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Articles by Larry J. Millet in JoVE
JoVE Bioengineering
Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow
1Electrical and Computer Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Micro and Nanotechnology Lab, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign
Dielektrophorese (DEP) ist eine effektive Methode, um Zellen zu manipulieren. Leiterplatten (PCB) können kostengünstig, wiederverwendbar und effektive Elektroden zur berührungslosen Zellmanipulation in mikrofluidischen Systemen bieten. Durch die Kombination von PDMS-basierten mikrofluidischen Kanälen mit Deckgläsern auf Leiterplatten, zeigen wir, Perle und Zell-Manipulation und Trennung innerhalb Mehrkanal mikrofluidischen Bauteilen.
Other articles by Larry J. Millet on PubMed
Microfluidic Vorrichtungen Zur Kultivierung Von Primärer Säugetier-Neurons Bei Niedrigen Dichten
Microfluidic Vorrichtungen sind benutzt worden, um High-Density Kulturen von vielen Zelltypen zu studieren. Da Signale von Zelle zu Zelle ist, gibt es jedoch müssen Kultur-Systeme entwickelt, die kleine Anzahl von Neuronen aufrechtzuerhalten und ermöglichen Analysen der Mikroumgebungen. Solche Kulturen sind schwer zu pflegen in stabile Form, und es ist schwierig, den Zelltod zu verhindern, dass bei der Verwendung von primärer Säugetier-Neurons. Wir zeigen, dass postnatale primäre Neuronen von Ratten bei niedrigen dichten innerhalb Nanoliter-Volume Mikrovorrichtungen hergestellt mit Polydimethylsiloxan (PDMS) kultiviert werden können. Dies erfordert einen zusätzliche Fertigung Schritt, serielle Extraktionen/Waschprogramme von PDMS mit mehreren Lösungsmitteln, der unvernetzte Oligomere, Lösungsmittel und Rückstände von den Platinkatalysator verwendet, um das Polymer heilen entfernt. Wir fanden, dass dieser Schritt die Biokompatibilität der PDMS-Geräte deutlich verbessert. Während die Neuronen überleben > oder = 7 Tage im offenen Kanal Mikrovorrichtungen, die Fähigkeit, Kultur-Neuronen im geschlossen-Channel-Geräte hergestellt aus unbehandeltem, native PDMS beschränkt sich auf < oder = 2 Tage. Wenn die geschlossen-Kanal PDMS Geräte extrahiert werden, Biokompatibilität verbessert für zuverlässige Neuron Kulturen bei niedrigen dichten für die > oder = 7 Tage. Vergleiche autoklaviert PDMS und native, unbehandelt PDMS zeigen, dass das Lösungsmittel-behandelte Polymer bei der Aufrechterhaltung der niedrigen Dichte der primären Neuronen in Kultur überlegen ist. Wenn neuronale Affinität für lokale Substrate direkt beobachtet wird, finden wir, dass die Axone zu Kanal Ecken zu lokalisieren und PDMS-Oberflächen auf Glas in Hybrid-Geräte bevorzugen. Wenn die Kanäle mit Medien durch Schwerkraft Fluss perfusing, kultivierte Neuronen, die für Überleben > oder = 11 Tage. Extrahieren von PDMS Biokompatibilität Microfluidic Vorrichtungen verbessert und ermöglicht dadurch das Studium der Differenzierung von identifizierbaren Neuronen und die Charakterisierung der lokalen extrazelluläre Signale.
Jones Phase Mikroskopie Von Transparenten Und Anisotropen Proben
Wir entwickelten eine interferometrische Mikroskopie-Technik, als Jones Mikroskopie, fähig die Ortsaufgelöste Jones Polarisation Matrix zugeordnet ist transparent und anisotropen Proben extrahieren phase bezeichnet. Dies ist eine Verallgemeinerung des quantitativen Phase Bildgebung, die von einer Diagonale Element der gemessenen Matrix erstattet werden. Das Prinzip der Technik zeigt sich mit Messungen ein Flüssigkristall-spatial light Modulator und das Potenzial für live Cell imaging mit Experimenten auf Leben Neuronen in Kultur.
