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- Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección
- Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)
- Protocolo de infecciones por Plasmodium falciparum en la determinación de fenotipo mosquitos y la infección
- Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)
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Articles by Lindsey Garver in JoVE
JoVE General
Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección
Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University
Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistente a los virus del dengue, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones virales en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de infecciones de dengue de los mosquitos pueden ser analizados. Las técnicas para el cultivo de los virus en la cultura, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.
JoVE General
Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)
Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University
Este video muestra las técnicas generales utilizadas para criar Anopheles gambiae en el laboratorio. Los métodos para el cuidado de los mosquitos de laboratorio se ha demostrado en todas las etapas del ciclo de vida del organismo a partir de larvas a pupas a los adultos se alimentan de sangre.
JoVE General
Protocolo de infecciones por Plasmodium falciparum en la determinación de fenotipo mosquitos y la infección
Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University
Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistentes a la malaria, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones por Plasmodium en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de la infección por Plasmodium de mosquitos se puede probar. Las técnicas para la preparación del cultivo de gametocitos, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.
JoVE General
Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)
Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University
Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.
Other articles by Lindsey Garver on PubMed
La Proteína De Reconocimiento De Peptidoglicano PGRP-SC1a Es Esencial Para La Señalización De Peaje Y Fagocitosis De Staphylococcus Aureus En Drosophila
Desde una pantalla genética hacia adelante para mutantes de fagocitosis en Drosophila melanogaster, identificamos una mutación que afecta a la proteína de reconocimiento de peptidoglicano (PGRP) SC1a y deteriora la capacidad de fagocitar la bacteria Staphylococcus aureus, pero no de Escherichia coli y Bacillus subtilis. Debido a las diferencias en los vínculos de péptido de peptidoglicano en estas bacterias, nuestros datos sugieren que la PGRP-SC1a es necesario para el reconocimiento del peptidoglicano Lys-tipo típico de la mayoría de las bacterias Gram(+). PGRP-SC1a mutantes también capaces de activar la vía de señalización de llamada/NF-kappaB y están en peligro para la supervivencia después de la infección por S. aureus. Este fenotipo mutante es el primero para una Amidasa de N-acetylmuramoyl-l-alanina PGRP que hiende peptidoglicano en el lazo de lactylamide entre la columna vertebral de glicanos y los péptidos de tallo de reticulación. Por generación moscas de rescate transgénicas que expresan un mutante de cisteína-serina noncatalytic PGRP-SC1a o salvaje-tipo, encontramos que no es necesario para la señalización de peaje PGRP-SC1a Amidasa actividad, pero es esencial para la absorción de S. aureus en los fagocitos del anfitrión y de supervivencia después de la infección por S. aureus. Además, encontramos que la actividad de la Amidasa de PGRP-SC1a puede sustituirse por adición exógena de peptidoglicano gratis, sugiriendo que la presencia de productos de peptidoglicano escote es más importante que la generación de peptidoglicano hendida en la superficie bacteriana para PGRP-SC1a mediada por fagocitosis.
Participación De Esteroides Gonadales Y El Interferón Gamma En Diferencias De Sexo En Respuesta a La Infección Por Paludismo Estadio En Sangre
Para examinar los mecanismos hormonales e inmunológicos que median diferencias de sexo en la susceptibilidad a la infección por paludismo, intacta y gonadectomized (gdx) inocularon ratones C57BL/6 con eritrocitos de AS-infectados de Plasmodium chabaudi, y se monitorearon las respuestas a la infección. Además de la disminución de la mortalidad, hembras intactas recuperadas de inducida por infección pesan pérdida y anemia más rápido que los machos intactos. Microarrays de expresión y transcripción reversa-PCR en tiempo real revelaron que las hembras gonadally intactas exhibieron mayor expresión de Interleucina-10 (IL-10), IL-15Ralpha, IL-12Rbeta, Gadd45gamma, interferón gamma (IFN-gamma), CCL3, CXCL10, CCR5 y varios genes IFN-inducible en glóbulos blancos y producción más IFN-gamma que hicieron intactos machos y hembras de gdx, con estas diferencias, siendo más pronunciadas durante el pico parasitemia. Las hembras intactas también tenían mayor anti-P. chabaudi inmunoglobulina G (IgG) y respuestas IgG1 que gdx hembras o machos intactos. Para seguir examinando los mecanismos efectores mediar diferencias de sexo en respuesta a la infección por p. chabaudi, se compararon las respuestas a la infección entre macho y hembra tipo salvaje (WT), T-celular-deficientes (TCRbetadelta-/-), B-célula-deficientes (microMT), combinada T y B-célula-deficientes (RAG1) y nocaut de IFN-gamma (IFN - gamma-/-) ratones. Los varones eran 3,5 veces más propensos a morir de la infección del paludismo que las hembras, con estas diferencias, siendo más pronunciadas entre TCRbetadelta-/-, microMT y ratones RAG1. Ratones machos también exhibieron más severa pérdida de peso, anemia e hipotermia y parasitemia de pico mayor que las hembras durante la infección, con peso, RAG1, TCRbetadelta-/-, y microMT ratones exhibiendo más pronuncian dimorfismo sexual. La ausencia de IFN-gamma redujo la diferencia de sexo en la mortalidad y fue más perjudicial para las hembras que los machos. Estos datos sugieren que el diferencial transcripción y traducción de IFN-gamma, que es influenciado por estrógenos, pueden mediar diferencias de sexo en respuesta a la malaria.
