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Articles by Linda Lefievre in JoVE
JoVE General
Techniques d'imagerie Ca 2 + Signalisation dans le sperme humain
1School of Biosciences, University of Birmingham, 2School of Medicine, University of Birmingham, 3Centre for Human Reproductive Science, Birmingham Women’s Hospital
Stimulation évoqués [Ca
Other articles by Linda Lefievre on PubMed
Augmentation Du CAMP à La Levée De La Saisie De La Prophase Dans Des Ovocytes De Mactre
Mactre (Spisula solidissima) ovocytes fraient à la prophase, j'ai l'étape de la méiose, et ils restent arrêtées à ce stade jusqu'à la fécondation. Reprise de la méiose ovocyte complet, témoigne tout d'abord de ventilation vésicule germinale (GVBD), peut-être être induit par les activateurs artificielles imitant le sperme, comme k haute ou la sérotonine. Les rapports précédents ont indiqué que les traitements pensaient pour augmenter le niveau des ovocytes cAMP inhibé sperme - ou induite par la sérotonine, mais pas induite par le KCl, administrées dans des ovocytes de palourde. Ces observations s'étendent l'exigence bien connue d'une goutte dans l'ovocyte taux d'AMPc dans les mammifères, soutien et amphibiens ou étoile de mer ovocytes estime qu'une telle baisse est universellement important tout au long du règne animal. Nous avons réexaminé la dépendance cAMP d'administrées dans des ovocytes de palourde et constaté que divers traitements qui augmentent les taux d'AMPc ovocyte n'affectent pas, étonnamment, soit KCl sérotonine induite ou administrées. De tels traitements, cependant, inhibent administrées après insémination des ovocytes, mais c'était en raison de l'échec du sperme de fusible/pénétrer les ovocytes ; ainsi, il n'était pas une inhibition de l'activation ovocytaire comme tel. Les mesures directes d'ovocyte cAMP niveaux après activation par la sérotonine, KCl ou sperme a montré que, contrairement aux attentes, il y a une hausse des taux d'AMPc avant GVBD. À l'aide de SQ22536, un inhibiteur de l'adénylyl cyclase, l'augmentation de niveau cAMP ovocyte n'a pu en partie et administrées a procédé, mais avec un retard considérable, ce qui indique que le cAMP normal rise facilite GVBD. Notre travail met en lumière la diversité des voies en amont, conduisant à l'activation du MPF et fournit un modèle unique, auquel cas le début de la reprise de la méiose est associé à une augmentation, non pas une diminution, taux d'AMPc ovocyte.
Présence De Nucléotides Cycliques Phosphodiestérases PDE1A, Existant En Tant Qu'un Complexe Avec La Calmoduline Et PDE3A Dans Les Spermatozoïdes Humains Stable
La motilité des spermatozoïdes chez les mammifères, capacitation et la réaction acrosomique sont régies par des systèmes de transduction de signal impliquant le cAMP comme un second messager. Taux d'AMPc sont contrôlés par deux enzymes-clés, l'adénylcyclase et phosphodiestérases (PDE), ce dernier étant impliquée dans la dégradation de l'AMPc. PDE de la calmoduline-dépendante (PDE1) et activités cAMP-PDE (PDE4) ont déjà été identifiées dans les spermatozoïdes grâce à l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques. Nous rapportons ici qu'EDP de sperme humain est associés avec la membrane plasmique (50 % - 60 %), ainsi qu'avec la fraction particulaire (30 % - 50 %) et ont plus d'affinité pour le cAMP de cGMP. Données immunocytochimiques indiquent que la PDE1A, une variante de la PDE1, est localisée sur le segment équatorial de la tête des spermatozoïdes, ainsi que sur les pièces moyennes et principales du flagelle, et que PDE3A se trouve sur la partie postacrosomal de la tête du spermatozoïde. Immunobuvardage ont confirmé la présence des isoformes de PDE1A et PDE3A dans les spermatozoïdes. Milrinone, un inhibiteur de la PDE3, augmente la concentration intracellulaire d'AMPc d'environ 15 % mais n'affecte pas fonctions de sperme, peut-être parce que la PDE3 représente seulement une petite proportion de l'activité PDE totale de spermatozoïdes (10 % et 25 % dans les fractions solubles et particulaires de Triton X-100, respectivement). Activité PDE1A dans l'extrait de sperme entier ou après que purification partielle par chromatographie échangeuse d'anions n'a pas été stimulée par le calcium + calmoduline. Les résultats obtenus par électrophorèse en conditions natives a indiqué que la calmoduline est intimement liée à PDE1A. L'incubation avec l'EGTA + EDTA, trifluopérazine ou l'urée ne pas dissocier le complexe PDE1A-calmoduline. Ces résultats suggèrent que la PDE1A est définitivement activé dans les spermatozoïdes humains.
