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In JoVE (4)
- Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung
- Protokoll für Mosquito Aufzucht (A. gambiae)
- Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung
- Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)
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Articles by Lindsey Garver in JoVE
JoVE General
Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung
Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University
Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für die Dengue-Virus identifiziert ist, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung virale Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Dengue-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für den Anbau bis das Virus in Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.
JoVE General
Protokoll für Mosquito Aufzucht (A. gambiae)
Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University
Dieses Video zeigt den allgemeinen Techniken verwendet, um hinten Anopheles gambiae im Labor. Die Methoden für die Pflege Labor Mücken sind in allen Phasen des Organismus Lebenszyklus von Larven zu Blut-Fütterung Erwachsene Puppen gezeigt.
JoVE General
Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung
Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University
Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für Malaria identifiziert wird, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung Plasmodium-Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Plasmodium-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für die Vorbereitung der gametocyte Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.
JoVE General
Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)
Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University
Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.
Other articles by Lindsey Garver on PubMed
Das Peptidoglycan Anerkennung Protein PGRP-SC1a Unbedingt Toll Signalisierung Und Phagozytose Von Staphylococcus Aureus in Drosophila
Von einem forward genetischen Bildschirm für Phagozytose Mutanten in Drosophila Melanogaster, ermittelten wir eine Mutation, die Peptidoglycan Anerkennung Protein (PGRP) betrifft SC1a und beeinträchtigt die Fähigkeit, die Bakterien Staphylococcus Aureus, aber nicht Escherichia coli und Bacillus Subtilis phagocytose. Aufgrund der unterschiedlichen Peptidoglycan-Peptid-Verbindungen in diese Bakterien zufolge unsere Daten PGRP-SC1a für Anerkennung der Lys-Typ Peptidoglycane, die typisch für die meisten Gram(+) Bakterien notwendig. PGRP-SC1a Mutanten auch nicht die Maut/NF-KappaB-Signalweg aktivieren und für das Überleben nach S. Aureus-Infektion gefährdet sind. Diese Mutante Phänotyp ist das erste gefunden für ein N-Acetylmuramoyl-l-Alanin Amidase PGRP, die Peptidoglycan an die Lactylamide-Bindung zwischen den Glykan-Rückgrat und die Vernetzung Vorbau Peptide spaltet. Durch Generierung von transgenen Rettung-fliegen, die entweder Wildtyp oder eine noncatalytic Cystein-Serin-Mutante PGRP-SC1a express, finden wir, dass PGRP-SC1a Amidase Aktivität nicht notwendig für die Maut zu signalisieren ist, aber wesentlich für die Aufnahme von S. Aureus in der Host-Fresszellen und Überleben nach dem S. Aureus-Infektion ist. Darüber hinaus finden wir, dass die PGRP-SC1a Amidase Aktivität ersetzt werden kann, durch exogene Zugabe von freien Peptidoglycane, darauf hindeutet, dass die Anwesenheit von Peptidoglycan Zerfallsprodukte wichtiger ist als die Generation der gespalten Peptidoglycan auf der bakteriellen Oberfläche für PGRP-SC1a Phagozytose vermittelt.
