歩は、自然免疫系、特にTLRのシグナル伝達機構の調節を理解する上で行われています。 TLRは、炎症性サイトカインの負のフィードバック阻害剤は現在同定され、特徴づけられている。これは、脂質ラフトは細胞膜に存在し、受容体を介した炎症性シグナル伝達事象の役割を果たすことも明らかである。本総説では、この新たに利用可能な大きな体の知識を用いて、虚血耐性の研究では新鮮な見てみましょう。この分析に基づいて、我々は虚血耐性とエンドトキシン耐性、リポポリサッカライド（LPS）への反応性低下によって特徴付け免疫抑制状態の間に著しい類似性を認識しています。このアナロジーの観点から、エンドトキシン耐性の分子機構に関連した最近の発見を考えると、我々は、TLRの阻害を仮定し、炎症性サイトカインのシグナル伝達は、脳や他の臓器の虚血耐性に決定的に貢献しています。虚血耐性は、プレコンディショニング様々な刺激により誘導される防御機構です。許容範囲は、2種類の時間プロファイルを確立することができます。トリガーは数分以内に虚血耐性を誘導すると、（ii）保護の発展の遅れたフォームは、数時間または数日間とが必要デnovoタンパク質合成を取る（i）の急速なフォームした。耐性の急速な形式は、TLR /サイトカインシグナル伝達経路の阻害につながる脂質ラフトの破壊を引き起こし、膜流動性に直接干渉することにより達成される。許容範囲の遅延形式では、プレコンディショニング刺激は最初の炎症にも炎症のフィードバック阻害剤の同時上方のみならず大手、TLR /サイトカイン炎症経路をトリガします。シグナル伝達阻害剤、デコイ受容体、および抗炎症性サイトカインを含むこれらの阻害剤は、虚血のその後のエピソードに炎症反応を減らすことができます。虚血耐性の分子機構のこの小説の解釈は、脳卒中と関連疾患の予防と治療に将来の調査のための新しい道を強調しています。
Toll様受容体によるRNA認識の抑制：ヌクレオシド修飾の影響およびRNAの進化的起源
DNAとRNAがToll様受容体（TLR）の活性化を介して哺乳類の自然免疫系を刺激する。メチル化CpGモチーフを含むDNAは、しかし、刺激はありません。天然のRNAで選択されたヌクレオシドでもメチル化あるいは変更されたが、これらの変化の免疫調節効果がテストされていないままにされています。我々は、RNA、ヒトTLR3、TLR7、およびTLR8を介して信号が、修飾ヌクレオシドm5C、M6A、m5U、S2U、またはシュードウリジンの取り込みが活動をablatesことを示している。そのような変更されたRNAにさらされる樹状細胞（DC）が変更されていないRNAで処理されたものより大幅に少ないサイトカインや活性化マーカーを発現する。樹状細胞とTLR発現細胞を強力に細菌やミトコンドリアRNAによってではなく、修飾ヌクレオシドで豊富である哺乳類のtotal RNAによって活性化されています。我々は、ヌクレオシドの変更がDCを活性化するRNAの可能性を抑制すると結論付けている。自然免疫系は、したがって、選択的に細菌や壊死組織に対応するための手段としてヌクレオシド修飾を欠くRNAを検出する可能性があります。
炎症の阻害剤をコードするmRNAのアップレギュレーション：高張塩溶液の皮質アプリケーションを使用した脳のプレコンディショニング
これまでの研究では、高張KClまたは大脳皮質へのNaClのローカルアプリケーションが虚血のその後のエピソードへの耐性を誘導することを明らかにした。本研究の目的は、これらの塩のアプリケーションは、炎症の阻害剤をコードするmRNAのレベルを増加させるかどうかを判断することでした。高張KClまたはNaClをSprague-Dawleyラットの前頭皮質に2時間適用した。 24時間までの回復期間後、選択されたmRNAのレベルは、ノーザンブロットを用いて前頭葉と頭頂葉皮質からのサンプルで測定した。高張KClのアプリケーションでは、腫瘍サイトカインのシグナル伝達-3（SOCS3）の抑制壊死因子（TNF）、tristetraprolin（TTP）、および脳由来神経栄養因子（BDNF）をコードするmRNAのレベルの迅速かつ広範な増加を引き起こし、毛様体神経栄養因子（CNTF）mRNAの24時間遅れて誘導。高張NaClのアプリケーションでは、前頭皮質に限定されたmRNAレベルの変化を引き起こした。この領域では、NaClのアプリケーションが急速にTNF、TTP、およびSOCS3をコードするmRNAのレベルを増加ではなく、BDNF、CNTFおよびmRNAの遅延誘導を引き起こした。これらの結果は、前処理後の炎症の阻害剤のアップレギュレーションは、虚血耐性の誘導に寄与するかもしれないという可能性を高める。
人間の性器の上皮に発現Gp340は、HIV-1エンベロープタンパク質を結合し、ウイルス伝播を容易に
