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Articles by Larissa Belov in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Celular del cáncer colorrectal superficie de la proteína perfiles con un microarray de anticuerpos y la multiplexación de fluorescencia
1School of Molecular Bioscience, University of Sydney, 2Department of Surgery, Royal Prince Alfred Hospital, 3Department of Anatomical Pathology, Department of Anatomical Pathology, 4Department of Medicine, Concord Repatriation General Hospital
Se describe un procedimiento para la desagregación de cáncer colorrectal (CCR) para producir células viables único, que son capturados en microarrays de anticuerpos a medida el reconocimiento de los antígenos de superficie (CRC DotScan microarrays). Subpoblaciones de células obligado a los microarrays pueden ser perfiladas por multiplexación de fluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales marcados con colorantes fluorescentes.
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La Identificación De Los Repertorios De Antígenos De Superficie De Leucemias Mediante Un Microarray De Anticuerpos
Hemos descrito previamente un microarreglo de anticuerpos en racimo de la diferenciación (CD) que permite la determinación simultánea de más de 60 antígenos de CD en los leucocitos. Este procedimiento no requiere la purificación de proteínas o de etiquetado, o un sistema de detección de secundaria. Las células enteras son capturadas por un microarray de 10 puntos de anticuerpos nL inmovilizados en una película de nitrocelulosa sobre un portaobjetos de microscopio. Distintos patrones de unión de células se observa para las leucemias o linfomas diferentes. Estas neoplasias hematológicas surgen de las células precursoras de los linajes-T o B-linfocíticos, o de la hematopoyesis mieloide. Los patrones de puntos obtenidos de pacientes son distintas de las de los leucocitos de sangre periférica de los sujetos normales. Esta tecnología de microarrays ha sido objeto recientemente de una serie de mejoras. El microarray contiene ahora más anticuerpos de CD, y un escáner para obtener imágenes de patrones de puntos y de software para el análisis de datos proporcionan una amplia inmunofenotipo suficiente para el diagnóstico de las leucemias comunes. La tecnología está siendo evaluado para el diagnóstico de las leucemias con el uso paralelo de los criterios convencionales de diagnóstico.
Conservación De Los únicos De La Superficie Celular Mosaicos CD Antígenos Del VIH-1 En Individuos Infectados
Cluster de diferenciación (CD) antígenos se expresan en las células de linaje mieloide y linfoide. Como la mayoría de los procesos de la enfermedad implica la activación del sistema inmune o supresión de estos antígenos ofrecen oportunidades únicas para las respuestas de acogida de vigilancia. Inmunofenotipificación utilizando un número limitado de antígenos de CD permite a los estados de diferenciación de las células del sistema inmune que se determine. Fenotipo extendido la participación de la medición paralela de múltiples antígenos CD puede ayudar a identificar firmas de expresión de patrones asociados con estados específicos de la enfermedad. Para explorar esta posibilidad, hemos hecho una serie de CD de anticuerpos monoclonales y el escáner, permitiendo que el inmunofenotipo paralelo de suspensiones celulares de leucocitos en un único análisis y rápido. Para demostrar este enfoque, se utilizó el ejemplo específico de los pacientes infectados con el tipo-1 virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1). Un invariante inducida por el VIH firma antígeno CD se ha definido que es robusto e independiente de los resultados clínicos, compuesto de un perfil único de los niveles de expresión del antígeno CD que están tanto aumenta y disminuye en relación con los controles internos. Los resultados indican que el VIH inducidas por cambios en la expresión del antígeno CD son la enfermedad específica e independiente de los resultados. Su naturaleza invariante indica un componente irreversible a la infección retroviral y sugiere la utilidad de los patrones de la expresión del antígeno CD en la configuración de otras enfermedades.
