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Articles by Lauren P. Blair in JoVE
JoVE General
Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase
Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Arkansas for Medical Sciences
Wir stellen eine Methode für die Verwendung von MALDI-Massenspektrometrie und reduktive Methylierung Chemie auf Veränderungen in Lysinmethylierung quantifizieren.
Other articles by Lauren P. Blair on PubMed
Yng1 PHD Finger Bindung an H3 Trimethylated Am K4 Fördert NuA3 Hut-Aktivität Bei K14 H3 Und Transkription Auf Eine Teilmenge Der Gezielten ORFs
Posttranslationale Histon-Modifikationen beteiligt Modulation, die Struktur und Funktion des Chromatins. Förderer der transkribierten Gene werden mit K4 Trimethylation und Hyperacetylation auf der N-terminalen Schwanz Histon H3 bereichert. Kürzlich wurden PHD Finger Proteine, wie Yng1 in den NuA3 Hut Komplex, gezeigt für die Interaktion mit H3K4me3, Hinweis auf eine biochemische Verbindung zwischen K4-Methylierung und Hyperacetylation. Durch eine Kombination von Massenspektrometrie, Biochemie und NMR, ausführlich wir die Yng1 PHD-H3K4me3-Interaktion und die Bedeutung der NuA3-abhängige Acetylierung auf K14. Außerdem zeigt genomweiten ChIP-Chip-Analyse Kolokalisation von Yng1 und H3K4me3 in-vivo. Störung der K4me3-Bindung des Yng1 verändert, K14ac und Transkription am bestimmter Gene damit demonstrieren in-vivo Beweise für eine sequenzielle Trimethyl-Bindung, Acetyltransferase Aktivität und Genregulation durch NuA3. Unsere Daten unterstützen einen allgemeinen Mechanismus der transkriptionelle Kontrolle durch die Histon Acetylierung stromaufwärts der Genaktivierung teilweise durch die Verfügbarkeit von H3K4me3, "lesen", durch die Bindung von Modulen wählen Sie Verfügbare Unterseiten gefördert wird.
Entwicklung Und Evaluation Eines Strukturellen Modells Für SF1B Helicase Dda
Helikasen sind Proteine, die Double-Stranded Nukleinsäure zu entspannen. DDA Helicase aus Bakteriophage T4 diente als ein hervorragendes Modell für das Verständnis der molekularen Mechanismen dieser Klasse von Enzymen. Studie der Struktur der Dda kann zeigen, warum einige Helikasen in eine 5' bis 3' Richtung auf DNA, akkumulieren während andere in einer 3' bis 5' Richtung akkumulieren. Erreichung einer Struktur der Dda hat schwierig erwiesen, da das Protein nicht bereitwillig Form Kristalle und zu groß für aktuelle NMR-Technologien ist. Wir haben eine Homologie-Modell des Enzyms entwickelt, die dazu dienen, Studien zu führen, die die strukturelle und funktionelle Bedeutung der Interaktion zwischen Dda und DNA und ihre Auswirkungen dieser Interaktion Translokation und Abrollen von DNA zu untersuchen. Wir haben das strukturelle Modell getestet, mithilfe von Methoden für die Zuordnung von Protein-Gebiete und für die Prüfung von Protein-Oberflächen, die mit der DNA interagieren.
Ein Mitgliedattribut Bromodomain Im AAA-ATPase Protein Yta7 Leitet Chromosomalen Positionierung Und Barriere-Chromatin-Aktivität
Saccharomyces Cerevisiae Yta7 ist ein aktive Barriere-Protein, das in der Stille Paarung Locus, HMR transkriptionelle Bundesstaaten moduliert. Darüber hinaus Yta7 reguliert Histon-gen-Transkription und überlappende Funktionen mit bekannten Histon Chaperone hat. Diese Studie konzentrierte sich auf die funktionale Rolle der Mitgliedattribut Yta7 Bromodomain Entschlüsselung. Durch Verwendung von genetischen und Epistase Analysen zeigte die Yta7 Bromodomain für Barriere-Aktivität bei HMR erforderlich und überlappende Funktionen mit Histon-Regulatoren (Asf1 und Spt16). Kanonische Bromodomains können an Acetyliertes Lysin auf Histone binden; die Yta7 Bromodomain zeigte allerdings eine Vereinigung mit Histone, die unabhängig von posttranslationale Modifikation war. Weiterer Untersuchungen zeigten, dass Regionen des Yta7 als das Bromodomain Histon-Verband verliehen. Chromatin Immunopräzipitation-Chip-Analysen ergaben, dass die Yta7 Bromodomain nicht alleinverantwortlich für die Histon-Vereinigung war aber auch für richtige chromosomalen Positionierung des Yta7 notwendig. Diese Arbeit zeigt, dass die Yta7 Bromodomain Histone für bestimmte Zellfunktionen wie Barriere Chromatin Wartung und bestimmten Spt16/Asf1 zellulären Wege Chromatin-Verordnung beschäftigt.