Activation De La Protéine Kinase A, Au Cours De La Réaction D'acrosome Et De Capacitation Des Spermatozoïdes Humains
Les spermatozoïdes subissent différentes modifications au cours de leur vie qui sont indispensables à leur maturation et leur capacité à féconder les œufs. Capacitation des spermatozoïdes chez les mammifères et la réaction acrosomique sont régies par des systèmes de transduction de signal impliquant l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un second messager. Ce second messager agit par l'intermédiaire de l'activation de la protéine kinase A (PKA) et réglemente indirectement la phosphorylation de tyrosine des protéines. taux d'AMPc sont contrôlés par la prépondérance des phosphodiestérases (PDE) et les activités enzymatiques de l'adénylate cyclase (AC), qui sont responsables de sa dégradation et de la production, respectivement. Le but de cette étude était d'évaluer la relation possible entre les taux intracellulaires d'AMPc et PDE et PKA des activités au cours de la réaction acrosomique induite par l'ionophore calcique A23187 et de capacitation des spermatozoïdes humains induite par ultrafiltrat de sérum foetal de cordon (FSCC). Les auteurs rapportent qu'activité PKA était plus élevée chez les permettre que dans les spermatozoïdes noncapacitating et diminution de la concentration intracellulaire d'AMPc, mais cette activité de PDE est demeurée constante au cours de la capacitation. La réaction acrosomique induite par l'A23187 a été associée à des augmentations dans le cAMP et l'activité de la PKA, mais pas dans l'activité de PDE. Ces résultats suggèrent fortement que la concentration d'AMPc nette est sous le contrôle de l'AC, étant donné que l'activité de PDE est constante au cours de la capacitation des spermatozoïdes et la réaction acrosomique. En outre, les résultats suggèrent que les faibles niveaux de cAMP sont suffisantes pour capacitation et activation PKA et/ou que la concentration d'AMPc mesurée dans les spermatozoïdes entiers ne reflète pas les taux d'AMPc intracellulaire efficaces présents dans des milieux spécifiques de ces cellules.
Approches Physiologiques Et Protéomique à étudier Les Faits Dans Le Prefertilization Humaines
Cette recherche vise d'abord à comprendre, en termes moléculaires et cellulaires, comment un spermatozoïde humain mature est prêt pour la fécondation, et d'autre part, d'identifier quels sont les facteurs impliqués dans les interactions initiales de signalisation entre l'œuf et le spermatozoïde. Afin d'atteindre ces objectifs, une combinaison d'approches est utilisée, y compris une seule cellule d'imagerie, patch clamp et de la protéomique. Simple-imagerie cellulaire révèle la complexité et l'hétérogénéité cachée dans la signalisation des réponses dans les spermatozoïdes. Caractérisation de la physiologie cellulaire au niveau unicellulaire doit être un objectif futur, y compris l'étude de l'expression des canaux ioniques et de la fonction par patch-clamp. Expériences protéomiques visent à identifier les défauts dans l'expression des protéines dans les sous-groupes spécifiques d'hommes, par exemple ceux qui globozoospermia. Une meilleure compréhension des événements prefertilization permettra le développement de la non-thérapie assistée par la reproduction, la drogue à base de traitements pour l'infertilité masculine.