Los Cambios Inducidos Inmunofenotípicos De Derechos Humanos Por Las Células HL60 Leucemia 1alfa ,25-dihidroxivitamina D3 Y 12-O-tetradecanoílo Forbol-13-acetato
1 alfa ,25-dihidroxivitamina D3 (1,25 D3) induce a las células HL60 adquieren un fenotipo monocito-como, mientras que las células tratadas con 12-O-tetradecanoil forbol-13-acetato (TPA) se asemejan a los macrófagos. El uso de un microarray de anticuerpos de 82 CD, 24 de racimo de la diferenciación (CD) antígenos fueron detectados en las células HL60. 1,25 D3 indujo a los antígenos siguientes en orden decreciente del cambio: CD14, CD11c, CD11b, CD54, CD86, CD38 y CD66c, con la represión de CD117, CD71, CD95, CD45 y CD64. TPA inducida por antígenos de los siguientes en orden decreciente del cambio: CD11c, CD9, CD11b, CD54, CD38, CD45RO y CD66c, con la represión de las células CD4, CD117, CD95, CD71 y CD64. Los resultados presentados proporcionan una base para la terapia de seguimiento diferenciación de las leucemias mieloides en los pacientes.
Microarrays De Detección De Nuevos Anticuerpos Monoclonales Para La Unión a Las Células T, Leucemia-B Y Mieloides
Hemos desarrollado un microarray (DotScan) que permite una rápida inmunofenotipo y la clasificación de las leucemias y los linfomas mediante la medición de la captura de células inmovilizadas por puntos de 82 anticuerpos CD [Belov, L., de la Vega, O., dos Remedios, CG, Mulligan , SP, 2001. Inmune de la leucemia con un grupo de microarrays de la diferenciación de anticuerpos. Cancer Res. 61, 4483, Belov, L., Huang, P., Barbero, N., Mulligan, SP, Christopherson, Rhode Island, 2003. Identificación de los repertorios de los antígenos de superficie en las leucemias con un microarray de anticuerpos. Proteómica 3, 2147]. La tecnología DotScan se ha utilizado para investigar las propiedades de 498 nuevos anticuerpos presentados en el Taller HLDA8. Estos anticuerpos se han aplicado como 10 puntos nl a una película de nitrocelulosa sobre un portaobjetos de microscopio para hacer una micromatriz HLDA8. Después de bloquear la superficie restante de nitrocelulosa, las matrices individuales fueron incubadas con cada uno de 7 tipos de células a partir de un panel de células leucemia humana que consta de tres líneas celulares, CCRF-CEM (una de las células T leucemia linfocítica aguda), MEC 1-(derivada de B- celular leucemia linfocítica crónica) y HL-60 (una leucemia promielocítica), y cuatro leucemias de pacientes: una célula T prolinfocítica leucemia, una crónica de células B leucemia linfocítica, y dos leucemias mieloides agudas. Leucemia células fueron capturados por los anticuerpos inmovilizados para los que expresan la molécula de la superficie correspondiente. Las células no unidas se lavaron suavemente fuera, las células unidas se fija a las matrices y los patrones de puntos se registraron utilizando un lector de matriz DotScan y cuantificado utilizando software DotScan análisis de datos. Los datos obtenidos muestran los perfiles de expresión única de los 7 tipos de células en el panel de la leucemia de células obtenidas con el microarray DotScan, y los patrones de captura diferenciales para estos 7 tipos de células en contra de los 498 examinados anticuerpos en el microarray HLDA8 construida para este estudio.
