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Articles by Kathi Zarnack in JoVE
JoVE General
iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council - MRC, 2European Bioinformatics Institute, EMBL Heidelberg, 3Computer and Information Science, University of Ljubljana, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute
転写でRNA結合蛋白質の空間配置は、転写後調節の重要な決定要因である。したがって、我々は、RNA結合タンパク質の結合部位の正確なゲノムワイドなマッピングを可能にする個々のヌクレオチドの解像度のUV架橋及び免疫沈降（iCLIP）を開発。
Other articles by Kathi Zarnack on PubMed
トウモロコシ黒穂病菌病原体におけるテトラサイクリン調節遺伝子発現。
遺伝子機能を探索する強力なアプローチは、テトラサイクリン調節式の使用です。ここでは、このトウモロコシ黒穂病菌の滴定的発現システムの確立を報告します。ネイティブ tetR 遺伝子の時期尚早の起こる, テトラサイクリン応答性プロモーターの高い基底活性とウイルス活性化ドメインの毒性の合成 tetR ※ 遺伝子コンテキスト依存型コドンの使用状況に応じて設計、プロモーターから不可解な増強物の要素を削除および、酸性最小限活性化ドメインをそれぞれ使用して克服しました。我々 は、テトラサイクリン依存型用量-反応最適化されたコンポーネントを使用して検証し、フェロモン応答因子、交尾を規制するキーの転写因子の発現を調節する簡単な 1 ステップ プロモーター交換カセットを適用しました。フェロモン応答液体培養と固体媒体で交尾テトラサイクリンとドキシサイクリンの存在下で廃止されました。したがって、この汎用性の高い新しいツール植物病原体のための機能、生物のコンテキストで証明されました。
菌類の人身売買 MRNA。
真菌の成長はアクチンと微小管細胞骨格に沿って高分子の能動輸送によって異なります。これにより、分子貨物 Mrna やタンパク質、脂質、細胞レベル下の領域を定義する対象としています。タンパク質合成タンパク質の機能が必要です発生します能動輸送とローカリゼーション Mrna のローカライズされた翻訳を仲介します。出芽酵母におけるアクトミオシン依存 mRNA 人身売買参加極地の成長、細胞非対称分裂、膜蛋白質とミトコンドリア蛋白質の輸入のターゲットします。Best-understood の例は、初期の娘細胞の遠位ポール ASH1 mRNA の輸送です。cis 作用する RNA シーケンスは RNA 結合タンパク質分子モータ Myo4p の She3p アダプターを介して接続されている She2p によって認められています。極でローカルの翻訳娘細胞が主にこの転写因子交配型スイッチングを阻害する娘細胞の核内蓄積する Ash1p が発生します。最近、またアクトミオシン依存型 ASH1 mRNA の輸送は、人間の病原体のカンジダ ・ アルビカンスのフィラメントの先端細胞特異的遺伝子発現を指示することが示されました。さらに、植物病原菌トウモロコシ黒穂病菌の微小管依存 RNA 結合タンパク質 Rrm4 の往復感染フィラメントの極性軸決定に不可欠です。したがって、mRNA 人身売買菌類の極地の成長を普遍的に必要とするが表示されます。
トウモロコシ黒穂病菌の転写後機械。
真核生物の遺伝子発現は転写と Mrna の核の成熟を開始し、細胞質劣化とその翻訳が終了します。ここでは、最近配列されたゲノムとその包括的なマニュアルのアノテーションに基づく Ustilago アルテリシジンの転写後の機械類の在庫を提示します。出芽酵母と高等生物のために利用可能な詳細な知識を使用この植物病原体の転写後コンポーネントを予測します。出芽酵母に比較は、ほとんどのコア コンポーネントが共有されていることを明らかに。両方の菌類 RNAi 機械の成分を欠く生物の小さなグループに属しています。しかし、顕著な違いはスプライシングのレベルで存在します。U. アルテリシジン実質的に多くのイントロンを含む遺伝子港湾しこれ多数のスプライス コンポーネントが欠席している人間の第オーソロガスとの存在と関連付けてまたは少ない出芽酵母で保存します。特に、米国アルテリシジンには 3 うち 4 コア蛋白質スプライシングのエクソンをマークし、細胞内の mRNA の輸送に関与しているエキソン接合複雑なが含まれます。このコンテキストでは、また微小管 - ではなくアクチンに依存 mRNA の輸送、米国アルテリシジン ゲノム関連するコンポーネントが表示されます顕著です。したがって、米国アルテリシジン転写後のプロセスに新しい洞察力を得るために、魅力的なモデル システムとして役立つかもしれない。