Beteiligung Der Gonadale Steroide Und Gamma-Interferon in Geschlecht-Unterschiede in Der Reaktion Auf Blut-Bühne-Malaria-Infektion
Um die hormonellen und immunologischen Mechanismen zu untersuchen, die Geschlecht-Unterschiede in der Anfälligkeit für Malaria-Infektion, intakt und Gonadectomized (Gdx) vermitteln C57BL/6 Mäusen mit Plasmodium Chabaudi AS-infizierten Erythrozyten geimpft wurden, und die Antworten auf eine Infektion überwacht wurden. Neben reduzierten Sterblichkeit wiegen intakte Weibchen erholt, induziert durch Infektion schneller als intakte Männer Verlust und Anämie. Ausdruck-Microarrays und Echtzeit-reverse Transkription-PCR ergab, dass gonadally intakt Frauen im höheren Ausdruck von Interleukin-10 (IL-10), IL-15Ralpha IL-12Rbeta, Gadd45gamma, Gamma-Interferon (IFN-Gamma), CCL3, CXCL10, CCR5 und mehrere IFN-inducible Gene in weißen Blutkörperchen ausgestellt und mehr IFN-Gamma produziert als intakte Männchen und Weibchen der Gdx, mit diesen unterschieden wird am deutlichsten während der Spitze Parasitemia. Intakte Weibchen hatte auch höhere Anti-P. Chabaudi Immunglobulin G (IgG) und IgG1 Antworten als intakt männliche oder weibliche Gdx. Um die Effektor-Mechanismen, die Vermittlung von Geschlecht-Unterschiede in der Reaktion auf p-Chabaudi-Infektion weiter zu untersuchen, wurden Antworten auf eine Infektion unter den männlichen und weiblichen Wildtyp (WT), T-Zelle-defizienten verglichen (TCRbetadelta-/-), B-Zelle-Mangel (MicroMT), kombiniert, T - und B-Zelle-Defizienz (RAG1) und IFN-Gamma-ko (IFN - Gamma-/-) Mäuse. Männer waren 3,5 mal häufiger von Malaria-Infektion als Weibchen, mit diesen unterschieden wird zwischen den TCRbetadelta - am ausgeprägtesten sterben /-, MicroMT, und RAG1 Mäuse. Männliche Mäuse stellte auch schwerer Gewichtsverlust, Anämie, und Unterkühlung und höhere Gipfel Parasitemia als Weibchen während der Infektion, mit WT, RAG1, TCRbetadelta-/-, und MicroMT-Mäuse, die den meisten ausstellenden ausgeprägter Geschlechtsdimorphismus. Das Fehlen von IFN-Gamma reduziert den Geschlechts-Unterschied in der Sterblichkeit und war mehr schädlich für Weibchen als Männchen. Diese Daten legen nahe, dass differentielle Transkription und Übersetzung von IFN-Gamma, die durch Östrogene beeinflusst, Geschlecht-Unterschiede in der Reaktion auf Malaria vermitteln können.
Regulierung Der Sexuellen Entwicklung Von Plasmodium Von Translational Repression
Translational Unterdrückung der Messenger-RNAs (mRNAs) spielt eine wichtige Rolle bei der sexuellen Differenzierung und Gametogenese bei mehrzelligen Eukaryoten. Translational Repression und mRNA Umsatz wurden gezeigt, Bühne-spezifische Genexpression in der Protozoen Plasmodium zu beeinflussen. Die DDX6-Klasse RNA-Helicase, DOZI (Entwicklung der Zygote gehemmt), findet in einem Komplex mit mRNA-Spezies in zytoplasmatischen Gremien des weiblichen, Blut-Bühne Gametocytes. Diese translationally verdrängten komplexe werden normalerweise für die Übersetzung nach der Befruchtung gespeichert. Genetische Störung des Pbdozi hemmt die Bildung der komplexe-Gebiets- und stattdessen mindestens 370 Transkripte umgeleitet werden ein Abbau-Weg.
Immunoglobulin-Superfamilie-Mitglieder Spielen Eine Wichtige Rolle Im Immunsystem Moskito
Immunoglobulin-Superfamilie (IgSF)-Proteine sind bekannt für ihre Fähigkeit zu spezifisch erkennen und anderen Molekülen, Vermittlung Zelloberfläche Rezeption und Krankheitserreger Anerkennung einzuhalten. IgSF Säugetierproteine wie Antikörper gehören zu den am besten charakterisiert Molekülen des Immunsystems; im Gegensatz dazu ist die Einbeziehung der Wirbellosen IgSF Mitglieder in Immunität nicht weitgehend studiert worden. Analyse von den vorhergesagten Anopheles Gambiae Transkriptom identifiziert 138 Proteine, die mindestens eine Immunglobulin-Domäne haben. Herausforderung mit Plasmodium, Gram-negative oder Gram-positive Bakterien führte zu erheblichen Verordnung 85 IgSF-Gene, die angibt, mögliche Rollen für diese Moleküle in Antworten Infektion und Immunität. Anhand der Sequenz und Ausdruck Daten wurden sechs Infektion-responsive mit Immunglobulin-Domäne (IRID 1-6)-Gene ausgewählt und funktional charakterisiert in Bezug auf ihre Rolle in der angeborenen Immunität. Rückseite-genetische gen-silencing Proben zeigte IRID3, IRID5 und IRID6 tragen zur Lebensfähigkeit bei bakteriellen Infektionen, während IRID4 und IRID6 für die Begrenzung von Plasmodium Falciparum Infektion beteiligt sind.