Multiplex De Detección De Moléculas De Superficie De Los Cánceres Colorrectales
Una técnica de multiplexación de fluorescencia se describe para el análisis del proteoma de membrana plasmática de las células de cáncer colorrectal a partir de muestras resecado quirúrgicamente, lo que permite la detección y el análisis inmunofenotípico cuando las células cancerosas se encuentran en la minoría. Una suspensión de células se preparó a partir de un tumor colorrectal, y la población mixta de células fue capturado en un microarray de anticuerpos CD. Las células cancerosas fueron detectados utilizando un anticuerpo fluorescente etiquetados para el antígeno carcinoembrionario (CEA-Alexa647) o un marcador de adhesión celular epitelial (EpCAM Alexa488). El uso de este procedimiento de multiplexación, patrones de puntos de casos de cáncer colorrectal eran distintas de las del tejido normal adyacente. La sustracción de los niveles de expresión para cada antígeno del tejido normal de los del cáncer muestra la expresión diferencial en el cáncer de CD66c, CD15s, CD55, CD45, CD71, CD45RO, CD11b y CEA, en orden descendente. Las células captadas en el microarray misma se marcaron también con fluorescentes CD3-ficoeritrina de anticuerpos revela la presencia de linfocitos infiltrantes de tumor. Los inmunofenotipos de linfocitos T de las muestras tumorales mostraron expresión diferencial de los alelos HLA-DR, TCR alfa / beta, CD49d, CD52, CD49e, CD5, CD95, CD28, CD38 y CD71, en orden descendente. Multiplexación de fluorescencia de las poblaciones de células mixtas capturados en un microarray de anticuerpos única permite a los perfiles de expresión de múltiples sub-poblaciones de células dentro de una muestra del tumor.
Clasificación De La LMA Mediante Un Microarray De Anticuerpos Monoclonales
Un grupo de diferenciación (CD) de anticuerpos microarrays llamó el microarray DotScan ha sido desarrollado que permite una amplia inmunofenotipo para obtener una suspensión de leucocitos en un único análisis. Para una leucemia con un recuento de la leucemia de mayor que 10 x 10 (9) / L, el inmunofenotipo obtenido es esencialmente el de la clon leucémico. El microarray de anticuerpos se imprime como microscópicas (10 nL) puntos en una película de nitrocelulosa sobre un portaobjetos de microscopio. Las células son capturados por los anticuerpos inmovilizados y un patrón de puntos se registra con un lector de conjunto óptico dando el inmunofenotipo de la leucemia. Los procedimientos se están desarrollando que debe permitir el diagnóstico de las leucemias mieloides por comparación del patrón de puntos obtenido a partir de una muestra de sangre desconocido con una biblioteca de patrones de consenso para las leucemias comunes.
Análisis De Las Leucemias Y Linfomas Humanos, Mediante Inmunofenotipos Extensas De Un Microarray De Anticuerpos
Un nuevo anticuerpo de microarrays se ha desarrollado que proporciona una amplia inmunofenotipo de las células leucémicas. El ensayo es una fase sólida de células de captura técnica en la que 82 antígenos se estudian simultáneamente. Este trabajo presenta el análisis de 733 pacientes con una variedad de leucemias y linfomas de sangre periférica y médula ósea. Análisis discriminante de la función de los perfiles de expresión de estos 733 pacientes y 63 sujetos normales se agruparon y presentaron altos niveles de coherencia con los diagnósticos convencionales obtenidos mediante criterios clínicos y de laboratorio. Los niveles generales de consenso para la clasificación de uso de los microarrays en comparación con los criterios establecidos fueron 93,9% (495/527 pacientes) de sangre periférica y el 97,6% (201/206 pacientes) para el aspirado de médula ósea, que muestra que el fenotipo amplio con frecuencia era el único capaz de clasificar la enfermedad cuando el clon leucémico fue la presencia de células de la población dominante. Inmunofenotipos para células neoplásicas eran distinguibles de las células normales, cuando el recuento de células leucémicas era por lo menos 5 x 10 (9) células / l en sangre periférica, o 20% de las células obtenidas a partir de aspirados de médula ósea. Esta técnica puede ser un complemento útil de los métodos de citometría de flujo y de otro tipo, cuando un fenotipo amplio de la leucemia de células que se desea para los ensayos clínicos, la investigación y el análisis de factores pronóstico.