Implication Du CAMP Au Cours De La Phosphorylation De Sperme Porcin Capacitation Et Protéine De Tyrosine
Seconds messagers sont impliqués dans les spermatozoïdes féconder potentiel, que tant la motilité et la réaction de l'acrosome sont influencées par le cAMP. En outre, l'activité des nucléotides cycliques est impliquée dans l'apparition des protéines de tyrosine phosphorylée de sperme, qui est associé de capacitation dans les spermatozoïdes chez les mammifères. Néanmoins, l'implication de la cAMP/protéine kinase une voie (PK-A) au cours de la capacitation des spermatozoïdes de porc peut être différente de celle observée chez les autres mammifères. La présente étude visait à clarifier la voie cAMP/PK-A au cours de la capacitation des spermatozoïdes porcins et d'évaluer cet impact sur l'apparence de phosphoprotéine p32 sperme tyrosine. La présence de la p32 a été évaluée après incubation de sperme de porc frais avec IBMX/db-cAMP, H-89, un inhibiteur de la PK-A ou bistyrphostin, un inhibiteur de kinase de tyrosine, dans des conditions de non-PFNL (NCM) par des protéines extraites à l'aide de SDS et séparés des spermatozoïdes immunoblotting utilisant un anticorps anti-phosphotyrosine ou responsabilisation (CM). Lorsque les spermatozoïdes de porc sont incubés en CM additionné de H-89 (50 microM) ou bistyrphostin (1,2 microM), capacitation diminue significativement (P < 0,001). La phosphoprotéine de tyrosine de sperme p32, montrée précédemment de s'associer à la capacitation des spermatozoïdes porcin, bien que pas nécessairement un point de terminaison de ce phénomène, n'est pas modulée par IBMX/db-cAMP (100 microM/1 mM), H-89 (50 microM) ni bistyrphostin (1,2 microM). Par conséquent, nos résultats indiquent que sperme de porcs est réglementés un peu différemment que comme pour les autres mammifères, parce que bien que les voies de cAMP/PK-A et de la tyrosine kinase sont impliqués dans la capacitation, ils n'affectent pas l'apparence de la p32.
Utilisation De Phosphoprotéomique Pour étudier L'activité De La Tyrosine Kinase Dans Permettre à Sperme De Verrat. Activité De La Kinase Et Capacitation
Il est généralement admis que capacitation des spermatozoïdes est associée à la protéine kinase induite par A apparence des phosphoprotéines tyrosine, bien que les substrats et les kinase(s) concernés n'ont pas été identifiés. Nous avons décrit une phosphoprotéine 32 000 M. de tyrosine, « p32 », figurant dans le sperme porcin qui coïncide avec la capacitation. Nous avons également découvert une enzyme de type kinase de tyrosine dans le sperme de verrat de M. 32 000 ("TK-32") avec l'augmentation de l'activité au cours de capacitation. Cette étude a été menée pour mieux caractériser et d'identifier ces ou des protéines de la capacitation. Sperme de porc fraîche ont été incubé pour induire la capacitation puis immunoprécipitation, immunotransfert et protéomique de l'analyse a révélé sept protéines phosphorylées de tyrosine dans la gamme de Mr 30 000 avec différents pH isoélectrique (pI). Par conséquent, p32 peut être composé de plusieurs phosphoprotéines de tyrosine. Trois ont été identifiés comme liant l'acrosine sp32 (pI 6,5) et deux triosephosphate isomérase isoformes (pI 7.1 et 7,9). À l'heure actuelle, cependant, proteonomic l'analyse n'a révélé aucune kinase à 32 000 M.. Expériences d'immunoprécipitation montrent que p32 et TK-32 sont des molécules différentes, comme toujours l'activité TK-32 dans le surnageant des antiphosphotyrosine précipités. Enfin, l'immunotransfert et renaturation de dans-gel suggèrent que TK-32 est une kinase de la protéine mitogène (MAPK). La découverte de p32 et la MAPK ressemblant TK-32 offre nouvel éclairage sur les mécanismes de responsabilisation chez le porc.