Reglamento De Desarrollo Sexual De Plasmodium Por La Represión Traslacional
La represión de traducción del ARN mensajero (ARNm) juega un papel importante en la diferenciación sexual y la gametogénesis en los eucariotas multicelulares. La represión de traducción y la rotación de ARNm se demostró que influyen en la etapa específica de la expresión génica en el protozoo Plasmodium. El DDX6 clase RNA helicasa, Dozi (inhibe el desarrollo de cigoto), se encuentra en un complejo con especies de ARNm en el citoplasma de los cuerpos femeninos, el estadio en sangre gametocitos. Estos complejos reprimidos translationally normalmente se almacenan para su traducción después de la fecundación. Disrupción genética de pbdozi inhibe la formación de los complejos de ribonucleoproteína, y en su lugar, por lo menos 370 transcripciones se desvían a una vía de degradación.
Los Miembros De Inmunoglobulina Superfamilia Juegan Un Papel Importante En El Sistema Inmune Del Mosquito
Inmunoglobulina superfamilia (IgSF) las proteínas son conocidos por su capacidad de reconocer específicamente y se adhieran a otras moléculas, mediando la superficie celular de recepción y reconocimiento de patógenos. Proteínas de mamíferos IgSF tales como anticuerpos se encuentran entre las mejores moléculas caracterizadas del sistema inmune, en cambio, la implicación de los miembros de invertebrados IgSF en la inmunidad no ha sido ampliamente estudiado. Análisis de la predicha transcriptoma Anopheles gambiae identificado 138 proteínas que tienen al menos un dominio de inmunoglobulina. Desafío con Plasmodium, las bacterias Gram-negativas o Gram-positivas como resultado de la regulación significativa de 85 genes IgSF, lo que indica posibles funciones de estas moléculas en las respuestas de la infección y la inmunidad. Sobre la base de datos de la secuencia y la expresión, seis de respuesta de infección con el dominio de inmunoglobulina (IRID 1-6) genes fueron seleccionados y caracterizados funcionalmente con respecto a su papel en la inmunidad innata. Genética inversa silenciamiento de genes ensayos mostraron IRID3, IRID5 IRID6 y contribuir a la viabilidad a la infección bacteriana, mientras que IRID4 y IRID6 están implicados en la limitación de infección por Plasmodium falciparum.
Retos Y Enfoques Para El Control De Mosquito De La Malaria Dirigida
La malaria es una de las enfermedades más graves de hoy en día con un impacto socioeconómico enorme. Mientras que medicamentos contra la malaria existen desde hace algún tiempo y el desarrollo de las vacunas pueden estar en marcha, los programas más exitosos de erradicación de la malaria hasta la fecha han confiado en atacar el mosquito vector que propaga la enfermedad que causa el agente Plasmodium. Aquí vamos a examinar las perspectivas del pasado, presente y futuro de las estrategias de control de la malaria vector y cómo estos enfoques han dado un giro prometedor gracias a los recientes avances en genómica funcional y biología molecular.