Análisis De Microarrays De Anticuerpo De Antígenos De Superficie De Células CD4 + Y Células T CD8 + De Individuos VIH + Se Correlaciona Con Las Etapas De La Enfermedad
Los niveles de expresión de los antígenos de superficie celular como CD38 y HLA-DR se relacionan con etapas de la enfermedad de VIH. Hasta la fecha, el immunophenotyping de antígenos de superficie celular se basa en citometría de flujo, que permite la estimación de los marcadores de 3-6 en un momento. La tecnología de microarrays de anticuerpo DotScan recientemente descrita permite el análisis simultáneo de un gran número de antígenos de superficie de la célula. Esta nueva tecnología proporciona nuevas oportunidades para identificar nuevos marcadores diferenciales expresa o co-expressed en las células CD4 + y CD8 + T, que pueden ayudar a definir la etapa de la evolución de la infección por el VIH y el estado inmune del paciente.
Análisis De Microarrays Longitudinal De Antígenos De Superficie Celular En Células Mononucleares De Sangre Periférica De Individuos VIH + En Terapia Antiretroviral Altamente Activa
No ha habido intentos de la eficacia de la terapia antiretroviral altamente activa (HAART) determinada por la supervisión simultánea de más de 100 horas extras de antígenos de superficie celular. Se utilizó un microarray de anticuerpo para analizar cambios en la expresión de 135 horas extras de diferentes antígenos de superficie celular en PBMC de pacientes VIH + en TARGA. Se eligieron dos grupos, uno (n = 6) alcanzó respuesta sostenible manteniendo debajo de viremia detectable de plasma y el otro (n = 6) respondió de forma intermitente. Se recolectaron muestras de sangre sobre un promedio de 3 años y 5-8 momentos fueron seleccionados para el análisis de microarrays y análisis estadístico.
La Aplicabilidad De Un Grupo De Microarrays De Anticuerpos Monoclonales a La Diferenciación De Diagnóstico De Enfermedades Humanas
Los recientes avances en la tecnología de microarrays de anticuerpos han facilitado el desarrollo de plataformas de diagnóstico multiplexados. Los datos de expresión de antígenos altamente paralelos obtenidos a partir de estos conjuntos permitiría a los estados de enfermedad que se caracteriza el uso de patrones de proteínas en lugar de los marcadores de proteínas individuales. El desarrollo de una plataforma de microarrays de anticuerpos de aplicación general requiere una consideración cuidadosa del contenido de la matriz. El grupo humano de diferenciación (CD) antígenos constituyen un conjunto candidato prometedor, siendo unidos por su expresión común en la superficie celular de leucocitos y el hecho de que la mayoría realizan funciones críticas en la respuesta inmune humana. El potencial de diagnóstico de un microarray, que contiene 82 grupo de anticuerpos monoclonales de diferenciación (microarrays DotScan) ha sido demostrada para una variedad de estados de enfermedades infecciosas y neoplásicas, entre ellas el VIH, muchas leucemias agudas y crónicas y el cáncer colorrectal. Es probable que estos microarrays tendrán una utilidad más general que se extiende a otras categorías patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunes, metabólicas y degenerativas.
El ácido Trans-retinoico Induce Diferentes Cambios Inmunofenotípicos De Derechos Humanos Y HL60 NB4 Leucemias Mieloides
El ácido trans-retinoico (ATRA) se utiliza para tratar pacientes con leucemia promielocítica aguda (APL), induciendo células APL para diferenciarse en neutrófilos anormales. Para investigar la posible relación entre el cromosoma por translocación t (15; 17) encontraron en el tratamiento de la APL y la ATRA, los humanos líneas celulares de leucemia mieloide HL60 y NB4, que son PML-RARalpha positivo y negativo, respectivamente, fueron tratados con ATRA y immunophenotyped utilizando un microarreglo de anticuerpos CD. Para las células HL60, ATRA indujo aumentos importantes en orden descendente de CD38, CD11b, CD45RO, CD11c, CD54 y CD36 con la represión de CD117 y CD44. Para las células NB4, ATRA incrementos inducidos importantes en orden descendente de CD11c, CD54, CD11a, CD11b, CD53, CD65, CD138, CD66c y el receptor de células T alfa / beta (TCRalpha / beta), con la represión de CD38 y CD9. La inducción de un número de estos antígenos CD es coherente con la diferenciación conocida de estas leucemias a los neutrófilos anormales. Aproximadamente la mitad de los antígenos hasta regulada por ATRA sobre la NB4 células eran las moléculas de adhesión, incluidos CD11a, CD11b, CD11c, CD54, CD66c y CD138, en consonancia con el aumento de la adhesividad de las células de leucemia observados en los pacientes con APL tratados con ATRA. En las células HL60, ATRA indujo la expresión de CD38, CD43 y CD117 CD45RO y reprimidos, mientras que lo contrario ocurrió en el NB4 células que contienen quimérico PML-RARalpha. Para las células NB4, ATRA indujo a algunos aumentos notables en los antígenos de CD que no se ve para HL60: CD14 (16,6 veces), CD32 (27,8) y CD53 (20,5) y CD65 (139), CD66c (79,7) y CD126 (15,1), y CD138 (57,6). La expresión de estos antígenos pueden ser reguladas por PML-RARalpha en presencia de ATRA. Estos antígenos CD podrían ser objetivos para el tratamiento de la APL sinérgico con los anticuerpos terapéuticos después del tratamiento con ATRA.
