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Articles by Libo Shan in JoVE
JoVE General
农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默含量在棉花
1Department of Biochemistry and Biophysics, Institute of Plant Genomics and Biotechnology, Texas A&M University, 2Department of Plant Pathology and Microbiology, Institute of Plant Genomics and Biotechnology, Texas A&M University
我们目前为农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默（VIGS）棉花检测的详细协议。烟草脆裂病毒（TRV）派生的VIGS载体部署GrCLA1棉花，Cloroplastos alterados 1基因诱导RNA沉默。白化沉默GrCLA1引起的表型观察接种后2个星期内，在苗期。
Other articles by Libo Shan on PubMed
全基因组鉴定蛋白质的分泌 Hrp 类型三、 蛋白质分泌系统的野火光伏。番茄 DC3000。
野火的能力光伏。番茄 DC3000 要对植物的致病性取决于辣根过氧化物酶 （过敏反应和致病性） 类型三、 蛋白质分泌系统和它 translocates 进入植物细胞的效应蛋白质。通过迭代中的实验和计算技术的应用，DC3000 效应器库存大幅增加。已知的无毒 （Avr） 蛋白和效应的五名候选人，由基因编码与假定的横向收购，签名和 Hrp 者的五个同系物被证明文化中会分泌和/或再转移到拟南芥中辣根过氧化物酶相关的方式。这些 10 Hrp 依赖外蛋白质 （跃点） 被指定 （AvrPpiC2 同源) HopPtoC、 HopPtoD1 和 HopPtoD2 （AvrPphD 同源），HopPtoK （AvrRps4 同源)、 HopPtoJ (AvrXv3 同源)、 HopPtoE、 HopPtoG、 HopPtoH、 HopPtoI 和 HopPtoS1 (ADP ribosyltransferase 同源）。扩大旅游体育斑点病中的辣根过氧化物酶通路的蛋白的集合的分析显示，出口关联模式的等效溶剂暴露氨基酸中的 N-末端的 5 个职位，缺乏中第一次 12 个职位，Asp 或 Glu 残留和 amphipathicity 50 第一次担任职务。这些特征被用来搜索的未完成的 DC3000 基因组，产生效应基因的预测与辣根过氧化物酶出口信号蛋白和还具有签名的横向收购的 32 名候选人。其中包括额外的 ADP ribosyltransferases、 同系物的分区域渔业委员会 (中沙门氏菌力的候选人效应）、 过氧化氢酶、 葡萄糖激酶基因。一个 ADP ribosyltransferase 和分区域渔业委员会同系物和测试所示，会分泌以辣根过氧化物酶依赖的方式。这些蛋白质，指定的 HopPtoS2 和 HopPtoL，分别为 22 带来 DC3000 辣根过氧化物酶分泌蛋白库存。
取力器表达诱导水杨酸独立细胞死亡，但抑制番茄植株中的水杨酸虚所致的坏死性病变。