女性のHIVの性行為時に感染する可能性が最初の細胞は、粘膜下CD4（+）T細胞と下部生殖管の樹状細胞である。 HIVはさらに健康とそのままバイパスすることができ上皮細胞層で、これらの標的細胞から分離されています。 HIVはこの障壁を貫通する方法を理解するために、我々は生殖器上皮に発現し、特異的なタンパク質 - タンパク質相互作用を介してHIVエンベロープを結合する宿主タンパク質、gp340を同定した。このバインディングは、HIVのそうでなければsubinfectious量が効率的に標的細胞に感染することができ、この感染症は結合後の時間の長い期間にわたって発生することができます。我々の調査結果は、HIVが、感染の最初のイベントを推進してそのまま性器上皮にバインドされている異性愛者送信時にウイルスの侵入のメカニズムを示唆している。感染の開始にこのステップを理解することがHIV感染を阻止するためのツールと方法の開発が可能になる。
天然のヌクレオシド修飾は、RNAの免疫活性を抑制：治療RNAの開発のための含意を
DNAとRNAがToll様受容体（TLR）を含む様々なセンサをトリガすることによって、哺乳類の自然免疫系を刺激する。 DNAに暴露TLR9シグナル、TLR3、TLR7およびTLR8は、RNAに応答した。天然供給源からのほとんどのDNAとRNAが修飾ヌクレオシドが含まれています。 DNAブロックTLR9シグナル伝達におけるCpGモチーフのメチル化。類似した効果は、RNAの修正をヌクレオシドに起因することができるかどうかの問題は最近解決されています。このレビューはRNAと免疫細胞とTLRのをアクティブにするには、RNAの能力への影響の少ない天然のヌクレオシド修飾を特徴付ける。 RNAの修飾ヌクレオシドを含むため、免疫活性化特性を欠いているが、臨床応用の潜在的な重要性を持っています。
TLR3経由siRNAによる配列とターゲットに依存しない血管新生抑制
血管内皮細胞増殖を標的と低分子干渉RNA（siRNA）の臨床試験因子（VEGFA）や加齢黄斑変性症の脈絡膜新生血管（CNV）を盲検化患者におけるその受容体VEGFR1（またFLT1と呼ばれる）、遺伝子サイレンシングを前提とされている細胞内のRNA干渉（RNAi）による。我々は、CNVの抑制はsiRNAのクラス効果であることを代わりに表示する：21塩基以上のsiRNAは、非哺乳動物の遺伝子、非発現遺伝子、非ゲノム配列、プロと抗血管新生遺伝子、およびRNAi-無能なsiRNAがすべて抑制を標的とオフターゲットRNAiまたはinterferon-alpha/betaをアクティブにしなくても比較的VegfaまたはVEGFR1をターゲットにしたsiRNAのマウスのCNV。非標的（非哺乳動物の遺伝子に対して）とターゲット（VegfaまたはVEGFR1に対する）siRNAが、インターフェロン-γおよびインターロイキン12の受容体3（TLR3）、そのアダプターTRIF、誘導Toll様細胞表面を介してCNVを抑制した。非標的siRNAは、として効果的にVegfa siRNAのようにマウスの皮膚血管新生を抑制した。血管新生のsiRNAによる阻害は、21ヌクレオチドの長さの最小値、モデル化2：01 TLR3-RNA複合体のブリッジングの必要性をが必要です。 TLR3のコーディングバリアント412FFを発現している人々からの脈絡膜内皮細胞は、個別の薬理療法を促進する、細胞外siRNAによる細胞毒性に抵抗性であった。複数のヒト内皮細胞の種類は、一般的なsiRNAが世界人口の8％に影響を与える血管新生疾患を治療する可能性があることを示す、表面のTLR3を発現し、そのsiRNAは、予期しない血管や免疫効果を誘発するかもしれません。
MRNAへのシュードウリジンの取り込みが増加しトランスレーショナルキャパシティおよび生物学的安定性に優れた非免疫原性ベクトルを生成する
in vitroで転写されたmRNAのエンコーディングで生理学的に重要なタンパク質は、治療用途のためにかなりの可能性を秘めている。しかし、その現在の形では、mRNAは、その不安定と免疫原性の性質の臨床使用のために不可能です。ここでは、転写に自然に修飾ヌクレオチドの取り込みは、mRNAに強化された生物学的特性を付与するかどうかを検討した。我々は、哺乳類細胞溶解物でテストまたは0.015から0.15 mg / kgの用量でマウスに静脈内投与した場合pseudouridinesを含むmRNAが変更されていないmRNAのより高い翻訳能力を持っていることがわかった。配信mRNAとエンコードされたタンパク質は、シュードウリジンを含むmRNAを投与した場合、両方の製品が有意に高いレベルにあった注射後1,4、および24時間後に脾臓で検出される可能性があります。さらに高用量でのみ、変更されていないmRNAはインターフェロン-α（IFN-α）の高血清レベルを誘導する、免疫原性であった。これらの知見は、ヌクレオシド修飾がin vivoでの免疫原性を減少しながら安定性とmRNAの翻訳能力を高めるための効果的なアプローチであることを示している。プソイドウリジンにより付与される改良された特性は、このようなmRNAの遺伝子の交換や予防接種の両方のための有望なツールとなっています。