Herausforderungen Und Ansätze Für Moskito Gezielte Bekämpfung Der Malaria
Malaria ist eine der heutigen schwersten Krankheiten mit enormen sozio-ökonomischen Auswirkungen. Während Malariamedikamente seit einiger Zeit bereits und Impfstoffe Entwicklung wäre im Gange, die erfolgreichsten Malaria-Beseitigung, die Programme bisher, am Angriff auf den Mücke Vektor verlassen haben verbreitet, die den Krankheit verursachen Agent Plasmodium. Hier werden wir prüfen, Vergangenheit, aktuelle und zukünftige Perspektiven der Malaria Vektor Kontrollstrategien und wie diese Ansätze viel versprechende Dank jüngste Fortschritte in der funktionellen Genomik und Molekularbiologie gewendet haben.
Caspar Steuert Widerstand Gegen Plasmodium Falciparum in Diversen Anopheline Arten
Immunantworten durch den Vektor der Malaria Anopheles Gambiae montiert werden weitgehend durch die Maut und Imd (Immunschwäche) Wege über die Transkriptionsfaktoren NF-KappaB Rel1 und Rel2, die von den negativen Regulierungsbehörden Kaktus und Caspar, bzw. kontrolliert werden geregelt. Rel1 und Rel2-abhängige Transkription in A. Gambiae hat sich besonders kritisch auf die Moskito-Funktionen zum Verwalten von Infektion mit dem Nagetier Malaria Parasit Plasmodium Berghei werden gezeigt. Die negativen Regulatoren der diese Wege zum Abbau mit RNA-Interferenz, fanden wir, dass Rel2 Widerstand von A. Gambiae, die menschliche Malaria Parasit Plasmodium Falciparum, steuert während Rel 1 Aktivierung Infektion verringert. Die universelle Relevanz dieses Abwehrsystem Anopheles-Arten wurde von zeigt, dass Caspar zum Schweigen brachte auch die Entwicklung von p. Falciparum in die wichtigsten Malaria-Vektoren, Asien und Südamerika, A. Stephensi und A. Albimanus, verhindert bzw. gegründet. Parallele Untersuchungen zufolge Imd Stoffwechselweg Aktivierung am effektivsten gegen p. Falciparum ist die Maut-Pathway effizienteste gegen p. Berghei, Hervorhebung eine erhebliche Diskrepanz zwischen der menschlichen Erreger und seine Nagetier-Modell zwar. Hochdurchsatz identifizierte-Gen Ausdruck eine Vielzahl von Genen, die durch die Aktivierung der beiden Rel Faktoren geregelt und ergab, dass die Maut-Pathway ein vielfältiger Moskito Biologie als die Imd-Pathway, Rolle die mehr Immunität-spezifische war. Weitere Analysen der anti-Plasmodium Schlüsselfaktoren empfehlen, dass sie für das Imd-Weg-vermittelten Resistenz-Phänotyp verantwortlich sein können. Darüber hinaus fanden wir, dass die Eignung Kosten verursacht durch Rel2 Aktivierung durch Caspar gen-silencing nachweisbar in Zucker gefüttert, Blut gefüttert und p. Falciparum infizierten weiblichen A. Gambiae, während Aktivierung von der Maut-Pathway Rel1 einen großen Einfluss hatte. Diese Studie beschreibt zum ersten Mal ein einzelnes Gen, das eine Immunsystems beeinflusst, die Entwicklung von p. Falciparum Anopheline Arten abbrechen kann. Diese Studie geht weiter, Aspekte der Molekularbiologie, evolutionären und physiologischen Folgen der beobachteten Phänotyp. Diese Erkenntnisse haben Auswirkungen auf die Bekämpfung der Malaria, da Breitspektrum immun-Aktivierung in diversen Anopheline Arten einen lebensfähigen und strategischen Ansatz bietet um neuartige Malaria Control-Methoden weltweit zu entwickeln.