超量表达疾病抗性基因专利商标局 （35S::Pto） 展览自发的番茄植株细胞死亡，水杨酸酸 (SA) 的积累提升与发病有关的基因的表达和增强抗性范围广泛的病原体。水杨酸在许多病变坏死突变体的细胞死亡和防御活化中发挥着重要作用，因为我们调查过程之间的相互作用介导 SA 和介导 35S::Pto 通过引入编码水杨酸羟化酶的 nahG 转基因防卫。在这里，我们显示 SA 不需要激活 35S::Pto 显微细胞死亡和扮演小的防御基因活化作用和一般植物抗病性 35S::Pto。相比之下，温度大大影响的自发性细胞死亡和 35S::Pto 植物，一般电阻和高温抑制细胞死亡。NahG 番茄植株发展叶子上自发的、 不受约束的坏死性病变。这些病变也由野火强毒株接种光伏。番茄。但是，依赖于 NahG 的坏死性病变均 NahG/35S::Pto 植物有抑制作用。此抑制作用最为显著偏好条件下 35S::Pto 介导自发性细胞死亡发展。这些结果表明由取力器表达激活的信号通路抑制细胞的损伤而导致的 SA 枯竭。我们还发现，乙烯是可有可无的 35S::Pto 介导一般防御。
HopPtoF 的野火的轨迹 Pv。番茄 DC3000 编码类型三、 伴侣和同源的效应。
类型三、 分泌系统是高度保守的革兰阴性植物和动物致病性细菌。三、 分泌系统类型，通过细菌注入宿主细胞的毒蛋白的数量。野火的全基因组序列分析光伏。番茄 DC3000 应变确定轨迹，命名为 HopPtoF，这是同源的无毒基因轨迹 avrPphF 体育斑点病在光伏。phaseolicola。HopPtoF 轨迹港口两个基因，ShcF(Pto) 和 HopF(Pto)，前面有一单 hrp 框启动子。我们目前在这里的证据显示 ShcF(Pto) 和 HopF(Pto) 编码类型三、 伴侣和同源的效应，分别。ShcF(Pto) 与交互和稳定 HopF(Pto) 蛋白在细菌细胞中。HopF(Pto) 翻译起价罕见启动密码子 ATA，限制低水平在细菌细胞中 HopF(Pto) 蛋白的合成。
野火光伏。番茄 DC3000 类型三、 效应器 HopF2 已假定 Myristoylation 站点所需的其无毒和毒力的职能。
在野火 HopPtoF 轨迹 pv。番茄 DC3000 港口两个基因，ShcF 和 HopF2 （以前名为 ShcF(Pto) 和 HopF(Pto))，编码类型三、 伴侣和同源效应蛋白，分别。HopF2 基因有罕见的启动密码子，据说只有在线粒体基因功能的 ATA。在这里，我们报告的 DC3000 本机 HopPtoF 轨迹赋予烟草 W38 植物，无毒功能指示 ATA 启动子指导合成的功能效应。然而，HopF2 DC3000 基因组中的中断并没有改变番茄植株中细菌的毒力。HopPtoF 轨迹显示可衡量的毒力活动在体育斑点病两株光伏。番茄 ATA 启动密码子时改为 ATG，和这种变化也升高 W38 植物无毒功能。HopF2 包含一个假定 myristoylation 站点。突变分析表明此站点是细胞膜本地化和毒力和无毒的 HopF2 活动所必需的。
特定细菌抑制 MAMP 信号的 MAPKKK 在拟南芥天然免疫中上游。
植物和动物拥有先天免疫系统，以防止感染，有效地为大多数潜在病原体的"nonhosts"。非寄主植物免疫分子机制至今还不清楚。在拟南芥中非寄主/病源野火支撑但致病性体育斑点抑制早期 MAMP (微生物相关分子模式） 标记基因激活。我们执行基于细胞的遗传屏幕的毒力因子和确定为早期防御基因转录和地图激酶 （MAPK） 信号的烈性和独特的抑制器的 AvrPto 和 AvrPtoB。不同哺乳动物病原体的效应器，AvrPto 和 AvrPtoB 拦截多个 MAMP 介导信号在等离子膜上游的 MAPKKK 链接到受体。转基因拟南芥，AvrPto 块早期 MAMP 信号，并使非体育寄主斑点生长。删除 avrPto 和 avrPtoB 从致病性体育斑点病减少其毒性。研究揭示了 MAMP 信号非寄主免疫和致病性细菌从类型 III 效应器新型行动中的基本作用。
利用原生质体研究固有免疫反应。
植物原生质体瞬间表达系统的使用促进了发现和夹层动脉瘤的许多信号转导通路在激素、 代谢产物和应力的响应。最近，拟南芥原生质体也已用于成功研究植物固有免疫反应触发源性病原体的诱导。在这里，我们描述的详细研究固有免疫反应，包括细胞死亡和早期防御基因调控激活的病原相关分子模式、 诱导子及细菌类型 III 效应器在拟南芥原生质体中的两种类型的协议。这个基于单元格的系统简化了复杂的病原体-植物相互作用对纯个人信号和同步单元格自主作出反应。这种新方法的应用提供了高时空分辨率，以加强我们的病原相关分子模式-和细菌类型三效应激活免疫反应在分子和细胞水平的不同和重叠信号事件的理解。