MassSQUIRM: Ein Assay Für Die Quantitative Messung Von Lysin-Demethylase-Aktivität
In Eukaryoten DNA um Proteine genannt Histone gewickelt und wird in Chromatin kondensiert. Post-translationale Modifikation der Histone führt zu Veränderungen in der Genexpression. Eine der am meisten gut erforscht Histon Änderungen ist die Methylierung von Lysin 4 auf Histon H3 (H3K4). Diese Rückstände kann Mono-, di - oder Tri-methyliert und diese unterschiedlichen Methylierung-Staaten wurden mit verschiedenen Ebenen der Genexpression. Verstehen genau, was der Zweck dieser Methylierung-Staaten, in Bezug auf die Genexpression, ist ein Thema der viel Forschung in den letzten Jahren gewesen. Von besonderem Interesse sind Enzyme, die (Methyltransferasen) hinzufügen und entfernen (Demethylasen) können diese Änderungen. Die ersten Demethylase entdeckt, LSD1, ist die am meisten well-classified und hat verwickelt wurde, DNA Schäden Antwort Bildungswege zur menschlichen Krebserkrankungen beizutragen. Derzeit gibt es begrenzte Methoden für die Aktivität der Demethylasen in vitro noch in vivo genau zu studieren. In dieser Arbeit präsentieren wir Ihnen MassSQUIRM (massenspektrometrische Bestimmung mit Isotopen reduktive Methylierung), eine quantitative Methode zur Untersuchung der Tätigkeit der Demethylasen fähig Mono - und di-Methyl zu entfernen markiert von Lysin-Resten. Wir setzen speziell auf LSD1 aufgrund seines Potentials als therapeutische Zielscheibe für menschliche Krankheit. Diese quantitative Ansatz ermöglicht bessere Charakterisierung der Aktivität der LSD1 und andere Enzyme, die in-vitro, in vivo oder in Reaktion auf Inhibitoren ändern Chromatin.
Epigenetische Regulierung Durch Lysin-Demethylase 5 (KDM5) Enzyme Im Krebs
Ähnlich wie genetische Veränderungen, tragen epigenetische Aberrationen erheblich zur Tumor-Initiierung und Progression. In vielen Fällen werden diese Veränderungen verursacht durch Aktivierung oder Inaktivierung der Regulierungsbehörden, die epigenetische Staaten unterhalten. Hier überprüfen wir unsere aktuelle Kenntnisse über die KDM5/JARID1-Familie von Histon-Demethylasen. Diese Familie der Enzyme enthält eine JmjC-Domäne und kann Tri - und di-Methyl-Marken von Lysin 4 auf Histon H3 zu entfernen. Unter dieser Proteine vermittelt RBP2 Resistenzen, während JARID1B für Melanom-Wartung erforderlich ist. Präklinische Studien legen nahe, Hemmung dieser Enzyme deutlich Begründung für die Entwicklung von deren Inhibitoren für den Einsatz in der Krebstherapie bieten kann und Tumorentstehung unterdrücken.
Verlust Des Retinoblastom Verbindliches Protein 2 (RBP2) Unterdrückt Histon Demethylase Tumorentstehung in Mäusen Fehlt Rb1 Oder Men1
Aberrationen in epigenetische Prozesse wie Histon-Methylierung, können Krebs verursachen. Retinoblastom verbindliches Protein 2 (RBP2; auch genannt JARID1A oder KDM5A) können demethylate Tri- und Dimethylated Lysin 4 in Histon H3, die epigenetischen Markierungen für transcriptionally aktiv Chromatin sind, während die multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1)-Tumorsuppressor fördert H3K4 Methylierung. Frühere Studien vorgeschlagen, dass die Hemmung der RBP2 Tumor Unterdrückung durch das Retinoblastom-Protein (pRB) beigetragen. Hier zeigen wir, dass genetische Ablation des Rbp2 verringert die Tumorbildung und verlängert das Überleben bei Rb1(+/-) Mäusen und Men1-Genen Mäusen. Diese Studien link RBP2 Histon Demethylase Aktivität zu Tumorentstehung und RBP2 als mögliches Angriffsziel für Krebstherapie benennen.