フェロモン調整されたターゲット遺伝子特異的転写因子 Prf1 の MAPK のリン酸化に対応します。
交尾中にシグナル伝達フェロモン トウモロコシ黒穂病菌の病原性のために不可欠です。キーの転写因子 Prf1 の活動は、転写レベルでと post-translationally マイトジェン活性化プロテインキナーゼ （MAPK） と蛋白質キナーゼ A(PKA) のリン酸化によって制御されます。ただし、これらの規制メカニズムを転写出力の正確な寄与は知られています。ここでは、私たちは遺伝子組み換え Prf1 規制の 3 つのレベルを解剖しました。我々 は識別され、ターゲットを分類すると、それぞれ変異体の転写プロファイリングを行った。このアプローチは prf1 の転写調節翻訳後制御の重要性を強調してターゲット遺伝子発現に及ぼす唯一のマイナーな影響があった。PKA 規制 Prf1 の病原性を調節する主要な転写因子を含む 9 つのフェロモン応答性遺伝子の発現を制御するのに十分だった。MAPK 規制は 57 の遺伝子のセットのフェロモン応答のために必要だった。35 の場合、残りの 22 例で規制緩和された一方フェロモン応答性は完全に失われました。これは標的遺伝子特異的それぞれ転写因子の MAPK のリン酸化に応答することを示唆シグナリング MAPK の複雑さの小説レベル表示。
真菌の RNA 結合タンパク質 Rrm4 Ubi1 と Rho3 の MRNAs の長距離輸送を仲介します。
細胞骨格トランスポート糸状菌の極地の成長を促進します。Ustilago アルテリシジン RNA 結合蛋白質 Rrm4 は微小管に沿って往復し、極性伝染性フィラメントで非常に重要です。突然変異 RNA 結合ドメインの機能の損失を引き起こします。しかし、それどちら Rna がバインドされ、輸送明確ではなかった。ここでは、in vivo RNA 結合試験と Rrm4 の分子機能を決定するライブ イメージングを適用します。この新しい組み合わせ Rrm4 異なる Mrna のエンコード、たとえば、ユビキチン融合タンパク質 Ubi1 と G タンパク質 Rho3 の微小管依存輸送を仲介することを明らかにしました。これらの成績は双方向での微小管に沿って移動し、Rrm4。 重要なのは、co-localise リボ核蛋白質粒子 (mRNPs) CA リッチ含む 3' 非翻訳領域 ubi1 の蓄積サイト関数として zipcode mRNA の輸送中にバインドします。Rrm4 の RNA 結合ドメインを削除すると、タンパク質を往復しているがさらに、運動 mRNPs 形成されていません。したがって、Rrm4 は輸送機械の不可欠なコンポーネントを構成します。微小管依存 mRNP 人身売買が U. アルテリシジンの高い真核生物の mRNA の輸送を勉強のための魅力的なモデルとして導入する菌糸の成長にとって重要であることを提案します。
タンデム KH ドメイン Khd4 の AUACCC 認識し、形態としてトウモロコシ黒穂病菌の病原性の調節のために不可欠です。
RNA 結合タンパク質転写後の機械の主要な要因を構成します。これらの規制の蛋白質ターゲット、たとえばを促進する成績証明書、成熟、翻訳、または Mrna の安定性内の特定の要素を認識します。Ustilago アルテリシジンの転写後プロセスが病原性を決定することが重要であること証拠を蓄積です。予測の RNA 結合タンパク質 5 K ホモロジー (KH) ドメインとエンコード、khd4 の削除は異常な細胞形態の原因し、病原性を削減します。ここでは、私たち Khd4 AUACCC そのタンデム KH ドメイン 3 と 4 を介して in vivo でのシーケンスを認識することを示しています。3' 非翻訳領域に蓄積するのでこのシーケンスは、最も可能性の高い米国アルテリシジンの規制 RNA 要素として機能します。一貫して、結合モチーフは、成績証明書の表示中に大幅に富むアプローチをプロファイリング式を明らかに独立の mRNA 発現レベル khd4Delta 系統の変更。欠失変異株の増加量の潜在的な Khd4 ターゲット Mrna の大半を示すが、Khd4 mRNA 不安定性を促進する可能性があります。AUACCC のバインドに失敗変異体どの変更展示細胞形態糸状の成長を邪魔し、厳しく減少病原性欠失変異、似ています。それ故に、RNA 結合形態および病原性調節における転写後のコントロールの重要性を強調するは、機能 Khd4 のために不可欠です。