启发式和抑制微生物相关分子模式触发免疫的微生物-植物相互作用。
最近的研究发现了引人入胜的基本动态协同进化的微生物-植物相互作用的分子机制。动物，如检测到的常见病原体或微生物相关分子模式 （PAMPs/MAMPs) 立即触发主要植物先天免疫。不同的 MAMPs 模式识别不同细胞表面受体 (PRRs) 人们往往和激活植物细胞的广谱免疫收敛胞内信号转导。然而，成功的病原体，已经形成多个毒力因子，以制止 MAMP 触发的免疫。具体地说，各种致病性细菌有雇用类型三、 分泌系统提供汇辑 》 的毒力效应蛋白与宿主免疫干预和促进发病机制。受到病原体的植物形成了辅助植物先天免疫。尤其是，一些植物拥有特定的细胞内疾病电阻 (R) 蛋白质，可有效地打击效应触发免疫病原体的毒力产生影响的手段。此强大但特定品种的效应触发免疫与本地化程序性的细胞死亡/过敏反应限制病原扩散和疾病发展迅速发生。引人注目的是，细菌进一步获得了毒力产生影响的手段来阻止效应触发的免疫功能。这项检讨的致病细菌的毒力因子涉及 MAMP 触发免疫的动态和其截获的最新成果。
由细菌类型 III 效应器拦截主机 MAPK 信号转导叶栅。
进化保持的地图激酶 （MAPK） 叶栅在植物和动物天然免疫中发挥重要作用。最近的爆炸式增长的研究已经发现了大量的致病细菌用于拦截 MAPK 信号通过不同类型 III 效应器注入宿主细胞的毒力战略。在这里，我们检讨的最新文献和讨论的致病细菌使用操作主机 MAPK 信号转导叶栅的各种机制。
假单胞菌斑点病类型三、 效应器 AvrRpt2 改变了拟南芥南芥生长素生理。
假单胞菌斑点病类型三、 效应器 AvrRpt2 促进细菌的毒性，对拟南芥南芥植物缺乏功能的 RPS2 基因 (rps2 突变植物)。若要调查基础 AvrRpt2 的毒力活性的机制，我们审查了转基因 A.南芥 rps2 苗一表示 AvrRpt2 的表型。这些幼苗展示表型的 A.南芥突变体改变的生长素的生理机能，包括更长的主根、 侧根和外源生长素对增加的敏感性的增多让人想起。他们还增加了免费的吲哚乙酸 (IAA) 的水平。AvrRpt2 的存在也与相关免费 IAA 水平进一步增加体育斑点病感染期间光伏。番茄应变 DC3000 (PstDC3000)。这些结果表明 AvrRpt2 改变 A.南芥生长素生理。生长素模拟 1 naphthaleneacetic 酸的应用促进 PstDC3000 感染的植物，建议在宿主组织内的高架的生长素水平促进 PstDC3000 毒病症状发展。因此，AvrRpt2 可调节主机生长素生理促进疾病的毒力因素的体育斑点病。
细菌产生影响的手段的目标共同的信号伙伴 BAK1 破坏多个 MAMP 受体信号转导复合物，阻碍植物免疫。
成功的病原体产生干扰宿主免疫系统的战略。例如，无处不在植物病原野火注入产生影响的两个序列不同手段，AvrPto 和 AvrPtoB，拦截收敛固有免疫反应的刺激的多个微生物相关分子模式 (MAMPs)。然而，直接主机目标和精确的细菌产生的分子机制仍很大程度上模糊。我们显示 AvrPto 和 AvrPtoB 绑定拟南芥受体样激酶 BAK1，鞭毛蛋白受体 FLS2 和油菜受体 BRI1 的共享信号合作伙伴。此目标干扰期间感染 FLS2 BAK1 与配体依赖的协会。它也阻碍了 BAK1 依赖宿主免疫反应的不同其他 MAMPs 和油菜信号。重要的是，似乎有别于 AvrPto 取力器协会所需的效应引发的免疫 AvrPto BAK1 相互作用的结构基础。这些研究结果揭示细菌毒力产生影响的手段，阻止通过共同的一个关键组成部分的多个 MAMP 受体复合物的信号传输的发病机理独特的策略。
一个用于所有： BAK1 受体相关激酶。