Neuropeptidomics Des Supraoptic Ratte Kerns
Säugetier-Supraoptic Kern (Sohn) ist ein Angriffspunkt im Gehirn eine Vielzahl von Körperfunktionen regulieren. Innerhalb der Sohn sind peptiderge Magnocellular Neuronen, die als die Adenohypophyse (posterior Hypophyse) project beteiligt Steuern osmotische Gleichgewicht, Laktation und Höllenplanet, teilweise durch Sekretion Peptide wie Oxytocin und Vasopressin ins Blut zu signalisieren. Ein besseres Verständnis der Sohn Aktivität und Funktion erfordert, Identifizierung und Charakterisierung der Peptide durch den Sohn verwendet. Hier sind kleine Beispiel Vorbereitung Ansätze für Neuropeptidomic Studien isoliert Sohn Proben von ganze Kerne bis auf einzelne Magnocellular Neuronen bis hin optimiert. Im Gegensatz zu den meisten früheren Säugetier-Peptidome Studien sind nicht sofort Gewebe erhitzt oder Mikrowelle. Sohn Proben stammen aus ex Vivo Gehirn Segment Vorbereitungen über Gewebe Punch und die Proben über Schrittabfolge Peptid-Extraktion verarbeitet. Analysen der Proben mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und Tandem-Massenspektrometrie führen bei der Identifizierung von 85 Peptide, einschließlich 20 einzigartige Peptide aus bekannten prohormone. Die Stichprobengröße weiter reduziert wird, verringert sich die Tiefe der Peptid-Abdeckung; jedoch sind auch aus einzeln isolierte Magnocellular neuroendokriner Zellen, Vasopressin und mehrere andere Peptide gefunden.
Führung Neuron Entwicklung Mit Planaren Oberfläche Farbverläufe Der Substrat-Cues Hinterlegt Mit Microfluidic Vorrichtungen
Verdrahtung des Nervensystems beruht auf das Zusammenspiel von intrinsische und extrinsische signalisierende Moleküle, die Neurit Erweiterung, neuronale Polarität, Prozess-Reifung und Erfahrung-abhängige Verfeinerung zu steuern. Extrinsische Signale etablieren und Neuron-Neuron-Interaktionen während der Entwicklung zu bereichern. Verstehen, wie solche extrinsische Signale Neuronen in-vitro-neuronale Verbindungen herstellen direkter wird die Entwicklung der organisierten neuronale Netze für die Untersuchung der Entwicklung und Funktion des Nervensystems-Netzwerken erleichtern. Produzieren, Netzwerke von Nervenzellen mit in-vitro-definierten Konnektivität bestellt stellt spezielle technische Herausforderungen, da die Ergebnisse mit den biologischen Anforderungen der Umpolung neuronaler Netzen kompatibel sein müssen. Hier zeigen wir die Fähigkeit, stabile, lehrreiche Oberfläche gebundene Gradienten von Laminin zu bilden, die postnatale hippocampal Neuron Entwicklung in-vitro-führen. Unsere Arbeit wird ein 3-Kanal, miteinander verbundenen Microfluidic-Gerät, das ermöglicht die Produktion von Adlayers von planaren Substraten durch die Kombination von Laminar-Flow, Diffusion und Physisorption verwendet. Durch einfache Strömung Modifikationen waren eine Vielzahl von Mustern und Farbverläufen Laminin (LN) und Fluoreszein Isothiocyanat-konjugierten Poly-l-Lysin (FITC-PLL) aufbewahrt vorhanden Neuronen mit einer lehrreichen Natursand, neuronale Entwicklung zu führen. Wir präsentieren Ihnen drei Varianten im Substrat-Design, die deutliche Wachstum Therapien für postnatale Neuronen in verteilten Zellkulturen produzieren. Beim ersten Ansatz wurden Verbreitung-vermittelte Farbverläufe LN Deckgläser Neuronen zum Vergrößern von LN-Konzentrationen führen gebildet. Beim zweiten Ansatz wurde eine kombinierte Steigung von LN und FITC-PLL produziert neuronale Wachstum zu einer 15 Microm Breite Wachstum Zone in der Mitte der beiden überlagerten Gradienten einschränken mit Laminar-Flow Ehrgeiz getrieben. Der letzte Ansatz veranschaulicht die Kapazität, binäre Linien der FITC-PLL in Verbindung mit Oberfläche Gradienten von LN und Rinderserumalbumin (BSA), Substrat-Adlayers zu produzieren, die zusätzliche Kontrolle über Wachstum ermöglichen zu kombinieren. Diese Arbeit wird die Vorteile der raumzeitlichen Fluidtechnik für Musterung Oberfläche gebundene Farbverläufe mit einer einfachen Mikrofluidik-basierten Substrat Ablagerung Prozedur veranschaulicht. Wir erwarten, dass dieser Ansatz Mikrofluidik-basierte Musterung lehrreich Muster und Farbverläufe der Oberfläche gebundene aktivieren Sie eine neue Ebene des Steuerelements in der Führung von Neuron Entwicklung und Netzwerk Bildung bieten wird.