Perfiles De Antígenos De CD En Leucemias Con Un Microarray De Anticuerpos
Cluster de diferenciación (CD) antígenos se definen cuando una molécula de superficie se encuentra en algunos miembros de un panel estándar de células humanas reacciona con nuevo anticuerpo al menos uno, y hay buenos datos moleculares que se acompañan. Los anticuerpos monoclonales para antígenos de superficie de CD en los leucocitos se han utilizado para citometría de flujo, y más recientemente para la construcción de micromatrices que capturan células vivas. Estos microarrays DotScan permitir la caracterización rápida y altamente paralela de los repertorios de los antígenos de CD cuyos patrones de expresión puede estar correlacionada con discretos subtipos de leucemia, o se utiliza para definir "las firmas de los biomarcadores para enfermedades no hematológicas. DotScan con fluorescencia permite la multiplexación de perfiles de antígenos de CD para subconjuntos de células pequeñas, como las células de cáncer colorrectal y los linfocitos infiltrantes del tumor de una muestra quirúrgica.
Superficie De Perfiles De Antígeno De Cáncer Colorrectal El Uso De Microarrays De Anticuerpos Con Multiplexación Por Fluorescencia
Se describe un procedimiento para la desagregación de los tipos de cáncer colorrectal (CCR) y tejidos normales la mucosa intestinal para producir suspensiones de células viables individuales, que luego son capturados en microarrays de anticuerpos a medida que reconocen antígenos de superficie de 122 diferentes DotScan CRC microarrays). Patrones de unión celular registrados por exploración óptica de microarrays proporcionar un perfil de la superficie de los antígenos en las células. Sub-poblaciones de células unidas en el microarray puede ser perfilada por la multiplexación de fluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales marcados con puntos cuánticos u otros colorantes fluorescentes. Perfiles de la superficie se presentan por 6 líneas celulares de CRC (T84, LIM1215, SW480, HT29, Caco y SW620) y las muestras quirúrgicas de 40 pacientes con CCR. El análisis estadístico reveló diferencias significativas entre los perfiles de las muestras y los controles de la mucosa CRC. La agrupación jerárquica de datos CRC identificó varios grupos de enfermedades que muestran cierta correlación con el estadio clínico-patológico determinado por el análisis histopatológico convencional. Multiplexación de fluorescencia utilizando ficoeritrina o Alexa Fluor 647-anticuerpos conjugados fue más eficaz que la multiplexación con anticuerpos marcados con puntos cuánticos. Este método relativamente simple produce una gran cantidad de información para cada muestra del paciente y, con mayor aplicación, debe proporcionar firmas enfermedad y permitir la identificación de los pacientes con buen pronóstico o pobre.