Pompes Ca(2+)-ATPase (SPCA1) Ca(2) + Voie De Sécrétion, Pas SERCAs, Réglementent Le Complexe [Ca(2+)](i) Des Signaux Dans Les Spermatozoïdes Humains
Le réticulum sarcoplasmique-endoplasmique Ca(2+)-ATPase (SERCA) inhibiteurs de la thapsigargine (0,1-1 microM) et l'acide cyclopiazonique (10 microM), n'a pas affecté au repos [Ca(2+)] dans les spermatozoïdes humains. Lent induite par la progestérone [Ca (2 + i)](i) oscillations dans les spermatozoïdes humains, qui impliquent la vidange-remplissage cyclique d'un magasin de Ca(2+) intracellulaire sont également insensibles à ces inhibiteurs. Doses non sélectif de l'élévation de la thapsigargine 5.30 microM (50 à 300 fois la dose saturante d'inhibition SERCA) causé de repos [Ca(2+)](i) et rupture partielle, dose-dépendante des oscillations. Une concentration de microM 10-40 de bis (2-hydroxy-3-tert-butyl-5-methyl-phenyl) méthane (bis-phénol), qui inhibe les deux sensibles à la thapsigargine et - insensible ATPases microsomique de Ca(2+), provoqué l'élévation de repos [Ca(2+)](i) et inhibition de [Ca(2+)](i) oscillations à des doses compatibles avec inhibition de l'ATPase thapsigargine résistant, microsomique. et libération de Ca(2+) stockées Faibles doses du bis-phénol avaient marqué effets sur [Ca(2+)](i) oscillation cinétique. Application du médicament aux cellules préalablement stimulées avec progestérone ont eu des effets très semblables à ceux observés lorsqu'il a été appliqué aux cellules non stimulées, ce qui suggère que l'afflux de Ca(2+) soutenue induite par la progestérone n'est pas véhiculé par mobilisation des magasins Ca(2+). Western Blot pour les protéines de sperme humain ont montré une expression de la voie de sécrétion Ca(2+) ATPase (SPCA1). Immunolocalisation études révèlent l'expression de SPCA1 dans toutes les cellules dans une zone située derrière le noyau, qui s'étend dans la pièce. Coloration pour SERCA, menée en parallèle, ne détecté aucune expression avec chaque technique. Nous concluons que: (1) du point de vente Ca(2+) intracellulaire et dépendante du magasin [Ca(2+)](i) oscillations dans les spermatozoïdes humains s'appuient principalement sur une pompe thapsigargine/cyclopiazonique insensible à l'acide Ca(2+), qui n'est pas un SERCA se caractérise dans les cellules somatiques ; (2) les effets des fortes doses thapsigargine sur spermatozoïdes reflètent principalement des actions non spécifique sur la non-SERCAs et ; (3) voie de la sécrétion Ca(2+) ATPases contribuent au moins une partie de cette activité non - SERCA Ca(2+) de la pompe.
Comptage Des Spermatozoïdes Ne Tient Pas Debout Plus: Le Temps D'une Nouvelle équation?
Bien que la dysfonction du sperme est la cause la plus fréquente de l'infertilité, nous avons des méthodes de diagnostic et pauvres étonnamment pas de traitement efficace (à l'exclusion des techniques de reproduction assistée). Dans cette revue, nous remettons en question l'utilité d'une analyse du sperme de base et font valoir qu'un nouveau paradigme est nécessaire immédiatement. Nous discutons de l'utilisation de dépistage à domicile pour potentiellement améliorer le diagnostic du mâle et de rationaliser la gestion du couple sous-fertiles. En outre, nous décrivons les progrès récents dans le domaine, par exemple, en protéomique, ce qui permettra le développement de nouveaux biomarqueurs de la fonction des spermatozoïdes. Cette nouvelle connaissance va transformer notre compréhension du spermatozoïde comme une machine et est susceptible de conduire à la non-ART traitements pour les hommes atteints de dysfonction du sperme.
Les Spermatozoïdes Humains Contiennent Plusieurs Cibles Pour La Protéine S-nitrosylation : Un Mécanisme Alternatif De La Modulation De La Fonction Spermatique Par L'oxyde Nitrique ?