真菌における微小管依存 MRNA の輸送。
局在と Mrna のローカル翻訳正しい細胞内タンパク質の対象を促進する重要なメカニズムを構成します。mRNA の局在は mRNPs の mRNAs から成る大規模なアセンブリの能動輸送によって媒介され、RNA 結合蛋白質などの要因関連付けられました。分子モーターはそれぞれ mRNPs は短距離または長距離人身売買、アクチン、微小管細胞骨格に沿って移動します。糸状菌の微小管による長距離輸送膜と細胞壁の拡大に関与している、ベシクルの効率的な菌糸の成長をサポートします。最近、Mrna の微小管を介した物質輸送が高速極性の成長のトウモロコシ病原トウモロコシ黒穂病菌感染フィラメントのため不可欠であることを発見しました。紫外線 in vivo 架橋と RNA ライブ イメージングを組み合わせた RNA 結合タンパク質 mRNP の輸送機械の不可欠な部分を構成する Rrm4 極性要因、蛋白質合成の要因、およびミトコンドリア蛋白質のエンコーディング別個の Mrna の輸送を仲介することを明らかにしました。また、我々 の結果は、微小管依存 mRNA の輸送が進化的に高等生物菌類からが節約されることを示します。これは、長距離 mRNA 輸送の基本的な概念を明らかにモデル システムとして U. アルテリシジンのエキサイティングな可能性を発生させます。
ICLIPは、個々のヌクレオチド解像度でスプライシングのhnRNP粒子の機能を明らかに
真核細胞の核内に、新生転写物は、それらの豊富にもかかわらずのhnRNP Cで核されている粒子が、しかし、それはこれらの粒子はpre-mRNAの処理を制御するかどうかは不明のまま異種核リボヌクレオタンパク質（のhnRNP）に関連付けられています。ここでは、スプライシングの調節にのhnRNP Cの役割を研究するために個々のヌクレオチド分解能UV架橋および免疫沈降（iCLIP）を開発しました。 iCLIPデータは、のhnRNP CはのhnRNP粒子の組織との一貫性のある定義されている長期の間隔でウリジン管を認識していることを示しています。のhnRNP粒子はイントロンとエクソンの両方で組み立てるが、一般的にスプライス部位から除外されたままになります。 "RNAマップ"にトランスクリプトーム全体のiCLIPデータと選択的スプライシングプロファイルの統合はのhnRNP粒子の位置が別のエキソンを含めることでその効果を決定する方法を示しています。この調節機構への洞察を提供するために、高解像度のiCLIPデータの能力は、他の高次のリボ核タンパク質複合体の研究のための可能性を秘めています。
ICLIPは、TIA-RNA相互作用のデュアルスプライシングに及ぼす影響を予測する
選択的スプライシングの調節は、スプライス部位に近いRNA結合タンパク質とmRNA前駆体の位置との間の相互作用が含まれます。 T細胞の細胞内抗原1（TIA1）と1（TIAL1）TIA1のような、ローカルで5 'スプライス部位にU1 snRNPを募集してエクソンの包含を強化します。しかし、遠位のエクソンのスプライシングにTIAタンパク質の効果はまだ検討されていない。我々は、ヒトのRNAの同じ位置に、そのTIA1とTIAL1バインドを見つけるために、UV架橋および免疫沈降（iCLIP）を使用しました。 5 'スプライス部位の結合の下流は、近位のエクソンの包含を高め、遠位のエクソンの包含をサイレンシングにTIAタンパク質の影響を予測するために使用されていました。予測は、TIAタンパク質はスプライシングの忠実性を維持し、排他的に下流に5 'スプライス部位の結合によって選択的スプライシングを調節することが明らかになったスプライス接合マイクロアレイ、RT-PCR、およびミニ遺伝子コンストラクトを使用して、公平な方法で検証されています。驚くべきことに、5時TIA結合スプライス部位 'スプライス部位は、規制代替手段3に近接して結合することなく、遠位カセットと可変長のエクソンを黙らせた "。 TIA-RNA相互作用のトランスクリプトーム全体の高解像度のマッピングを使用して我々は、TIAのタンパク質の遠位のスプライシング効果を評価した。これらのデータは、TIAのタンパク質は、前述の5 'スプライス部位の認識を高めることにより、別のエクソンの定義については、使用可能時間を短縮するモデルと一致している。したがって、我々の調査結果は、スプライシング反応速度の変化は選択的スプライシングの遠位調節を仲介することができることを示しています。
