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Articles by Larry J. Millet in JoVE
JoVE Bioengineering
誘電泳動と層流を用いたマルチチャネルマイクロ流体デバイスの分離ビーズと細胞
1Electrical and Computer Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Micro and Nanotechnology Lab, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign
誘電泳動（DEP）は、細胞を操作するために有効な方法である。プリント回路基板（PCB）は、マイクロ流体デバイス内に非接触で細胞操作のために、安価な再利用可能で効果的な電極を提供することができます。プリント基板上にカバーグラスを持つPDMSベースのマイクロ流体チャネルを組み合わせることで、我々は、マルチチャンネルマイクロ流体デバイス内でビーズと細胞操作と分離を示しています。
Other articles by Larry J. Millet on PubMed
低密度で一次哺乳類神経細胞培養のためのマイクロ流体デバイス。
マイクロ流体デバイスは多くの細胞の種類の高密度培養研究に使用されています。細胞-細胞シグナルはローカルであるため、ただし、ニューロンの小さな数字を維持し、微小の解析を有効にする文化のシステムを開発する必要があります存在します。このような文化が安定した形で維持するためにハードされ、プライマリの哺乳類のニューロンを使用するときの細胞死を防ぐことは困難です。産後の一次海馬ニューロン ラットから低密度ポリジメチルシロキサン (PDMS) を用いて作製したナノリットル ボリューム マイクロ デバイス内で培養できることを示します。そうすること uncrosslinked のオリゴマー、溶剤とポリマーを治すために使用される白金の触媒の残留が削除され追加作製手順はいくつかの溶剤の PDMS のシリアル抽出/洗浄が必要です。我々 は、このステップ PDMS デバイスの生体適合性が大幅に向上が見つかりました。ニューロンを生き残るために対し目または = 7 日オープン チャネルのマイクロ デバイスで文化ニューロンの未処理、ネイティブ PDMS 製閉鎖チャネル デバイスの機能に限定です < または = 2 日。閉じたチャネル PDMS デバイスが抽出されるとき、信頼性の高いニューロンの文化の低密度を可能にする生体適合性を向上させる目または = 7 日。オートクレーブ処理した PDMS とネイティブ、未処理の PDMS の比較溶剤処理高分子が一次ニューロンの文化の低密度を維持する上でより優れていることを明らかにします。神経親和性ローカル基板を直接観察すると、軸索チャネルのコーナーにローカライズし、ハイブリッド デバイスでガラスに PDMS 表面を好むことを見つけます。重力流によってメディアのチャンネルを perfusing するときは、培養海馬神経細胞生存目または = 11 日。PDMS 抽出するマイクロ流体デバイスの生体親和性が向上し、識別可能なニューロンの分化の研究とローカルの細胞外のシグナルのキャラクタリゼーションを可能します。
ジョーンズ位相顕微鏡の透明性と異方性サンプル。
我々 としてジョーンズ顕微鏡、透明性と異方性のサンプリングに関連付けられた空間分解のジョーンズ偏光マトリックス抽出可能なフェーズに呼ばれる、干渉顕微鏡技術を開発しました。これは、測定されたマトリックスから 1 つの対角要素を回復、定量位相イメージングの一般化です。液晶空間光変調器の測定手法の原理を発揮、ライブのニューロンの文化のライブセル イメージングのための潜在性を実験します。
視索上のラットの核の Neuropeptidomics。
哺乳類視索上核 （息子） は、様々 な生理機能を調節する脳で神経内分泌センターです。息子内合併 (脳下垂体後葉) にプロジェクト ペプチドニューロン大細胞神経細胞浸透圧バランス、泌乳と分娩を通じて部分的ペプチド オキシトシンとバソプレシンなどが血液中にシグナル伝達の分泌の制御に関与しています。息子の活動と機能の改善された理解に息子によって使用されるペプチドの同定と解析が必要です。ここでは、小体積試料の調製方法 neuropeptidomic 研究全体の核単一大細胞神経細胞にまで至る孤立した息子サンプルのために最適化されています。ほとんどの以前哺乳類ペプチドームの研究とは異なり、組織がないすぐに加熱または電子レンジでです。息子のサンプルから ex vivo 脳スライス標本組織パンチとペプチドの抽出の一連のステップを通して処理されるサンプルを介して取得されます。液体クロマトグラフィー質量分析法及びタンデム質量分析法による試料の分析知られているプロホルモンから 20 ユニークなペプチドを含む 85 のペプチドの同定結果します。サンプル サイズをさらに小さくと、ペプチドのカバレッジの深さが減少;ただし、個別に孤立した大細胞神経内分泌細胞から、バソプレッシンといくつかの他のペプチドが検出されます。