L'oxyde nitrique (non) améliore la motilité des spermatozoïdes humains et capacitation associée à la phosphorylation de la protéine accrue. N'active guanylyl cyclase soluble, mais peut également modifier la fonction de protéine par covalence via S-nitrosylation de la cystéine. Fait remarquable, ce mécanisme demeure inexploré en sperme bien qu'elles dépendent de la modification post-traductionnelle de protéines pour produire des changements dans la fonction requise pour la fécondation. Notre objectif était d'identifier des cibles pour S-nitrosylation dans le sperme humain. Les spermatozoïdes ont été incubées avec aucun des donateurs et S-nitrosylés protéines ont été identifiées à l'aide de l'essai de commutateur de biotine et une approche protéomique en utilisant MS/MS. 240 S-nitrosylés protéines ont été détectés dans le sperme incubées avec le glutathion-S-nitroso. Des taux minimaux ont été observés en glutathion ou échantillons non traités. Protéines identifiées de manière cohérente basée sur plusieurs peptides cibles établis inclus S-nitrosylation dans d'autres cellules par exemple tubuline, TPS et HSP mais également nouvelles cibles, y compris la kinase-a ancrage (AKAP) types 3 et 4, voltage-dépendants canal anionique sélective protéine 3 et semenogelin 1 et 2. Localisation in situe a révélé S-nitrosylés cibles sur la région postacrosomal de la tête et tout au long du flagelle. Des cibles potentielles pour S-nitrosylation dans le sperme humain comprennent des protéines physiologiquement significatives non signalés auparavant dans d'autres cellules. Leur identification fournira de nouveaux mieux comprendre le mécanisme d'action du NO dans les spermatozoïdes.
Mobilisation Du Calcium Stocké Dans La Région Du Cou Du Sperme Humain--un Mécanisme De Régulation De L'activité Flagellaire
Signalisation calcique joue un rôle central dans la physiologie de sperme, étant intimement impliquée dans la régulation de la réaction de l'acrosome, chimiotactisme et hyperactivation. Ici, nous décrivons brièvement les mécanismes de régulation du calcium dans les cellules somatiques et les façons dont ces mécanismes ont été adaptées pour fonctionner dans les spermatozoïdes matures. Nous considérons ensuite les données récentes de ceci et d'autres laboratoires sur les réponses de sperme à trois composés : progestérone et monoxyde d'azote (les deux produits de l'oophorus cumulus) et 4-aminopyridine. Tous ces composés induisent les signaux calciques dans la région de tête et du cou de sperme postérieur et, lorsqu'il est appliqué à des concentrations appropriées, modifier l'activité flagellaire, provoquant la déformation asymétrique du flagelle proximal. Nous croyons que ces effets reflètent un mode commun d'action, mobilisation du calcium stocké dans la région de cou de sperme. Enfin, nous considérons la nature du calcium dans le sperme, les voies de signalisation. Nous suggérons que cela hautement spécialisée et cellule extrêmement polarisé, bien que travaillant avec le calcium même signalisation « outils » que ceux des cellules somatiques, emploie pour générer des signaux de calcium anormalement « câblé » qui n'agissent pas pour intégrer des stimuli. « Fuite » entre ces calcium signalisation des voies vont générer des réactions inappropriées, de compromettre le fonctionnement de la cellule.