BAK1/SERK3 已被确定为富含亮氨酸的配体结合的一个合作伙伴的植物受体激酶重复受体激酶，特别是油菜受体 BRI1 和免疫受体 FLS2。BAK1 积极规范通过物理相互作用和 transphosphorylation BRI1 受体功能。自 2001 年其第一次描述，几个独立的团体已经发现 BAK1/SERK3 作为不同的流程，包括油菜信号、 光反应、 细胞死亡和植物先天免疫的一个组成部分。在这里，我们可以总结当前知识 BAK1 功能汇辑 》，并讨论如何能集成其多种功能、 受体配合物可能如何形成和如何可能确定特异性。
受体胞质激酶，BIK1，将与复杂到启动植物天然免疫鞭毛蛋白受体相关联。
植物和动物依靠先天免疫预防感染的微生物相关分子模式 (MAMPs) 通过模式识别受体 (PRRs) 检测。PRR FLS2，富亮氨酸重复受体激酶、 植物识别细菌鞭毛蛋白和启动免疫信号由协会与另一个富亮氨酸重复样受体蛋白激酶，BAK1。它仍然是未知如何复杂的 FLS2/BAK1 受体激活细胞内的信号转导叶栅。在这里我们发现受体样胞质激酶迅速磷酸化后鞭毛蛋白感知，根据 FLS2 和 BAK1 的 BIK1。BIK1 将与 FLS2 和 BAK1 体内和体外的关联。BIK1 由 BAK1，磷酸化和 BIK1 也直接 phosphorylates BAK1 与 FLS2 体外。要求其磷酸化在 BAK1 和 FLS2，暗示 BIK1 很可能首先磷酸化后鞭毛蛋白感知和随后 transphosphorylates FLS2/BAK1 传播鞭毛蛋白信号转导鞭毛蛋白磷酸化网站 Thr(237) BIK1。重要的是，bik1 突变体就受到了多样化的鞭毛蛋白介导反应和病源细菌感染的免疫功能。因此，BIK1 是在 MAMP 信号转导，链接到下游的细胞内信号转导的复杂的 MAMP 受体的重要组成部分。
通过经传感器蛋白激酶信号差天然免疫。
天然免疫表示诱导防御微生物感染的植物和动物的第一行。在这两个王国，病原体或微生物相关的分子模式识别 （PAMPs 或 MAMPs，分别)，如鞭毛蛋白、 涉及丝裂素活化蛋白激酶 (MAPK) 级联同修收敛信号转导和全球的转录变化，提高免疫力。虽然经长期被公认为基本和保守的主调解员在植物防御反应中，如何感觉到和中继到早期 MAMP 信号经信号是未知的。使用功能基因组屏幕和全基因组基因表达谱，在这里我们显示的四个钙依赖蛋白激酶 (CDPKs) Ca(2+) 传感器蛋白激酶在植物先天免疫信号转录重编程的关键。意外的是，CDPKs 和 MAPK 将法 》 在四个 MAMP 介导规章程序来控制早期基因参与国防肽和代谢产物、 细胞壁的修改和氧化还原信号合成的差异层叠。转录组配置文件比较表明 CDPKs 的信号触发的大多数 MAMPs 收敛点。双、 三和四人间 cpk 突变体显示逐步减弱氧化爆裂和植物基因活化诱导 22-氨基酸肽 flg22，以及破坏病原体辩护。与钙调蛋白和钙调素激活转录因子在植物防御中的负面作用，本研究报告揭示了经信号复杂性和演示关键积极角色的特定 CDPKs 在初始 MAMP 信号。
由细菌鞭毛蛋白受体胞质激酶的磷酸化。
先天免疫，防止感染的植物和动物的根本区别自我和非自我的分子机制。识别的守恒的微生物组件触发对广泛的潜在病原体的免疫反应。在拟南芥中细菌鞭毛蛋白被认为富亮氨酸重复样受体蛋白激酶 FLS2 (希-RLK)。后鞭毛蛋白感知 FLS2 形成另一个令 RLK BAK1 与复杂。胞内信号转导下游的事件 FLS2/BAK1 受体复杂却仍然不甚了解。我们最近发现了一种受体胞质激酶 (RLCK) 启动植物天然免疫到复杂的鞭毛蛋白受体相关联的 BIK1。BIK1 是迅速磷酸化后鞭毛蛋白感知 FLS2 和 BAK1 依赖的方式。BAK1 直接与体外激酶测定 phosphorylates BIK1。植物形成了一大批 RLCK 基因所涉及的范围广泛的生物过程。我们提供的证据在这里额外的 RLCKs 也可以由鞭毛蛋白磷酸化和可能在植物先天免疫中发挥与 BIK1 的冗余作用。