基板の手がかりの平面の表面の勾配を持つニューロン発達を導くマイクロ流体デバイスを用いた堆積。
神経系の配線の神経突起の伸展, 神経細胞の極性、プロセス成熟と経験依存的なリファインメント制御組み込みと外因性のシグナル分子の相互作用に依存しています。外因性のシグナルを確立し、神経細胞ニューロンの相互作用を開発中に豊か。どのように神経細胞 in vitro 神経接続を確立するためにそのような外因性の手がかりを直接理解開発と神経系ネットワークの機能を調査するため組織的なニューラル ネットワークの開発が容易になります。結果は、ニューラル ネットワークの配線をし直す、生物の要件に準拠する必要がありますのでニューロンのネットワークを in vitro で定義された接続と注文生産特別な技術的な課題が生じます。ここでガイド生後海馬ニューロンの体外発育安定、教訓的なの表面結合勾配ラミニンを形成する能力を示しています。我々 の仕事のフラーレン層流、拡散、物理吸着の組み合わせにより平面基板の生産を許可 3 チャネル、相互接続されたマイクロ流体デバイスを使用します。単純なフローの変更を通じて、さまざまなパターンやグラデーションのラミニン (LN) とフルオレセイン イソチオシアネート共役多 l リジン (FITC PLL) 存在のニューロンと神経の開発を導くために有益な下地に堆積しました。異なる成長レジメン分散した細胞培養における生後のニューロンを生成する 3 つのバリエーションの基板設計を提案する.最初のアプローチでは、グラデーションの拡散を介した LN のカバー スリップ LN 濃度の増加に向けたニューロンを導くために形成されました。2 番目のアプローチでは、LN および FITC PLL の結合された勾配を 15 microm 広い成長ゾーン センター神経成長の 2 つの重畳グラデーションを制限する誤嚥駆動流を使用して製作されました。最後のアプローチでは、成長の制御の追加レベルを提供する基板フラーレン生成に LN とウシ血清アルブミン (BSA) の表面の勾配を持つ FITC PLL と組み合わせてバイナリの行を結合する能力を示しています。この作業は、単純なマイクロ流体デバイス基板の蒸着プロシージャを使用して表面結合勾配パターン形成の時空の流体制御の利点を示します。我々 はこのパターニング マイクロフルイディクス ベースのアプローチが有益なパターンとニューロンの開発とネットワークの形成を導くコントロールの新しいレベルを有効にする表面結合勾配を提供することを見込んでいます。
直接細胞 Peptidomics の視大細胞と海馬ニューロンの低密度においては。
ゲノムおよびプロテオーム研究専門機能の脳領域のニューロン間の通信による多様な化学メッセンジャーのシステムを介すること証拠を提供します。細胞から細胞への実際の通信であるに対しこれらの分析は主組織または人口ベース、です。個々 のニューロンによって生成された細胞間の信号の補数を理解するには、新しいメソッドが必要です。小説ニューロン-に-ニューロン、無血清、個々 の一次哺乳類ニューロンの上位細胞ペプチドームを決定するために使用された混合培養のアプローチを開発しています。大細胞神経細胞の初期生後ラット視索上核から分離し、無料の血清低密度培養グリア サポート レイヤーなしでそれらを維持;これらの条件の下で彼らは低密度共ニューロンを必要です。海馬ニューロンを大細胞神経細胞の混合培養質量分析のための文化内の個々 のニューロンへのローカル アクセス許可。ダイレクト サンプリングを使用して、空間的明瞭で、個人を特定できるニューロン内培養ペプチド プロファイルが得られました。私たちは繰り返し我々 に既報のペプチッドを割り当てる 10 のピークと未割り当てのままに 17 のピーク検出。ニューロキニン A、J、ペプチドおよびニューロキニン B 培養海馬神経細胞に起因しているに対しペプチド バソプレシン プロホルモンと secretogranin 2 から大細胞神経細胞に起因しています。このアプローチはセル特定プロホルモン処理の解明と細胞内情報伝達の発見できます。
付着細胞塊と成長の測定