Direkte Zellulären Peptidomics Von Supraoptic Magnocellular Und Neuronen in Low-Density Co-cultures
Genomic und Proteomic Studien Hirnregionen spezialisierte Funktion liefern Hinweise darauf, dass die Kommunikation zwischen den Neuronen durch Systeme der unterschiedlichen chemischen Botenstoffe vermittelt wird. Diese Analysen sind weitgehend Gewebe oder Bevölkerung basieren, während die eigentliche Kommunikation von Zelle zu Zelle ist. Um zu verstehen, die Ergänzung der interzellulären Signale, die von einzelnen Neuronen produziert, sind neue Methoden erforderlich. Wir haben ein neuartiges Neuron-zu-Neuron, serumfreie, Kokulturen Ansatz entwickelt, die verwendet wurde, um die übergeordneten zellulären Peptidome der einzelnen primären Säugetier-Neuronen zu bestimmen. Wir isoliert Magnocellular Neuronen vom Supraoptic Kern der frühen postnatalen Ratte und verwaltet sie in serumfreien niedriger Dichte Kulturen ohne Gliazellen Unterstützung Schichten; unter diesen Bedingungen benötigte niedriger Dichte co-cultured Neuronen. Co-Culturing Magnocellular Neuronen mit Neuronen lokalen Zugriff auf einzelne Neuronen innerhalb der Kultur für Massenspektrometrie gestattet. Mit direkten Sampling, wurden Peptid-Profile für räumlich getrennte, identifizierbare Neuronen innerhalb der Kokulturen erzielt. Wir erkannt wiederholt 10 Spitzen, die wir zuvor gekennzeichneten Peptide zuweisen und 17 Spitzen, die nicht zugewiesenen bleiben. Peptide aus dem Vasopressin Prohormon und Secretogranin-2 sind Magnocellular Neuronen, zugeschrieben, während Neurokinin A Peptid J und Neurokinin B kultivierten Neuronen zugeschrieben werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Aufklärung der zellspezifische Prohormon Verarbeitung und die Entdeckung der Zell-Zell-Signalling-Peptide.
Messung Der Anhaftende Zelle Masse Und Wachstum
Die Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften von Zellen wie ihrer Masse und Steifigkeit ist von großem Interesse und kann tief greifende Auswirkungen in Zelle Biologie, Tissue-Engineering, Krebs und Krankheit-Forschung haben. Beispielsweise kann die direkte Abhängigkeit der Wachstumsrate der Zelle Zelle Masse für einzelne anhaftende menschliche Zellen die Mechanismen, die Zellzyklusprogression erhellen. Hier entwickeln wir ein Array von Mikro-Elektro-mechanischen Systemen (MEMS) resonanten Masse Sensoren, die verwendet werden können, um die biophysikalische Eigenschaften, Masse und Wachstum Rate der einzelnen adhärente Zellen direkt zu messen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Freischwinger Masse Sensoren bewahren Sie unsere Sensoren eine einheitliche Masse Empfindlichkeit über Zelle Ansatzfläche. Durch Messung der Frequenz-Verschiebung der Massen Sensoren mit wachsender (weich) und feste (steif) Zellen und durch analytische Modellierung, wir leiten das Elastizitätsmodul der ungebundenen Zelle und die Abhängigkeit der Zelle Masse Messung auf Zelle Steifigkeit zu entwirren. Schließlich wuchs der einzelne Zellen auf die Massen Sensoren und ihre Masse für 50 + Stunden gemessen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass anhaftende menschlichen Doppelpunkt Epithelzellen haben Wachstumsraten mit einer größeren Masse der Zelle erhöht, und die durchschnittliche Wachstumsrate linear mit der Masse der Zelle, bei 3.25%/hr steigt. Unsere empfindlichen Massen Sensoren mit einer Lage-unabhängige Masse Empfindlichkeit Koppelbar mit Mikroskopie zur gleichzeitigen Überwachung von Zellwachstum und Status und bieten eine ideale Methode, um Zellwachstum, Zellzyklusprogression, Differenzierung und Apoptose zu studieren.