RNA結合タンパク質Rrm4はEndochitinase CTS1の効率的な分泌に必須である
mRNAの長距離輸送は、真核生物の時空間的遺伝子発現を決定する上で重要である。 RNA結合タンパク質Rrm4は、黒穂菌属のmaydisのフィラメント、微小管依存性のmRNAの輸送の主要なコンポーネントを構成します。潜在的な標的mRNAの数を識別することができましたが、Rrm4媒介輸送に依存する細胞プロセスの大部分は不明のままである。ここでは、細菌の型endochitinase CTS1、差rrm4Δフィラメントで規制されているなど、その、リボソーム、ミトコンドリア、細胞壁リモデリングタンパク質を、表示するために差動プロテオミクスを使用していました。 in situハイブリダイゼーションのin vivo UV架橋および免疫沈降法および蛍光でCTS1 mRNAがRrm4の直接のターゲットを表すことを明らかにした。 cts1Δ変異体のフィラメントは、変更された細胞表面を示唆して液体培養で集計。それはrrm4Δフィラメントの両方の極に蓄積するのに対し、野生型細胞ではCTS1は、成長円錐で主に局在する。 endochitinaseは、フィラメントの細胞壁でほとんど分泌され、関連付けされています。分泌が急激に破壊され、微小管のフィラメントなどRrm4または従来キネシンKin1を欠いているフィラメントに損なわれてしまう。したがって、Rrm4媒介mRNAの輸送は、mRNAの輸送と分泌のメカニズムとの間の新規分子のリンクを暴く、アクティブCTS1の効率的な輸出のために不可欠であることが表示されます。
脳の老化と神経変性に関連付けられている選択的スプライシングの解析
年齢は神経変性のための最も重要な危険因子ですが、人間の脳における遺伝子発現に及ぼす加齢と神経変性の影響が最も頻繁に個別に研究されている。ここでは、前頭側頭葉変性症（FTLD）の影響を受ける転写レベルと認知は正常であった様々な年齢の個体の側頭葉皮質における選択的スプライシングの変化を分析したり、アルツハイマー病（AD）の影響を受けません。我々は、認知健常者の加齢に伴うスプライシングの変化を同定し、これらは彼らの年齢の独立したFTLDまたはAD患者の95％にも存在していたことがわかった。これらの変更は増加ポリピリミジン領域結合タンパク質（PTB）に依存するスプライシング活性と一致していた。また、FTLDまたはADではなく、認知正常な個体の個体に存在した疾患特異的スプライシングの変化を同定した。これらの変更は、減少した神経腫瘍学腹抗原（NOVA）依存性スプライシング調節、NOVAのタンパク質の減少、核豊富と一致していた。予想されるようにグリア細胞と神経細胞の遺伝子の控えめなダウンレギュレーションは、老化と関連していたのに対し、神経細胞の遺伝子の劇的なダウンレギュレーションは、疾患と関連していた。我々のデータは、年齢に関連したスプライシングの変化が転写レベルの変化とは独立して調節されていることが示された一方、これら2つの調節メカニズムは、代謝やDNA修復を含む同様の機能を持つ遺伝子の発現に影響を与えた。結論として、本研究で識別される選択的スプライシングの変更は、老化や神経変性の間に新しいリンクを提供します。
タンパク質-RNA相互作用：新しいゲノム技術と展望
RNA結合タンパク質は、遺伝子発現の調節において重要なプレーヤーである。この進行中の記事で、我々はこのようなリボソームなどの個々のRNA結合タンパク質または大規模な複合体を研究するために使用することができる最先端の技術を説明します。また、これらのアプローチは、転写、RNAプロセシング、翻訳を調べるために、新生の転写、mRNAは、マイクロRNAとリボソームRNAを含むRNAは、異なる種類の相互作用を研究するために使用することができる方法について説明します。最後に、我々はデータ分析の現在の課題とゲノムワイドスケールでのタンパク質-RNA相互作用の定量的かつ高解像度の画像を取得するために必要な今後のステップを強調表示します。