Mobilisation Des Réserves De Ca2 + Et Règlement Flagellaire Dans Le Sperme Humain Par S-nitrosylation : Un Rôle Pour Non Synthétisée Dans L'appareil Reproducteur Féminin
Génération de NO par l'oxyde nitrique synthase (NOS) est impliquée dans la fertilisation et l'interaction de gamètes. L'exposition des spermatozoïdes humains à aucun donateurs provoqué mobilisation de Ca(2+) stockées par un mécanisme qui ne nécessitait pas d'activation de la guanylate cyclase, mais a été imité par le S-nitroso-glutathion (GNSO ; un agent S-nitrosylating). Application de dithiothréitol, pour réduire les groupes SNO - protéine, inversée rapidement les actions du non et le GNSO sur [Ca(2+)](i). Les effets de NO, le GNSO et le dithiothréitol sur la protéine S-nitrosylation, évaluée à l'aide de la méthode de commutateur de biotine, de sperme parallèlement étroitement leurs actions sur [Ca(2+)](i). Immunofluorescence a révélé NOS constitutives et inductibles dans l'oviducte humaine et cumulus (la couche cellulaire investir l'ovocyte). 4, 5-diaminofluorescéine (DAF) coloration a démontré la production de NO par ces tissus. L'incubation de sperme humain avec des explants oviducte induite par la protéine S-nitrosylation ressemblant à celle induite par aucun des donateurs et le GNSO de sperme. Progestérone (un produit de cellules du cumulus) mobilise également Ca(2+) stockée dans le sperme humain. Prétraitement du sperme non a grandement amélioré l'effet de la progestérone sur [Ca(2+)](i), résultant en une augmentation prolongée des excursion flagellaire. Nous concluons que non réglemente la mobilisation de Ca(2+) stockée dans le sperme humain par la protéine S-nitrosylation, que cette action est synergique avec celui de la progestérone et que cette synergie est potentiellement très important dans les interactions de gamètes conduisant à la fécondation.
Ca2 +-stocke Dans Le Sperme : Leurs Identités Et Leurs Fonctions
Les réserves de Ca2 + intracellulaires jouent un rôle central dans la régulation des systèmes cellulaires [Ca2+](i) et la génération de signaux complexes [Ca2 +] comme les oscillations et ondes. Signalisation du Ca2 + est d'une importance particulière dans les spermatozoïdes, où c'est un régulateur central dans de nombreuses activités clés (y compris la capacitation, hyperactivation, réaction de chimiotactisme et acrosome) mais manquent de spermatozoïdes matures du réticulum endoplasmique et plusieurs autres organites qui servent de Ca2 + stocke dans les cellules somatiques. Nous résumons ici, i) le témoignage de l'expression dans le sperme des composants moléculaires (pompes et canaux) qui sont fonctionnellement importants dans l'activité des réserves de Ca2 + des cellules somatiques et ii) la preuve de l'existence de réserves de Ca2 + fonctionnelles dans le sperme. Cette preuve appuie l'existence d'au moins deux organites de stockage dans des spermatozoïdes chez les mammifères, l'un dans la région acrosomique et un autre dans la région du cou de sperme et bien. Nous passons ensuite à discuter l'identité probable de ces organites et leurs fonctions discrètes : règlement de l'acrosome, de sa propre sécrétion et le règlement par des organites membraneuses au niveau du col de sperme (et éventuellement par les mitochondries) d'activité flagellaire et hyperactivation. Enfin, nous considérons la capacité des spermatozoïdes discrètement à contrôler l'interaction fonctionnelle du stockée Ca2 + dans le cou de sperme/pièce avec chaînes CatSper dans la pièce principale dans la réglementation de l'activité des spermatozoïdes chez les mammifères et la mobilisation de ces magasins.
Communication Entre L'appareil Femelle Et Le Sperme : Non Disant * Quand Vous Voulez Dire Oui
Signalisation à travers [Ca(2+)](i) est au centre de régulation de l'activité de sperme et est susceptible d'être le mécanisme qui transduit de signaux provenant de l'appareil reproducteur féminin pour réguler la motilité des spermatozoïdes. Dans une récente paper1 que nous a montré qu'exposition des spermatozoïdes à l'oxyde nitrique mobilise Ca(2+) stockée dans le sperme humain, un effet qui se produit par le biais de nitrosylation de thiols protéiques. Nous n'avons pas seulement trouvé que non * production par les cellules du tractus femelle humain serait suffisante pour obtenir cet effet, mais la progestérone, qui est également présent dans l'appareil féminin et est synthétisé par les vêtements de l'ovocyte, a agi en synergie avec non * Ca(2+) de mobiliser et renforcer les battements flagellaires. Ici, nous croyons qu'un magasin de Ca(2+) à la jonction de la tête du spermatozoïde et le flagelle est assujettie à la réglementation de la progestérone et non * et que les récepteurs de la ryanodine au magasin peuvent être le moment à quelle coïncidence de détection et l'interaction synergique se produit.