Un Microarray De Anticuerpos Extendido Para El Melanoma Metastásico Superficie De Perfiles
Un microarray de anticuerpos fue desarrollado para perfilar el proteoma superficie de las células del melanoma, lo que puede facilitar el melanoma sub-clasificación y proporcionar una importante información pronóstica útil para predecir el comportamiento clínico del melanoma (por ejemplo, los sitios probables de diseminación metastásica), la evolución del paciente y respuesta al tratamiento . Cuarenta y ocho anticuerpos fueron seleccionados en base a su correlación con el desarrollo del melanoma, la progresión y / o pronóstico y se imprime en las diapositivas de nitrocelulosa. Los anticuerpos inmovilizados capturar células vivas que expresan antígenos correspondientes para producir un patrón de células punto de unión que representa el perfil de antígeno de superficie (inmunofenotipo) del melanoma. Firmas de antígeno de superficie se determinaron algunas líneas de células normales de melanocitos y el 6 de melanoma y suspensiones celulares preparadas a partir de 10 extirpados quirúrgicamente metástasis en los ganglios linfáticos del melanoma. Un procedimiento para la obtención de distintos perfiles de antígenos de superficie de las células del melanoma y los leucocitos de muestras clínicas de los ganglios linfáticos también se desarrolló el uso de anti-CD45 bolas magnéticas. La captura de perlas en vivo, con destino leucocitos en estos microarrays de anticuerpos proporciona una mejora significativa de esta tecnología de microarrays. El microarray de anticuerpos se utiliza para los paneles de perfil de metástasis en los ganglios extirpados quirúrgicamente melanoma linfáticos (melanoma y las fracciones de leucocitos) para determinar si los inmunofenotipos relación con las características clínico-patológicas, la progresión de la enfermedad y los resultados clínicos.
Marcadores De Superficie Celular En El Pronóstico Del Cáncer Colorrectal
La clasificación de los tipos de cáncer colorrectal (CCR) se basa actualmente en gran medida de las características del tumor histológicamente determinados, tales como el estado de diferenciación y estadio del tumor, es decir, la profundidad de la invasión del tumor, afectación de los ganglios linfáticos regionales y la aparición de metástasis a otros órganos. Estos son los factores convencionales de pronóstico para la supervivencia del paciente y, a menudo determinan la necesidad de terapia adyuvante después de la resección quirúrgica del tumor primario. Sin embargo, los pacientes con la misma etapa de CRC puede tener muy diferentes resultados relacionados con la enfermedad. Para algunos, la extirpación quirúrgica de los tumores en etapa temprana conduce a una recuperación total, mientras que para otros, la recurrencia de la enfermedad y la metástasis puede ocurrir independientemente de la terapia adyuvante. Por tanto, es importante entender los procesos moleculares que conducen a la progresión de la enfermedad y la metástasis y para encontrar marcadores pronósticos más confiables y nuevos objetivos para la terapia. Esta revisión se centra en las proteínas de la superficie celular que se correlacionan con la progresión del tumor, la metástasis y la evolución del paciente, y se analizan algunos de los desafíos en la búsqueda de marcadores pronósticos de proteínas en el CCR.
La Cladribina Y Fludarabina Nucleósidos Cambiar Los Niveles De Antígenos De CD En Los Trastornos Linfoproliferativos B-
Los análogos de la purina, fludarabina nucleósidos (FDA), y la cladribina (CdA) (1 m, 24 horas), cambiado de manera significativa los niveles de algunos antígenos de superficie en el ser humano de células B y las líneas de mec2 Raji. Los cambios en las proteínas de la superficie fueron identificados con un clúster de microarrays de anticuerpos diferenciación (CD) que captura las células vivas y confirmado por citometría de flujo. Para las células Raji, CDA hasta reguladas CD10, CD54, CD80 y CD86, con la represión de CD22, mientras que la FDA hasta reguladas CD20, CD54, CD80, CD86 y CD95. Para mec2 células, CDA hasta reguladas CD11a, CD20, CD43, CD45, CD52, CD54, CD62L, CD80, CD86, y CD95, pero la FDA no tuvo ningún efecto. Sobre regulación de los antígenos CD particulares inducido en un trastorno linfoproliferativo de células B por un análogo de la purina puede proporcionar dianas para anticuerpos terapéuticos con la muerte celular sinérgico.