Gaspar Controla La Resistencia a Plasmodium Falciparum En Diversas Especies De Anofelinos
Las respuestas inmunitarias montadas por el vector de la malaria Anopheles gambiae se encuentran reguladas por el peaje y el IMD (vías de inmunodeficiencia humana) a través de los factores de transcripción NF-kappaB y REL1 REL2, que son controlados por los reguladores negativos de Cactus y Gaspar, respectivamente. REL1 y REL2 dependiente de transcripción en A. gambiae ha demostrado ser particularmente crítica para la capacidad del mosquito para tratar la infección con el roedor parásito de la malaria Plasmodium berghei. Uso de la interferencia de ARN para agotar los reguladores negativos de estas vías, se encontró que REL2 controles de resistencia de A. gambiae para el ser humano parásito Plasmodium falciparum, mientras que REL 1 los niveles de infección de activación reducidos. La importancia universal de este sistema de defensa en todas las especies de Anopheles se estableció demostrando que Gaspar silenciamiento también previene el desarrollo de P. falciparum en los principales vectores de malaria de Asia y América del Sur, A. stephensi y A. albimanus, respectivamente. Estudios paralelos sugieren que mientras que la activación Imd vía es más eficaz contra el P. falciparum, la vía de peaje es más eficaz contra P. berghei, poniendo de relieve una discrepancia importante entre el patógeno humano y su modelo de roedores. Alto rendimiento análisis de expresión génica identificó un gran número de genes regulados por la activación de los dos factores Rel y reveló que la vía de peaje desempeñado un papel más diversa en la biología del mosquito que la vía de IMD, que era más la inmunidad específica. Otros análisis de los principales anti-Plasmodium factores sugieren que puede ser responsable del fenotipo de resistencia Imd vía mediada. Además, se encontró que el costo físico causado por la activación a través de Gaspar REL2 silenciamiento génico era indetectable en el azúcar de temporal, la sangre de la Fed, y por P. falciparum-hembra infectada A. gambiae, mientras que la activación de la vía de peaje REL1 tuvo un impacto importante. Este estudio describe por primera vez un solo gen que influye en un mecanismo inmunológico que es capaz de abortar el desarrollo de P. falciparum en especies anofelinos. Además, este estudio aborda los aspectos de las consecuencias moleculares, evolutivos y fisiológicos del fenotipo observado. Estos hallazgos tienen implicaciones para el control de la malaria desde el amplio espectro de activación inmune en diversas especies de anofelinos ofrece un enfoque viable y estratégica para desarrollar nuevos métodos de control de la malaria en todo el mundo.
Mosquito Defensas Inmunitarias Contra La Infección Por Plasmodium
El agente causal de la malaria, el Plasmodium, tiene que someterse a complejas transiciones en el desarrollo y sobrevivir a los ataques del sistema inmune innato de los mosquitos para lograr la transmisión de un host a otro a través del vector. Aquí hablamos de los recientes descubrimientos sobre el papel de la inmunidad innata del mosquito vías de señalización en la prevención de la infección por el parásito Plasmodium, la identificación y descripción mecanicista de nuevos antiparasitarios moléculas, el papel que las bacterias naturales que contienen en el intestino medio del mosquito podría desempeñar en este inmunológico la defensa y el parásito y las moléculas clave de vectores que mediar la infección del intestino medio.
Características Universales De La Regulación Génica Post-transcripcional Son Fundamentales Para El Desarrollo De Plasmodium Zygote
Una característica universal del desarrollo sexual de los metazoos es la generación de gránulos P ovocitos que retener ciertas especies de mRNA de la traducción para proporcionar potencial de la codificación de proteínas durante los primeros meses después de la fertilización de desarrollo. Estabilización de las piscinas de ARNm en traslación en reposo en las mujeres gametocitos de Plasmodium depende de la Dozi RNA helicasa, pero la maquinaria molecular implicada en el silenciamiento de las transcripciones de estos protozoarios es desconocida. Uso de purificación por afinidad, junto con el análisis por espectrometría de masas se identifica una ribonucleoproteína mensajero (mRNP) de Plasmodium berghei gametocitos definidos por Dozi y el factor de CITH Sm-al igual que (homólogo del gusano de CAR-I y volar Enganche de Remolque). Este mRNP incluye 16 factores más importantes, incluyendo las proteínas con homología a los componentes de metazoos gránulos P y proteínas archaeal. Que contiene transcripciones de traslación en silencio, esta mRNP integra eIF4E y poli (A) de unión a proteínas del cuerpo, pero excluye de P factores de degradación del ARN y la traducción de iniciación eIF4G promoción. Genes mutantes de deleción de 2 componentes principales de este mRNP (Dozi y CITH) son la fertilización-competente, pero no los cigotos se desarrollan en ookinetes en una mujer de gametocitos mutante de la moda. A través de ARN-inmunoprecipitación y perfiles de expresión global de CITH-KO mutantes destacamos CITH como un represor importante de los ARNm de la madre suministra. Nuestros datos definen Plasmodium gránulos P como mRNP antigua cuya proteína del núcleo se ha mantenido conservado evolutivamente desde organismos unicelulares a las células germinales de los animales multicelulares y tiendas translationally mRNAs silenciosos que son críticos para principios de desarrollo después de la fertilización durante las etapas iniciales de los mosquitos infección. Por lo tanto, la represión de traducción pueden ofrecer avenidas como un objetivo para la generación de estrategias que bloqueen la transmisión y contribuir a limitar la propagación de la malaria.