そのような彼らの質量や剛性などの細胞の物理的性質の特性は、大きな関心を集めてきたと細胞生物学、組織工学、癌、疾患研究の深遠な意味を持つことができます。たとえば、個々の接着性のヒト細胞の細胞塊における細胞増殖速度の直接の依存性は、細胞周期の進行のメカニズムを解明することができます。ここでは、マイクロエレクトロメカニカルシステム（MEMS）を直接生物物理学的特性、質量、および単一接着細胞の増殖速度を測定するために使用することができます共鳴質量センサのアレイを開発しています。従来のカンチレバーの質量センサーとは異なり、当社のセンサーは、細胞接着面上に均一な質量感度を保持します。成長（ソフト）細胞および固定（硬い）細胞を用いた質量センサーの周波数シフトを測定することにより、分析モデリングを通して、我々は、不定セルのヤング率を導出し、セルの剛性のセル質量測定の依存性を解明する。最後に、我々は、質量センサー上の個々の細胞を成長し、50時間以上のため、その質量を測定した。我々の結果は、付着性ヒト結腸上皮細胞は大きな細胞塊で成長率を増加し、平均成長率が3.25％/ hrで、セルの質量に比例して増加することを示しています。位置に依存しない質量感度を持つ私たちの感度質量センサーは、細胞増殖およびステータスの同時モニタリングのための顕微鏡と結合し、細胞増殖、細胞周期の進行、分化、アポトーシスを研究する理想的な方法を提供することができます。
フーリエ変換光散乱法によるプローブ アクチン駆動細胞ダイナミクス。
我々 は、新しく開発したフーリエ変換光散乱 (FTLS) 時間を秒の時間スケールでの単一の生きているセルで動的光散乱による研究に適用。ナノスケール細胞のゆらぎとアクティブなアクチンの貢献をせずに測定しました。我々 は実験的 FTLS によってレンダリングされる時空信号グリア細胞 （神経系の優勢な細胞型) の興味深い細胞骨格ダイナミクスを明らかにすることを発見しました。アクチン細胞骨格の積極的な貢献は、アクチン重合・脱重合を阻害する薬物に対するサイトカラシン D を介して動的なプロパティを調節することによって得られました。
空間光干渉断層法 （スリット）。
空間光干渉断層撮影 (スリット) 透明な構造の生きているセルなどの 3 D イメージング無料のラベル法を提案する.スリット ブロード バンド フィールドを持つ干渉イメージングの原理を使用し、ミクロン スケールのコヒーレンス長と高開口の対物レンズのによる光ゲート動作を組み合わせた。位相シフトを測定フォーカスを変換するにはオブジェクトに関連付けられたマップは、屈折率と関連付けられている 3次元分布に関する完全な情報を提供します。生まれの近似に基づく再構成アルゴリズムを使用して、サンプルの構造は 3 D、複雑なフィールド デコンボリューションを介して回復可能性があることを示します。我々 は、微小球、フォトニック結晶、無染色細胞の再構成断層屈折率分布を持つメソッドを示しています。
パターン分析と文化のニューロンの空間分布
神経系細胞の複雑な、高度に秩序、統合されたネットワークです。ニューロンの分散培養は、無傷の神経系に内在する複雑させずに本質的な細胞機能の調査を可能にします。この培養プロセスでは、空間的にランダムであると仮定され均一に分散した人口を生成します。分散した神経細胞を利用した研究の膨大な数にもかかわらず、いくつかの研究は、in vitroで神経細胞の大集団の空間分布に対応しています。我々は、フッ素化シランを背景に並置ポリリジン接着（〜50μmのスポット）のパターン領域を定義するためにインクジェット印刷と表面化学を使用していました。我々は定量的に印刷されたタンパク質スポット上にパターニングされた神経細胞の集団を解析し、ニューロンをパターン化。マイクロアレイスキャナーを用いて、パターンととせずに大規模なパターンの画像（72ミリメートル×22ミリメートル）と、ニューロンを取得しました。高速フーリエ変換（FFT）画像解析、パターンにニューロンのグローバルアライメントを決定するために使用されていました。点パターン分析を通じて、私たちはとか、パターン基板、せずに分散したニューロンの空間的な組織を説明しました。パターン化されたニューロンは、無地のニューロンの空間分布の代表と、印刷パターンを彷彿とさせる空間的な組織の特性を示します。長い距離で発生したCSRへの適合性と短い距離で、最も顕著なのは、パターンと無地のニューロンの両方が完全な空間的なランダム性（同次ポアソン過程CSR）のヌルモデルからの脱却を示しています。彼らの無地の対応に比べ、携帯形態計測ショー、スポットパターンのニューロンは、平均樹の真円度の有意な増加（p <0.0001）と多くの円形のニューロン数の増加を示す。神経突起のトレースを通じて、我々は樹状突起にも非常にパターン化の分野に限定され、それらはパターンなしのニューロンの樹状突起よりも58パーセント短い平均であることを示している。我々の調査結果は、パターン領域は、培養神経細胞の細胞体と樹状突起の空間的な組織を変更することを示し、その伝統的な神経細胞の培養は、CSRから外れています。