Mosquito Immunabwehr Gegen Plasmodium-Infektion
Der Erreger der Malaria, Plasmodium, muss komplexe Entwicklungsstörungen Übergänge zu unterziehen und Überleben Angriffe aus der Mücke angeborene Immune System zur Übertragung von einem Host zum anderen durch den Vektor zu erreichen. Hier diskutieren wir aktuelle Erkenntnisse über die Rolle der der Moskito angeborene immun Signalwege in Prävention von Infektionen durch Plasmodium-Parasiten, die Ermittlung und mechanistische Beschreibung der neuartigen Parasite Moleküle, die Rolle, die natürliche Bakterien in die Moskito Mitteldarm hegte spielen könnte, in diese Immunabwehr und die entscheidenden Parasit und Vektor-Moleküle, die Mitteldarm Infektion zu vermitteln.
Universal Sind Posttranskriptionale Genregulation Entscheidend Für Plasmodium Zygote Entwicklung
Eine universelle Funktion indem sexuelle Entwicklung ist die Generation der Eizelle P-Granulate, die bestimmte Arten der mRNA von der Übersetzung bis Codierung für Proteine während der frühen post-fertilization Entwicklung geben zurückzuhalten. Stabilisierung der translationally Ruhezustand mRNA-Pools in weiblichen Plasmodium Gametocytes hängt von der RNA-Helicase DOZI, aber die molekulare Maschinerie der Unterdrückung der Transkripte in diese Protozoen beteiligt ist unbekannt. Mit Affinitätsreinigung gepaart mit massenspektrometrische Analyse identifizieren wir ein Bote-Gebiets-(mRNP) von Plasmodium Berghei Gametocytes DOZI und der Sm-ähnlichen Faktor CITH festgelegten (Homolog des Wurms Auto-ich und Fliege Trailer Hitch). Diese mRNP umfasst 16 wichtige Faktoren, einschließlich Proteine mit Homologien zu Komponenten indem P-Granulat und Archaea Proteine. Mit translationally Stille Abschriften, diese mRNP integriert eIF4E und Poly (A)-schließt P Körper RNA-Abbau-Faktoren und Übersetzung-Einleitung zur Förderung eIF4G aber verbindliches Protein. Gen Löschung Mutanten 2 Kernkomponenten von diesem mRNP (DOZI und CITH) Befruchtung-zuständig sind, aber Zygoten nicht in Ookinetes in einer weiblichen Gametocyte-Mutant-Mode zu entwickeln. Durch RNA-Immunopräzipitation und globale Ausdruck geliefert die Profilerstellung CITH-KO-Mutanten, die wir CITH als ein entscheidender Verdränger von Maternal hervorheben mRNAs. Unsere Daten definieren Plasmodium P Granulat als eine antike mRNP deren Protein-Kern aus einzelligen Organismen zu Keimzellen von mehrzelligen Tieren und Läden translationally Stille mRNAs, die entscheidend für die frühen post-fertilization Entwicklung in der Anfangsphase der Moskito-Infektion sind evolutionär konservierte geblieben ist. Daher kann translational Repression Alleen als Ziel für die Generation der Übertragung blockieren Strategien bieten und dazu beitragen, die Ausbreitung von Malaria zu begrenzen.