Aktin-gesteuerte Zelle Dynamik Durch Fourier-Transform-Licht Streuung Sondiert
Wir angewendet, das neu entwickelte Fourier Transform Licht Streuung (FTLS), Dynamische Lichtstreuung in Einzelzellen Leben im zeitlichen Maßstab Sekunden bis Stunden zu studieren. Die nanoskaligen Zelle Schwankungen wurden mit und ohne der aktiven Aktin-Beitrag gemessen. Wir haben experimentell gefunden, dass die räumlich-zeitliche Signale von FTLS erbrachte interessante Zytoskelett Dynamik in Gliazellen (die vorherrschenden Zelltyp im Nervensystem) zeigen. Aktive Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts wurde durch seine dynamischen Eigenschaften über Cytochalasin-D, ein Medikament, das hemmt die Aktin-Polymerisation/Depolymerisation Modulation erhalten.
Räumliche Licht Interferenzen Tomographie (SLIT)
Wir präsentieren die räumliche Licht Interferenzen Tomographie (Schlitz), eine Bezeichnung-freie Methode für 3D-Imaging transparente Strukturen wie lebenden Zellen. Schlitz nutzt das Prinzip der interferometrische Bildgebung mit Breitband-Felder und verbindet die optischen Anspritzung aufgrund der Kohärenzlänge Mikron-Skala mit der hohe numerische Apertur-Objektiv. Messung der Phasenverschiebung Karte, die dem Objekt zugeordnet, wie es durch Fokus übersetzt bietet vollständige Informationen über die 3D Verteilung der Brechungsindex zugeordnet. Mit einen Wiederaufbau-Algorithmus basiert auf geb. Angleichung, zeigen wir, dass die Probe-Struktur über eine Entwindung 3D, komplexe Feld wiederhergestellt werden kann. Wir veranschaulichen die Methode mit rekonstruierten tomographischen Brechungsindex Verteilungen von Mikrosphären, Photonische Kristalle und Ungefärbtes lebender Zellen.
Musteranalyse Und Räumliche Verteilung Der Neuronen in Der Kultur
Das Nervensystem ist eine komplexe, hoch geordnete, integrierte Netzwerk von Zellen. Verteilte Kulturen von Neuronen aktivieren Ermittlungen systeminterne zellulären Funktionen ohne die Komplexität, die inhärenten im intakten Nervensystem. Diese Kultur wird eine homogen verteilte Bevölkerung, die räumlich zufälligen wird generiert. Trotz der riesigen Anzahl von Studien unter Verwendung verstreut Neuronen, wenige Studien Adresse die räumliche Verteilung von großen Populationen von Neuronen, in-vitro. Wir verwendet, Ink-Jet-Druck und Oberflächenchemie gemusterten Bereiche mit Poly-Lysin Kraftschlußbeiwert (∼50 μm Punkte) vor dem Hintergrund der fluorierten-Silan gegenübergestellt. Quantitativ analysieren wir die Bevölkerung aus gemusterten Neuronen auf gedruckten Protein-Spots und ungemusterten Neuronen. Mit einem Microarray-Scanner, erwarben wir große Bilder (72 mm × 22 mm) der Muster und Neuronen mit und ohne Muster. Schnelle Fourier-Transformation (FFT)-Bild-Analyse wurde verwendet, um die globale Ausrichtung der Neuronen im Muster zu bestimmen. Durch Punkt-Muster-Analyse beschrieben wir die räumliche Organisation der verteilten Neuronen mit oder ohne, gemusterte Untergründe. Gemusterte Neuronen zeigen räumliche Organisation Eigenschaften erinnert der gedruckten Muster, mit räumlichen Verteilungen Vertreter der ungemusterten Neuronen. Vor allem zeigen sowohl gemusterte und ungemusterten Neuronen Abfahrt von null Modelle der vollständige räumliche Zufälligkeit (CSR; ein homogener Poisson-Prozess) auf kürzere Entfernungen mit Konformität zu CSR, die bei längeren Strecken. Zelluläre Morphometrie zeigen, dass im Vergleich zu ihren Gegenstücken ungemusterten vor Ort-gemustert Neuronen eine deutliche Steigerung (p < 0,0001 zeigen) in die mittlere dendritische Zirkularität und eine Zunahme der Anzahl an mehr kreisförmige Neuronen. Durch Neurit Ablaufverfolgung zeigen wir, dass dendritische Prozesse auf gemusterten Bereichen auch sehr beschränkt sind und sie durchschnittlich 58 % kürzer als Dendriten der Neuronen ohne Muster sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass gemusterte Bereichen der räumlichen Organisation der Somata und Dendriten der kultivierten Neuronen ändern und traditionelle neuronale Kulturen von CSR abweichen.