MRNAへのシュードウリジンの取り込みは、PKRの活性化を減少させることによって翻訳を強化
これまでの研究では、ウリジンがpseudouridinesに置き換えられたときにin vitro転写メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳のレベルが強化されることが示されているが、この機能強化の理由は、同定されていない。ここでは、ウリジンを含むin vitro転写産物次に翻訳開始因子2-α（のeIF-2α）をリン酸化し、翻訳を阻害するRNA依存性プロテインキナーゼ（PKR）が活性化することを示している。対照的に、シュードウリジンを含むin vitro転写のmRNAに低い程度にPKRを活性化し、シュードウリジンを含むmRNAの翻訳が抑制されていません。 RNAのプルダウンアッセイは、そのmRNAを含むウリジンをシュードウリジンを有するmRNAよりも効率的にPKRによってバインドされているを示しています。最後に、PKRの役割は、そのプソイドウリジンとウリジン含有RNAはPKRのノックアウト細胞でも同様に翻訳された示すことによって検証されます。これらの結果は、それらを含むウリジンと比較して、シュードウリジンを含むmRNAの強化された翻訳は、PKRの減少活性化により媒介されることを示しています。
DICER1赤字は、加齢黄斑変性症のALU RNAの毒性を誘発する
地理的萎縮（GA）、加齢黄斑変性症の治療不可能な高度なフォーム、網膜色素上皮（RPE）細胞の変性の結果。ここでは、マイクロRNA（miRNA）処理酵素DICER1はGAを用いた人間のRPEに減少していることを示し、その条件Dicer1のアブレーションではなく、他の7 miRNAのプロセッシング酵素は、マウスのRPEの変性を誘導する。 DICER1ノックダウンはヒトRPE細胞およびマウスRPEのB1とB2 RNAはアルミのようなアルミRNAの蓄積を誘導する。アルミRNAは、GAを用いた人間のRPEに増加され、この病原性RNAは、ヒトRPE細胞毒性とマウスのRPEの変性を誘導する。 Alu/B1/B2 RNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、グローバルなmiRNAのダウンレギュレーションにもかかわらず、DICER1枯渇誘発性RPEの変性を防ぐことができます。 DICER1は、Alu RNAを分解し、この消化アルミRNAは、マウスのRPEの変性を誘発することはできません。これらの知見は、レトロトランスポゾンの転写産物の分解を伴うDICER1のmiRNAに依存しない細胞の生存機能を明らかにし、アルミRNAは直接人間の病理を引き起こす可能性があることを示し、失明の主要原因のための新しいターゲットを識別します。
好中球減少は単球浸潤を減らし、実験的脳内出血後の機能転帰を改善
炎症が脳内出血後の二次損傷と神経細胞の損失に寄与するが、これらのプロセス内の個々の免疫集団の役割は不明である。マウスモデルでは、線条体に自己血の注入は、好中球、単球、および樹状細胞で構成される強烈な炎症細胞浸潤すると関連していた。好中球の選択的な枯渇は3日後に出血における単球および改良された機能的転帰の減少浸潤をもたらした。これらの知見は、出血の部位への好中球浸潤は、直接細胞の損傷や単球の動員による脳損傷に寄与することを示しています。
RNアーゼLによる切断に2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素の増加抵抗のRNA制限アクティベーションのヌクレオシドの変更
インターフェロン誘導酵素2'-5'-オリゴアデニル酸合成酵素（OAS）とRNase Lは、ウイルス感染後に感覚やエフェクター機能に関与する自然免疫の重要なコンポーネントです。バインディングターゲットRNA時には、OASは、その後一本鎖の自己と非自己RNAを切断するリボヌクレアーゼLを活性化2'-5'-結合oligoadenylates（2-5A）を生成するためにアクティブ化されます。細胞の転写産物に存在する修飾ヌクレオシドは、いくつかのRNAセンサーの活性化を抑制することが示されている。ここでは、in vitroで転写され、変更されていないRNAは、OASを活性化することを実証し、RNase-Lの媒介によるリボソームRNA（rRNA）の切断を誘導し、迅速にこれとは対照的にRNaseのL.