细菌产生影响的手段目标 BAK1 关联受体配合物： 一石两鸟。
主机和微生物的长期关系产生了一些最复杂的关系。主机-微生物相互作用的分子机制研究泄露了很多有趣的故事。在这里我们放大特定主题的相互作用问题细菌产生影响的手段和植物天然免疫信号之间。尤其是，我们会总结一下我们最近发现细菌效应蛋白，AvrPto 和 AvrPtoB，目标植物免疫信号受体复合物干扰宿主免疫反应和发展。
细菌效应器 HopF2 取消拟南芥天然免疫在细胞质膜。
许多细菌病原体鸡尾酒效应蛋白注入宿主细胞通过类型 III 分泌系统。这些产生影响的手段行事音乐会调节宿主生理及免疫信号，从而促进致病性。在搜索中抑制植物先天免疫病原体或微生物相关分子模式 （PAMPs 或 MAMPs） 由触发额外假单胞菌斑点效应器，我们确定体育斑点病番茄 DC3000 效应器 HopF2 为烈性早期免疫反应基因转录抑制因子，由多个 MAMPs，包括细菌鞭毛蛋白、 断裂伸长率因素杜、 肽聚糖、 脂多糖和 HrpZ1 过敏素丝裂素活化蛋白激酶 (MAPK) 信号激活和真菌甲壳素。守恒的表面暴露的残留物 HopF2 对其 MAMP 制止活动至关重要。HopF2 针对通过假定的 myristoylation 网站，植物细胞质膜和膜协会似乎是其 MAMP 抑制功能需要。HopF2 在植物中的表达先天减少致鞭毛蛋白磷酸化的 BIK1，迅速磷酸化后鞭毛蛋白感知后一分钟内细胞膜相关胞质激酶。因此，HopF2 可能会截取 MAMP 信号在细胞膜立即信号感知。符合多个 MAMP 信号的强效抑制功能，HopF2 在转基因植物中的表达受到损害植物非寄主免疫斑点病细菌体育向光伏。Necrotrophic 病原真菌灰霉病的 Phaseolicola 和植物免疫。
沉默 GhNDR1 和 GhMKK2 的妥协棉花抗黄萎病。
棉花是世界各地的重要经济作物，纤维、 饲料、 食品、 石油、 生物燃料产品的一个重要来源。提高可持续的产量和质量通过分子育种和基因工程研究棉花新品种，已花费了相当大的努力。鉴于最近的全基因组序列的棉花，有必要制定分子工具和大规模的全基因组水平上的基因功能分析的资源。我们成功地开发了几个棉花品种不同遗传背景与农杆菌介导病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 测定。感兴趣的基因是先天和容易压制苗期接种后 2 周内。重要的是，我们表明沉默 GhNDR1 和 GhMKK2 受到棉花抗感染真菌病原黄萎病棉花黄萎病。此外，我们发展棉花原生质体系统的瞬态基因表达来研究基因功能的增益的函数方法。可行的原生质体分离到绿色子叶、 黄化的子叶和真叶，并回答了广泛的病原体诱导和激素。引人注目的是，棉花植物拥有保守，但也不同，地图激酶激活与拟南芥后诱导细菌鞭毛蛋白感知。因此，使用基因沉默化验，我们已表明 GhNDR1 和 GhMKK2 所需的抗黄萎病棉花，并制定了棉花功能基因组学研究的高吞吐量损失的函数和增益的函数检测方法。
模式识别受体 FLS2 直接泛抑制植物先天免疫。
固有免疫反应均由活化的模式识别受体 (PRRs) 触发。遥感拟南芥 PRR 鞭毛蛋白-2 (FLS2) 感官细菌鞭毛蛋白和启动免疫信号通过 BAK1 与关联。基础的衰减 FLS2 激活的分子机制有很大程度上未知。我们报告的鞭毛蛋白诱导两个密切相关 U 框 E3 泛素连接酶，PUB12 和 PUB13，FLS2 受体复杂在拟南芥中招聘。BAK1 phosphorylates PUB12 和 PUB13，并且需要为 FLS2-PUB12/13 协会。PUB12 和 PUB13 polyubiquitinate FLS2 和促进鞭毛蛋白诱导 FLS2 退化，并显示的 pub12 和 pub13 突变体提升到鞭毛蛋白治疗的免疫反应。我们的研究结果表明直接泛的独特的规管电路和营业额 FLS2 BAK1 介导磷酸化和招聘的具体 E3 连接酶免疫信号衰减。