によって切断される、修飾ヌクレオシドを含むRNAが少なく効率的にOASを活性化し、限られたrRNAの切断を誘導する。 （ - / - ）細胞とRNase L活性は変更されたmRNAと観察されない変更されていないmRNAの翻訳を減少させることを確認したマウスのヌクレオシド修飾はまたRNaseのL.がRNase Lの翻訳を調べることにより、切断に耐性RNAを作る。さらに、長く翻訳され、拡張された半減期を持っているヌクレオシド修飾シュードウリジンを含むmRNA。 RNAの修飾ヌクレオシドは2-5Aの経路の活性化を減少させるという観察は、機能RNAは、RNAを抑制する免疫認識におけるヌクレオシド修飾の役割を確認し、変更されたときに限られているRNAのセンサーとエフェクターのリストにOASとRNase Lを結合します。
治療のための最適なmRNAを生成する：HPLC精製は、免疫活性化を排除し、ヌクレオシド修飾、タンパク質をコードするmRNAの翻訳を改善する
in vitroで転写されたmRNAは、一時的にウイルスおよびDNAベースのコンストラクトの副作用なしにエンコードされた蛋白質を発現するのに最適な治療の可能性を秘めています。哺乳動物細胞は、しかし、治療RNAの生成に考慮しなければならない自然免疫系のセンサーのRNAが含まれています。修飾ヌクレオシドの取り込みは、自然免疫の活性化を低減し、mRNAの翻訳を増加しますが、型の残留誘導両方のIインターフェロン（IFN）や炎症性サイトカインが残っています。我々は、IFNは、炎症性サイトカインを誘導しない自然免疫の活性化とmRNAの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の結果により、それらの除去に責任があるとある二本鎖RNAを含む汚染物質が、in vitroで転写されたRNAのヌクレオシド修飾されたことを識別10時の翻訳 - 初代細胞の1000倍のレベルに。変更されていないmRNAが有意に良好で、次の精製に翻訳されたが、彼らはまだサイトカイン分泌の高いレベルを誘発した。 HPLC精製ヌクレオシドは、修飾されたmRNAは、ex vivoで幹細胞の生成からin vivoでの遺伝子治療にまでアプリケーションのための強力なベクトルである。
Toll様受容体4は、脳内出血後予後不良に貢献
脳内出血（ICH）はperihematomal炎症が神経細胞の損傷や機能障害に寄与するで壊滅的な脳卒中サブタイプです。組織学的に、好中球および活性化ミクログリアで浸潤領域となるには、神経細胞の損失に続いて、少しは、これらのイベントを調整し、免疫シグナルについて知られている。本研究では、Toll様ICH後の先天性免疫応答の受容体4（TLR4）と神経行動学的転帰に及ぼす影響の役割を決定することを目的とした。
プソイドウリジン含有のコードするmRNAのエリスロポエチンの1マイクログラム未満の数量を注射したマウスで増加した造血
in vitroで転写されたmRNAでの最適化の進歩は、現実に近いmRNAが介在療法をもたらしている。培養細胞では、我々は最近変更されたヌクレオシドプソイドウリジンを含むin vitroで転写されたmRNAには、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で精製して、翻訳の高いレベルを達成しました。重要なのは、シュードウリジンは非免疫原性mRNAをレンダリングされます。ここでは、トランジットのmRNAと複合体エリスロポエチン（EPO）をコードするmRNAを用いて、in vivoでのmRNAのこの新世代の評価を行った。 mRNAは6時間とレベルによって大幅にマウスの血清EPOレベルを上昇さは100 ng（0.005 mg / kg）の単回投与を4日間維持した。比較では、mRNAを含むウリジンは1日持続するEPOの10から100倍低いレベルを作り出した。プソイドウリジン-mRNAから翻訳されたEPOは、機能的であり、網状赤血球数およびヘマトクリット値の両方の有意な増加を引き起こした。わずか10 ngのmRNAは、網状赤血球数を倍増した。 EPO mRNAの100 ngの週1回の注射は43から継続的な治療で維持されていた57％にヘマトクリットを増加させるのに十分であった。プソイドウリジン-mRNAの大量注入した場合であっても、全く炎症性サイトカインが血漿中に検出されなかった。ニホンザルを用いて、我々はまた、アカゲザルEPO mRNAの腹腔内注射後に著しく増加した血清EPOレベルを検出することができます。これらの結果は、治療用タンパク質をコードHPLCで精製し、シュードウリジンを含むmRNAは臨床応用の大きな可能性を秘めていることを示している。
